PLoS ONE: histon-deacetylasehæmmerne nedregulere Checkpoint kinase 1 Udtryk at inducere celledød i ikke-småcellet lungekræft Cells

Abstrakt

Baggrund

histondeacetylaseinhibitorer (HDAC-hæmmere) er lovende anticancer narkotika ; imidlertid de molekylære mekanismer, der fører til HDACi-induceret celledød er ikke blevet forstået, og ingen klar mekanisme af resistens er blevet belyst for at forklare begrænset effekt af HDAC-hæmmere i kliniske forsøg.

Metoder og resultater

Her viser vi, at proteinniveauer af checkpoint kinase 1 (Chk1), som har en afgørende rolle i G

2 cellecyklus checkpoint regulering, blev markant reduceret på proteinniveau og transkriptionelle niveauer i lungecancerceller behandlet med pan-og selektiv HDAC-hæmmere LBH589, scriptaid, valproat, apicidin, og MS-275. I HDACi behandlede celler Chk1 funktion blev nedskrevet som bestemt ved nedsat inhiberende phosphorylering af Cdc25C og dens nedstrømsmål cdc2 og forøget ekspression af Cdc25A og phosphoryleret histon H3, en markør for mitotisk post. I tidsforløb eksperimenter, Chk1 nedregulering skete efter HDACi behandling, forud apoptose. Ektopisk udtryk for Chk1 overvandt HDACi-induceret celledød, og forbehandling celler med cdc2 inhibitor purvalanol Et blokeret indrejse i mitose og forhindrede celledød ved HDAC-hæmmere. Endelig farmakologisk hæmning af Chk1 viste stærk synergistisk virkning med LBH589 i lunge kræftceller.

Konklusioner

Disse resultater definerer en vej, hvorigennem Chk1 hæmning kan mediere HDACi-induceret mitotisk indrejse og celledød og tyder på, at Chk1 kunne være en tidlig farmakodynamisk markør til at vurdere HDACi effekt i kliniske prøver

Henvisning:. Brazelle W, Kreahling JM, Gemmer J, Ma Y, karse WD, Haura E, et al. (2010) histon-deacetylasehæmmerne nedregulere Checkpoint kinase 1 Udtryk at inducere celledød i ikke-småcellet lungekræft Cells. PLoS ONE 5 (12): e14335. doi: 10,1371 /journal.pone.0014335

Redaktør: Rory Edward Morty, University of Giessen Lung Center, Tyskland

Modtaget: Juni 25, 2010; Accepteret: November 26, 2010; Udgivet: December 14, 2010

Copyright: © 2010 Brazelle et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev finansieret delvist af Moffitt cancer center SPORE tilskud i lungekræft. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

histondeacetylaseinhibitorer (HDACi) repræsenterer en lovende ny klasse af forbindelser til behandling af cancer [1]. Nogle HDAC-hæmmere viser bred aktivitet mod flere HDAC klasser (scriptaid, LBH589), mens andre er klasse-eller isotype selektiv (MS-275) [1], [2].

De præcise mekanismer, som HDACi udøve deres cytotoksiske virkninger er ukendte; imidlertid er antitumorvirkninger af disse lægemidler menes at skyldes hyperacetylering af histoner, demethylering af genomisk DNA, og aktivering af gener, der inhiberer proliferation og inducerer apoptose [1]. Ud over deres epigenetiske effekter, er HDAC-hæmmere også vist sig at have betydelige post-translationelle virkninger på ikke-histon-proteiner, herunder transkriptionsfaktorer p53, varme-shock protein 90 (HSP90), og α-tubulin [3]. Udover direkte anti-tumorfremkaldende virkninger, kan undertrykkelse af angiogenese ved HDAC-hæmmere også have en indvirkning på tumorvækst hæmning [4].

En væsentlig regulerende skridt for G

2 /M cellecyklus overgang i eukaryoter er aktivering af cdc2-cyclin B-komplekset [5]. Den korrekte regulering af cdc2 kræver et aktiverende phosphorylering på threonin-161 og hæmmende phosphoryleringer på threonin-14 og tyrosin-15 (Tyr15) [6]. Den inhiberende phosphorylering på Tyr15 fastholder cdc2-cyclin B-komplekset i en inaktiv tilstand, hvis der er ufuldstændigt replikeret DNA eller beskadiget DNA i cellen [7], [8]. Cdc2 aktivering via fjernelse af den hæmmende phosphorylering af CDC25 phosphataser tillader celler at indtaste den mitotiske fase af cellecyklussen [9]. Chk1 er en kritisk komponent af DNA-replikation, intra-S-fasen, G

2 /M-fase, og mitotiske spindel-assembly checkpoints [10]. Som svar på en række genotoksiske stressfaktorer, bliver Chk1 aktiveret ved opstrømskinaser såsom ATM og ATR, hvilket fører til øget proteosomal nedbrydning af fosfatase Cdc25A og inhibering af Cdc25C gennem serin-216 (Ser216) phosphorylering, kollektivt forårsager inaktivering af cdc2 og følgelig G

2 /M anholdelse [10] – [14].

Desuden kombinerer HDAC-hæmmere med regulatorer af G2 checkpoint kunne forbedre effektiviteten og støtte i at overvinde modstand. Faktisk har direkte farmakologisk inhibering eller siRNA knockdown af Chk1 vist sig at forårsage checkpoint abrogation, cytokinetic regression, og multinukleation samt kromosom missegregation og kromosomal ustabilitet [15]. Derfor Chk1 inhibitorer, som effektivt ophæve S og G

2 checkpoints, bliver undersøgt i kliniske forsøg, enten alene eller i kombination med cytotoksiske midler [16] – [18] og kunne kombineres effektivt med HDACi kan forbedre cytotoksiske virkninger .

Her viser vi, at HDACi behandling nedregulerer Chk1 protein udtryk, som igen fører til uplanlagt cdc2 aktivering, mitotisk indgang, og celledød i humane lunge kræftceller. Resultaterne af denne undersøgelse viser, at Chk1 nedregulering og ophævelse af G

2 checkpoint er vigtige lovgivningsmæssige skridt i følsomhed og modstandsdygtighed over for den cytotoksiske effekt af HDACi behandling i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler. Vores data tyder på, at Chk1 kunne være en tidlig farmakodynamisk markør til at forudsige og vurdere effekten af ​​HDAC-hæmmere og Chk1 hæmmere kan øge cytotoksiske virkninger af HDAC-hæmmere i kliniske studier.

Resultater

Behandling af NSCLC celler med HDAC-hæmmere forårsager G

2 /M cellecyklusstop og celledød

Tidligere undersøgelser har vist, at en pan-HDACi LBH589 (IC

50 på mellem ca. 9 og 54 nmol /l) forårsager vækst anholdelse og celledød i NSCLC-celler [19]. For at analysere de molekylære mekanismer, som HDACi regulere cellecyklusprogression og celledød, asynkront voksende A549 (EGFR vildtype, K-Ras mutant, og p53 vildtype) og PC9 (EGFR-mutant, K-ras vildtype, og p53 mutant) [20] – [22] celler blev behandlet med LBH589 (40 nM) i 24 timer og opsamles til flowcytometrisk analyse. Figur 1 viser, at LBH589 behandling i PC9 og A549-celler produceret en mærkbar stigning i cellerne i G

2 /M-fase antyder en G

2 /M blokade og en betydelig reduktion i S-fase celler. Disse resultater er i overensstemmelse med de tidligere rapporter, at HDAC-hæmmere føre til G

2 /M anholdelse og apoptotisk celledød i NSCLC celler [19].

En

, De asynkront voksende celler blev inkuberet i medium med 5% FCS i 24 timer i fravær (kontrol, C) eller nærvær (L) på LBH589. Procentdelen af ​​celler i forskellige faser af cellecyklussen blev bestemt ved flow-cytometrisk analyse.

B

, Histogram repræsentation af cellecyklus data bestemmes ved flowcytometrisk analyse.

Som illustreret i figur 2A, mikroskopisk undersøgelse af celler behandlet med LBH589 produceret en række forskellige nukleare morfologier, fra binucleation til multinukleation. Taget sammen viser disse data, at LBH589 behandling forårsager celledød forbundet med unormal mitose og mislykkedes cytokinese, hvilket antyder mitotisk katastrofe, en type af celledød, der forekommer under mitose og er tidligere blevet beskrevet i celler behandlet med HDACi Trichostatin A [ ,,,0],23].

A549-celler blev behandlet med vehikel (kontrol) eller 40 nM LBH589 i 24 timer.

En

, pile viser bi- eller flerkernede celler med nedsat cytokinese i LBH589 behandlet NSCLC celler.

B

, celler blev fikseret og farvet med DAPI eller spaltes poly (ADP-ribose) polymerase (cPARP) antistof (× 100 eller × 400 forstørrelse).

C

, Western blot-analyse viser, at HDAC hæmning af LBH589 forårsager histon H3 fosforylering (H3-P10), histon H4 acetylering (Acety-H4), og PARP spaltning (cPARP) i A549 celler behandlet med LBH589 for 24 timer. β-actin blev anvendt som indlæsning kontrol.

Eftersom celler i G kunne ikke diskrimineres

2- og M-fase på basis af deres forskelle i DNA-indhold ved flow-cytometrisk analyse testede vi hvorvidt celler arresteret i G

2 /M efter HDACi behandling indtaste mitotisk fase. Til dette formål vi først udført immunfluorescensfarvning ved anvendelse af antistof mod spaltede poly (ADP-ribose) polymerase (cPARP) og viste, at LBH589 behandling forårsager apoptotisk celledød i 78% af binucleated mitotiske celler (figur 2B). Dernæst i Western blot-analyse testede vi, om HDAC-inhibering forøger histon H3 phosphorylering ved serin-10, som finder sted ved begyndelsen af ​​mitose. Figur 2C illustrerer, at LBH589 behandling forårsagede histon H3 phosphorylering ledsaget af øget histonacetylering og PARP-spaltning, hvilket viser, at HDACi behandling forårsager NSCLC-celler til at indtaste mitose og undergå celledød. For at bestemme om cellevækst og ændringer levedygtighed observeret efter LBH589 behandling er en generaliseret effekt af HDAC hæmning, brugte vi også en anden pan-HDACi, scriptaid (1 uM), som producerede biokemiske ændringer skelnes fra de ovenfor nævnte, at bruge LBH589 (figur 3).

En

, A549, PC9, H1299, H292, H358, H441 og HCC827 celler blev dyrket i tilstedeværelse af køretøj (C), eller LBH589 (LBH) 40 nM i 24 timer og ekspressionsniveauer af cPARP, phosphorylering af Cdc2 (pCDC2

Y15), CHK1, og acetyleret histon H4 (acetyl-H4) blev bestemt ved Western blot og kvantificeret ved anvendelse AlphaEase software. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol.

B Salg, PC9 og A549-celler blev dyrket i nærvær af bærer (C), eller LBH589 (LBH) 40 nM, eller scriptaid (S) 1 uM i 24 timer og ekspressionsniveauer af cPARP, tyrosin-15 phosphorylering af Cdc2 (pCDC2

Y15), serin-216-phosphorylering af Cdc25C (pCDC25c

S216) Cdc25A (T-Cdc25A), Cdc25C (T-Cdc25C) og CDC2 (T-CDC2), acetyleret histon H4 ( acetyl-H4), og cyclin B1 blev bestemt ved Western blot analyse. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol.

C

, narkotika-medierede ændringer i ekspressionen af ​​CHK1, CHK2, AKT, og c-RAF blev bestemt ved Western blot analyse. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol.

D

, PC9 eller A549-celler blev behandlet med eller uden 40 nM LBH589 og analyseret for annexin-positive celler under anvendelse af BD Annexin V-FITC /7-AAD flowcytometri kit.

E

, A549-celler blev behandlet med MS-275 (MS), (500 nM), valproat (VA) (1 mM), eller apicidin (API) (400 nM) i 24 timer. Ekspressionsniveauer af cPARP, CHK1, pCDC2

Y15, og β-actin blev bestemt ved Western blot analyse. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange.

HDAC-inhibering resulterer i aktivering af CDC25 og cdc2-proteiner, der kræves til mitotisk entry

Aktivering af cdc2-proteinkinase ved cdc25-proteinet phosphataser er en central regulerende trin for G

2 /M overgang i eukaryoter [9]. Den dephosphorylering af Cdc25C på Ser216 øger sin aktivitet under M-faseovergang, hvilket fører til aktivering af cdc2-kinase [10]. For at undersøge om HDACi-induceret mitotisk post og celledød medieres ved aktivering af cdc25 /cdc2 pathway, PC9, A549, H1299, H292, H358, H441 og HCC827 celler blev behandlet med eller uden LBH589, og udførtes Western blot-analyse. Figur 3A viser HDACi behandling resulterede i forøgede niveauer af PARP-spaltning, et fald i inhibitorisk phosphorylering på cdc2 og 45-94% fald (baseret på kvantitativ Western blot-analyse) i alt Chk1 tværs af de 7 forskellige NSCLC cellelinjer, med A549s viser mest signifikant fald i Chk1 protein. Disse ændringer er alle forbundet med en stigning i histonacetylering. Yderligere undersøgelse af A549 og PC9 celler behandlet med pan HDAC-hæmmere (figur 3B), LBH589 og scriptaid viste aktivering af Cdc25C og cdc2, som vurderet ved et fald i deres hæmmende fosforylering på Ser216 og Tyr15 henholdsvis som var ledsaget af øget histon H4 acetylering. Nogen nedgang blev observeret i ekspressionsniveauerne af total Cdc25C og cdc2-proteiner (figur 3B). Disse resultater indikerer, at HDACi-induceret mitotisk entry medieres af øgede cdc25 /cdc2-aktivitet. Endvidere HDACi behandling også steget ekspressionsniveauet for Cdc25A, som er målrettet efter Chk1 for hurtig nedbrydning (figur 3B). Disse data viser, at i HDACi-behandlede celler, blev den biologiske funktion af Chk1 inhiberes.

Udover phosphorylering ved Tyr15 position, en anden stor mekanisme regulerer Cdc2 aktivitet og progression i mitotisk fasen af ​​cellens cyklus er dets komplekse formation med cyclin B, en nødvendig cofaktor for cdc2-kinase-aktivitet. Således har vi næste afgøres, om HDACi behandling påvirker cyclin B ekspressionsniveauerne. Som vist i figur 3B, NSCLC celler behandlet med LBH589 eller scriptaid vises højere samlede niveauer af cyclin B1 ekspression. Taget sammen med den formindskede Tyr15 phosphorylering af cdc2, dette fund medfører en høj cdc2-cyclin B-aktivitet i HDACi-behandlede celler, hvilket giver yderligere støtte, celler behandlet med HDAC-hæmmere er i stand til at indtaste mitose.

Inhibering af HDAC-aktivitet korrelerer med nedsat Chk1 udtryk i NSCLC celler

Rækkefølgen og troskab af cellecyklussen er knyttet til integritet Chk1 og cdc25 phosphatase veje. Vedligeholdelse af Chk1 /cdc25 vej er afgørende for celler til fremskridt normalt gennem en uforstyrret celledeling cyklus, og for celler til at arrestere som respons på kontrolpunkt aktivering [10].

For at fastlægge den rolle, Chk1 i HDACi-induceret aktivering af Cdc25C og cdc2 analyserede vi ændringer i niveauerne af Chk1 protein i celler behandlet med HDAC-hæmmere. Immunoblot analyse afslørede, at behandling med LBH589 eller scriptaid bevirker et signifikant fald i ekspressionen af ​​Chk1 protein (figur 3C). Denne inhibering synes at være specifik, idet ingen ændring blev observeret i ekspressionen af ​​Chk2 protein, en anden regulator af DNA-beskadigelse checkpoint signalvejen [10], [11].

HDAC-hæmmere, herunder LBH589, er blevet rapporteret til funktionelt inaktivere HSP90 gennem protein acetylering, hvilket fører til udtømning af de klient proteiner, såsom AKT og c-RAF [22]. Interessant nok har Chk1 protein også blevet rapporteret at være en HSP90 klient [24], [25], hvilket tyder på, at inaktivering af HSP90 af HDAC-hæmmere kan være ansvarlig for nedbrydningen af ​​Chk1 observeret i vores eksperimenter. For at teste denne mulighed, vi analyseret, om Chk1 nedregulering falder sammen med nedsat udtryk for AKT og c-RAF i ekstrakter fremstillet ud fra celler behandlet med LBH589 eller scriptaid. Som illustreret i figur 3C, sås ingen ændringer i ekspressionsniveauerne af AKT eller c-RAF proteiner på de betingelser, hvor LBH589 og scriptaid forårsaget Chk1 nedregulering.

For yderligere at demonstrere de cytotoksiske virkninger af HDACi behandling på NSCLC celler vi målte apoptotisk celledød under anvendelse Annexin V-detektion. Som vist i figur 3D viste PC9 og A549 celler en målt stigning i mængden af ​​annexin positive celler indikerer, at behandling med HDACi resulterer i betydelig stigning i celler undergår apoptose.

For at bestemme om selektive HDAC-hæmmere også forårsage Chk1 hæmning blev A549 og PC9 celler behandlet med MS-275, som selektivt hæmmer HDAC1, og i mindre omfang HDAC3. Som illustreret i figur 3E, MS-275 (0,5 uM) producerede ændringer i ekspressionen af ​​Chk1, phosphoryleret cdc2 (Tyr15), og cPARP ligner resultaterne observeret med LBH589 og scriptaid. To andre klasse I HDACi valproinsyre (1 mM) og apicidin (400 nM) producerede også identiske resultater (figur 3e). Disse data viser, at HDACi-medieret Chk1 nedregulering er ikke narkomaner og klasse I HDAC’er er sandsynlige mediatorer af HDACi effekt på Chk1 nedregulering i NSCLC celler.

Chk1 ophævelsen forud initiering af apoptose ved LBH589

Chk1 er blevet rapporteret at være genstand for caspase-medieret nedbrydning i celler, der undergår apoptotisk celledød [26]. Derfor analyserede vi i tidsforløbet eksperimenter, om nedregulering af Chk1 protein observeret i HDACi-behandlede celler er årsag eller konsekvens af apoptotisk celledød. Som vist i figur 4A, behandling af A549-celler med LBH589 førte til et fald i Chk1 protein 70% inden for 1 time af behandlingen, baseret på kvantificering af western blots, som blev ledsaget af nedsat phospho-Cdc25C (Ser216) og phospho-cdc2 ( Tyr15) niveauer i overensstemmelse med funktionel inaktivering af Chk1 aktivitet. Af betydning, forekom disse ændringer, inden påviselig caspaseaktivering, hvilket fremgår af PARP-spaltning, som først blev observeret ved 12 timers behandling. En lignende tidsforløb profil blev observeret i PC9 celler behandlet med LBH589 eller scriptaid (data ikke vist).

A549-celler var ubehandlede eller behandlet med LBH589 (40 nM) for forskellige tidspunkter. Cellelysater blev forberedt, og protein ekspressionsniveauer af cPARP, CHK1, Tyr15 fosforylering af pCDC2 (pCDC2

Y15), Ser216 phosphorylering af Cdc25C (pCDC25

S216) acetyl-H4, og cyklin B1 blev bestemt.

B

, Kvantitativ Chk1 mRNA-ekspression analyse. Totalt RNA blev fremstillet fra A549-celler efter 24 timers behandling med 40 nM LBH589 eller vehikel. mRNA ekspressionsniveauer blev kvantificeret under anvendelse af realtids-PCR-analyse. Alle resultater blev normaliseret til GAPDH mRNA-niveauer, og de gennemsnitlige og standardafvigelser værdier fra fire uafhængige forsøg er vist.

C

, ektopisk udtryk for Chk1 vender HDACi-induceret apoptose men ikke histonacetylering. A549-celler blev transient transficeret med en tom vektor (kontrol) eller GFP- eller FLAG-mærket (GFP-CHK1 eller FLAG-CHK1) Chk1 ekspressionsplasmid. Otteogfyrre timer efter transfektion blev celler dyrket uden (kontrol, C) eller med LBH589 (L) (40 nM) i yderligere 24 time før høst for Western blot-analyse. Behandlingsrelaterede inducerede ændringer i cPARP, acetyl-H4, phospho-CDC2

Y15 og ektopisk udtrykte GFP-CHK1 eller FLAG-CHK1 proteiner blev bestemt ved Western blot analyse. p-actin-ekspression blev anvendt som indlæsning kontrol. Forsøg blev gentaget 3 gange, og et repræsentativt eksperiment er vist. Pilene viser placeringen af ​​GFP-CHK1 og FLAG-CHK1 proteiner.

D

, i ubearbejdet NSCLC patientprøver, Chk1 protein nedregulering korrelerer med øget cPARP

ex vivo

. Tumorprøver blev opsamlet med en 23-gauge nål fra patient-afledte tumorer, og celler blev behandlet i duplikat med vehikel (kontrol) eller LBH589 (40 nM) i 18 timer. Efter behandling blev adhærente og ikke-adhærente celler poolet, celleekstrakter blev fremstillet, og ekspressionsniveauer af cPARP, Chk1, og acetyl-H3 blev analyseret ved Western blot. p-actin-ekspression blev anvendt som indlæsning kontrol. SCC: planocellulært karcinom; AC:.. Adenocarcinom

Kollektivt, disse resultater understøtter en model, hvor hæmning af Chk1 udtryk ved HDAC-hæmmere fører til celledød via uforudset aktivering af mitose-fremmende kinase cdc2 i NSCLC celler

HDACi behandling fører til den transkriptionelle nedregulering af Chk1

for at bestemme om HDACi behandling regulerer Chk1 udtryk på det transskriptionelle niveau i NSCLC celler, vi udførte real-time PCR. Som illustreret i figur 4B, kvantitativ RNA analyse afslørede mere end en 50% reduktion i Chk1-mRNA-niveauer i A549-celler 24 timer efter LBH589 (40 nM) behandling. Dette fund viser, at HDACi behandling fører til transkriptionelle undertrykkelse af Chk1 i NSCLC celler.

Ektopisk udtryk for Chk1 overvinder LBH589-induceret apoptose

For at bestemme betydningen af ​​Chk1 nedregulering i HDACi-induceret apoptotisk celle død, vi havde til formål at afgøre, om ektopisk udtryk for Chk1 kan overvinde celledød udløst af LBH589. Derfor blev A549-celler transient transficeret med en Chk1 plasmid, der koder en GFP-mærket Chk1 fusionsprotein. Som vist i figur 4C, forbigående ekspression af ektopisk Chk1 protein undertrykt LBH589-induceret apoptose, som påvist ved PARP-protein spaltning. Derudover er der i celler, der udtrykker ektopisk Chk1, LBH589 behandling undladt at aktivere cdc2, som vurderet af Tyr15 dephosphorylering (figur 4C), mens der sås ingen ændringer i HDACi-induceret histonacetylering. Lignende data blev opnået med et Flag-tagget Chk1 ekspressionsplasmidet i NSCLC-celler (figur 4C). Disse resultater indikerer, at Chk1 nedregulering spiller en væsentlig rolle i HDACi-medieret celledød.

Chk1 nedregulering korrelerer med apoptotisk celledød i primære NSCLC celler behandlet med LBH589

ex vivo

for at verificere nedregulering af Chk1 i klinisk relevante tumorprøver blev tumorceller indsamlet fra NSCLC patient tumorer behandlet ex vivo med LBH589. Totale proteiner blev ekstraheret, og lægemiddel-medierede ændringer i ekspressionen af ​​Chk1, histonacetylering, og PARP-spaltning blev analyseret ved Western blot. Som illustreret i figur 4D, ex vivo-behandling af celler med LBH589 (40 nM) forårsagede øget histon H4 acetylering i alle tumorprøver, hvorimod, LBH589 behandling øget PARP spaltning i kun 2 af 5 prøver, som nøje korrelerer med Chk1 nedregulering. Disse resultater understøtter resultaterne præsenteret ovenfor med NSCLC cellelinjer og at nedsat Chk1 og phospho-cdc2 (Tyr15) niveauer kan være følsomme farmakodynamiske markører for HDACi effekt i patientens tumor prøver at forudsige og vurdere patientens respons på HDACi behandling i kliniske undersøgelser.

HDACi-medieret celledød kræver mitotiske post

De viste data over støtte en model, hvor svigt af Chk1-medieret checkpoint aktivering spiller en væsentlig rolle i HDACi-medieret celledød. Således har vi hypotesen, at blokade af mitotisk post ville formindske følsomheden af ​​cancerceller over for de cytotoksiske virkninger af HDACi behandling. For at teste denne hypotese blev A549-celler forbehandlet med en potent cdc2 inhibitor, purvalanol A [27], for at blokere indtræden i mitose. Flowcytometrisk analyse illustrerer, at 40 nM LBH589 i 24 timer medførte en betydelig forøgelse af celler i G

2 /M og en cirka 20-dobling af sub-G

1 top (hypodiploid celler) efter 24 timers behandling, i overensstemmelse med forøget celledød. Stigningen i sub-G

1 befolkning efter LBH589 behandling blev imidlertid væsentligt reduceret ved forbehandling af celler med purvalanol A (figur 5), hvilket indikerer, at mitotisk blokade forårsager resistens over for de cytotoksiske virkninger af LBH589. For at bekræfte denne observation, udførte vi western blot-analyse med ekstrakter fremstillet fra A549-celler udsat for LBH589 med eller uden purvalanol A forbehandling. Figur 5 illustrerer, at purvalanol En forbehandling inhiberet LBH589-induceret apoptotisk celledød som målt ved cPARP, hvilket giver yderligere støtte, HDACi-induceret celledød kræver stort set trådt i mitose.

Celler behandlet med LBH589 40 nM med eller uden purA (10 uM) forbehandling blev analyseret ved flowcytometri for cellecyklusfordeling eller ved Western blot for at bestemme drug-medierede ændringer i cPARP. β-actin blev anvendt som en loading kontrol.

HDAC og Chk1 hæmmere viser en synergistisk virkning i NSCLC-celler

Vores resultater viste, at HDACi behandlingsmål Chk1 at inducere upassende mitotisk post og derved udøver sine cytotoksiske virkninger på tumorceller. Den formindskede følsomhed celler til HDACi behandling observeret i A549 celler ektopisk udtrykker Chk1 (figur 4C) antyder, at aktivering af Chk1 og dens downstream signalvej, der styrer G

2 check point, kan forårsage resistens over for HDACi terapi. Således er det sandsynligt, at Chk1 inhibitorer kan potensere cytotoksiske virkninger af HDAC-hæmmere i tumorceller, der er resistente over for HDAC-hæmmere. For at teste denne mulighed blev A549-celler behandlet med LBH589 og en Chk1 inhibitor (UCN-01) i 24 timer. 6A viser, at ved lave koncentrationer, kan hverken LBH589 (4 nM) eller UCN-01 (250 nM) alene forårsage PARP spaltning i A549 celler, mens kombinationen af ​​disse to lægemidler drastisk øget PARP protein spaltning, hvilket tyder på en potentiel synergi. For at underbygge den synergistiske samspil mellem HDAC og Chk1 hæmmere, vi næste udført median dosis effekt analyse. Til dette formål blev A549-celler udsat for stigende koncentrationer af LBH589, UCN-01 eller kombinationen af ​​disse lægemidler i et fast forhold. Cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse CT-Blå assay, og effekten blev analyseret ved anvendelse median virkning analyse. Som vist i figur 6B og 6C, eksponering af celler for kombinationen af ​​LBH589 og Chk1 inhibitorer udøvede en stærk synergistisk virkning. Ved anvendelse af disse samme metoder, blev en synergistisk vekselvirkning også ses mellem LBH589 og en hidtil ukendt Chk1 inhibitor AZD7762 [28] i NSCLC-celler, der resulterede i en CI-værdi på 0,76 indikerer en moderat synergistisk virkning (data ikke vist).

a

, A549-celler blev behandlet med LBH589 40 nM og /eller en UCN-01 (250 nM) i 24 timer blev celleekstrakter fremstillet, og Western blot-analyse blev udført med PARP (t: total, c: spaltet). Forsøg blev gentaget mindst 3 gange, og et repræsentativt eksperiment er vist.

B

, A549-celler blev behandlet med LBH589 og UCN-01, enten alene eller i kombination ved et konstant forhold (1:40) i 72 timer. Lægemiddelkoncentrationer er angivet på den vandrette akse og afbildet mod cellelevedygtighed af kontrolbrønde, der arbitrært var sat til 100% levedygtighed for hvert forsøg. Fejl- søjler repræsenterer ± SD af 4 replikatbrønde.

C

, kombinerede virkninger af LBH589 og Chk1 inhibitor UCN-01 blev kvantificeret med Chou og Talalay kombinationsindeks (Cl) metode (40). CI anvendes til lægemiddelkombinationen analyser blev bestemt ved isobologram-ligningen (se tekst). Placering symboler (+/-) angiver gennemsnitlige beregnede Chou og Talalay kombination index (CI) område (+++, stærk synergi).

De data præsenteret ovenfor antyder, at narkotika hæmme aktiviteten af ​​proteiner, negativt regulere funktionen af ​​cdc2-cyclin B-komplekset kan forøge G

2 checkpoint ophævelsen og cytotoksiske virkninger af HDAC-hæmmere i tumorceller.

Discussion

Tidligere undersøgelser har vist, at HDACi-induceret celledød forbundet med afvigende mitose og sprængning af cellecykluskontrolpunkter [29] – [34]. Imidlertid er de molekylære mekanismer, som HDACi behandling fører til mitotisk celledød ikke godt forstået. Her viste vi, at HDACi behandling af humane NSCLC celler fører til nedregulering af de samlede Chk1 protein niveauer. Vi viste, at denne nedregulering er biologisk relevant ved demonstrere et samtidigt fald i niveauerne af den inhiberende phosphorylering af nøgle cellecyklus-regulerende proteiner Cdc25C og cdc2. De reducerede niveauer af total Chk1 protein forud induktion af apoptose og histonacetylering, viser, at Chk1 nedregulering er en tidlig begivenhed i HDACi virkemåde, og at det spiller en central rolle i narkotika-medieret celledød.

Chk1 udtryk har vist sig at svinge under cellecyklussen [35]. Men da Chk1 hovedsagelig udtrykkes ved S til M-fasen af ​​cellens cyklus på både RNA- og proteinniveau [35], er det usandsynligt, at HDACi-medieret inhibering af Chk1 er en konsekvens af vækststandsning i G

2 /M-fasen. RT-PCT forsøg viste, at transkriptionel inhibering af Chk1 spiller en vigtig rolle i HDACi-medieret regulering af Chk1 protein. Den mekanisme, hvorved HDACi regulere transkriptionelle ekspression af Chk1 er ukendt og mangler at blive belyst.

Behandling af tumorceller med pan HDAC-hæmmere er blevet rapporteret at forårsage acetylering af Hsp90 gennem hæmning af HDAC6 og udtømning af flere Hsp90 klient proteiner, herunder AKT og c-RAF [22], [36], [37]. Vores resultater viste, at under de betingelser, hvor LBH589 inducerede Chk1 nedregulering blev ingen inhibition observeret i ekspressionsniveauerne af AKT og c-RAF. Desuden selektive HDAC-hæmmere valproat, apicidin og MS-275 med ingen kendte hæmmende effekt på HDAC6 kunne hæmme Chk1 udtryk. Tilsammen disse resultater antyder, at hæmning af Chk1 udtryk i HDACi-behandlede celler sandsynligvis ikke medieret af inaktivering af HSP90 protein, men er snarere skyldes undertrykkelse af CHK1 udtryk.

En af de store udfordringer i udviklingen af HDAC-hæmmere er definitionen af ​​de klinisk relevante endepunkter til at vurdere drug effekt i patientens tumorer i den tidlige fase af behandlingen til at forudsige det kliniske resultat. I den foreliggende undersøgelse viste vi, at nedregulering af total Chk1 proteinniveauer korrelerer meget stærkere med induktion af cytotoksiske virkning snarere end med histon hyperacetylering i begge cellelinier og i primære NSCLC celler opnået fra tumorer patientgrupper ex vivo. Sammen disse resultater tyder på, at nedregulering af Chk1 og Tyr15 phosphorylering af cdc2 niveauer kan være følsomme og klinisk relevante farmakodynamiske markører for effekten af ​​HDAC-hæmmere.

På trods af deres løfte som en ny kræftbehandling, i kliniske forsøg, effektiviteten af HDAC-hæmmere har været begrænset, og ingen klar mekanisme af resistens er blevet klarlagt [1]. Vores nuværende resultater giver en mulig indsigt i mekanismen for HDACi handling og modstand. Vi viste, at ektopisk ekspression af Chk1 og forebyggelse af mitotiske post ved en cdc2 inhibitor purvalanol en formindsket LBH589-induceret celledød. Disse resultater antyder, at niveauet af Chk1 ekspression eller aktivering status af enzymer regulerer indgang M-fase, såsom Cdc25 og cdc2-cyclin B-komplekset, kan spille en vigtig rolle i fastlæggelsen følsomhed eller resistens af tumorceller til HDAC-hæmmere. De data, der præsenteres her foreslå en model, hvor mitotisk post er en nødvendig skridt for HDACi-medieret celledød. Derudover ville cellulære mekanismer, der blokerer Chk1 nedregulering og /eller bypass Chk1 og direkte handle på G

2 checkpoint kontrol for at forhindre celler i at komme ind mitotisk fase forårsage resistens mod HDAC-hæmmere. For eksempel har Chk1 vist sig at blive kraftigt udtrykt i NSCLC tumorer [38], der kan give resistens mod HDACi-induceret mitotisk post og celledød. Således i tumorer med forøget Chk1 aktivitet, rationelle kombinationer af HDAC-hæmmere med lægemidler, der samtidigt inhiberer Chk1 og dens downstream signalveje kontrollerer G

2 /M cellecyklus checkpoint kan forstærke de cytotoksiske virkninger af HDAC-hæmmere.

HDAC-hæmmere har vist sig at virke synergistisk med DNA-beskadigende midler [1]. Men de molekylære mekanismer i denne synergi er ikke godt forstået.