PLoS ONE: Validering af en Multiplex allel-specifikke polymerasekædereaktion Assay til påvisning af KRAS genmutationer i formalinfikserede, paraffinindlejrede Væv fra tarmkræft Patienter

Abstrakt

Baggrund

Patienter med

KRAS

mutationer ikke reagerer på epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) hæmmere og undlader at drage fordel af adjuverende kemoterapi. Mutation analyse af

KRAS

er nødvendig før behandling med monoklonale anti-EGFR-antistoffer hos patienter med metastatisk kolorektal cancer (mCRC). Formålet med denne undersøgelse er at udvikle en multiplex allel-specifik PCR (MAS-PCR) assay til at detektere

KRAS

mutationer.

Metoder

Vi har udviklet et enkelt rør MAS-PCR analyse til påvisning af syv

KRAS

mutationer (G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, og G13D). Vi udførte MAS-PCR assay analyse for

KRAS

på DNA isoleret fra 270 formalin-fikseret paraffinindlejrede (FFPE) kolorektal cancer væv. Sekvenser af alle 270 prøver blev bestemt ved pyrosekventering. Syv kendte point-mutation DNA-prøver fortyndet med vildtype-DNA blev analyseret for at bestemme begrænsning af påvisning og reproducerbarhed af MAS-PCR-analysen.

Resultater

Samlet set resultaterne af MAS PCR assay var i god overensstemmelse med pyrosekventering, og kun syv disharmoniske prøver blev fundet. MAS-PCR assay reproducerbart detekterede 1 til 2% mutante alleler. De mest almindelige mutationer var G13D i codon 13 (49,17%), G12D (25,83%) og G12V (12,50%) i codon 12.

Konklusion

MAS-PCR-analysen giver en hurtig , omkostningseffektiv og pålidelig diagnostisk værktøj til nøjagtig detektering af

KRAS

mutationer i rutinemæssige FFPE kolorektal cancer væv

Henvisning:. Seekhuntod S, Thavarungkul P, Chaichanawongsaroj N (2016) Validering af en multiplex allel-specifikke polymerasekædereaktion Assay til påvisning af

KRAS

genmutationer i formalinfikserede, paraffinindlejrede Væv fra kolorektal cancer patienter. PLoS ONE 11 (1): e0147672. doi: 10,1371 /journal.pone.0147672

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

Modtaget 31. oktober, 2015; Accepteret: 6 januar 2016; Udgivet: 26 Jan 2016

Copyright: © 2016 Seekhuntod et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. SS blev støttet af 90-årsdagen for Chulalongkorn fond (Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, GCUGR1125572134), og NC blev støttet af fakultetet for Allied Health Sciences Fund 2014 (AHS-CU 58004). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er den mest almindelige cancer og den tredje hyppigste årsag til kræft dødsfald i verden [1]. I Thailand, CRC er den tredje mest almindelige kræftform blandt mænd og den femte mest almindelige blandt kvinder [2, 3]. En af de store molekylære veje i CRC udvikling er induktion af en aktiverende mutation i protoonkogen

KRAS

(Kirsten rotte sarkom viral onkogen) [4, 5].

KRAS

gen er et medlem af

RAS Salg genfamilie og koder for et 21-kDa RAS-protein, som er en nedstrøms GTP-bindende protein i epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) signal transduktion pathway. De onkogene former af

KRAS

mutationer udtrykker konstitutivt aktive RAS protein fører til øget celledeling, celleproliferation, forebyggelse af apoptose proces, induktion af angiogenese og forøget metastase [6]. For nylig er cancerterapier blevet udviklet under anvendelse af monoklonale antistoffer, herunder cetuximab og panitumumab, at målrette EGFR [7, 8]. Disse midler er designet til at blokere ligand-induceret EGFR-tyrosinkinaseinhibitoren aktivering og dermed inhibere nedstrøms signalering [9]. Men kun CRC med vildtype

KRAS

proto-onkogen reagerer på anti-EGFR-antistoffer behandling, hvorimod ingen terapeutisk respons forekommer i CRC med

KRAS

mutationer [9-11]. Det Europæiske Selskab for Medicinsk Onkologi og American Society of Clinical Oncology har etableret store onkologiske retningslinjer at disse antistoffer begrænses til patienter med

KRAS

vildtype tarmkræft [12, 13]. Derfor påvisning af

KRAS

genmutationer har afgørende klinisk relevans for udvikling af individualiserede patient terapeutiske strategier [7].

Adskillige molekylære metoder er blevet udviklet til påvisning af

KRAS

mutationer. Disse metoder omfatter direkte sekventering [10], real-time PCR [11], høj opløsning smeltning (HRM) [14], amplifikation ildfast mutation systemet polymerasekædereaktion [15, 16], pyrosekventering [17, 18], co-amplifikation ved lavere denatureringstemperatur PCR [19], mutant-beriget PCR [20], og digital PCR [21]. Desuden flere kommercielle molekylære kits er almindeligt tilgængelige for

KRAS

mutation påvisning, herunder cobas

® KRAS Mutation Test [22], 3D-Gene

® KRAS mutation assay kit, TheraScreen

® KRAS RGQ PCR Kit [23], EntroGen s KRAS Mutation Analyse Kit til Real-Time PCR [23], og KRAS PyroMark Q96 V2.0 Kit [24]. Men alle disse metoder kræver teknisk ekspertise og specialiseret udstyr og instrumenter, og er for dyrt som prognostiske og diagnostiske værktøjer til kræftpatienter i udviklingslandene. Derimod Multiplex allelspecifik polymerasekædereaktion (MAS-PCR) er en enkel, pålidelig og billig fremgangsmåde til påvisning af kendte mutationer og enkeltnukleotidpolymorfi [25, 26]. MAS-PCR er kendetegnet ved primere med en allel-specifik 3′-terminus, som annealer specifikt til muteret eller vildtype-DNA-template kun [26, 27]. Vildtype- og allelspecifikke primere genererer forskellige størrelse PCR-produkter tillader let påvisning af en kendt genmutation.

I denne undersøgelse har vi udviklet en MAS-PCR-assay til analyse af mutations status

KRAS

codon 12 og 13. Enkelte nukleotid punktmutationer i

KRAS

gen forekommer hyppigst i codon 12 og 13 tegner sig for 80 til 82% og 15 til 17% af mutationerne, henholdsvis [28-31 ]. Mutationer i andre positioner, såsom codon 61, 117, 146 og 154, er langt mindre hyppige beløb sig til ca. 1% af alle

KRAS

genmutationer [17, 32]. I denne undersøgelse, tilstedeværelse af de mest almindelige punktmutationer i kodon 12 og 13, som er G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, og G13D [18, 30, 32, 33], blev vurderet i formalin-fikseret, paraffinindlejrede vævsprøver fra 270 CRC patienter. Pyrosequencing, en robust og følsom metode, blev brugt som en referencemetode til at sammenligne følsomheden af ​​MAS-PCR analyse til påvisning af

KRAS

mutant alleler.

Materialer og Metoder

Udarbejdelse af kliniske prøver

formalin-fikseret, blev paraffinindlejrede kolorektale adenokarcinomer fra 270 patienter med CRC indsamlet fra Patologisk Institut, Ministeriet for Folkesundhed, Bangkok, Thailand. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité for Patologisk Institut (IOP-KM-R57-007). Den etiske komité frafaldes behovet for samtykke, fordi data fra vævsprøver blev analyseret anonymt og rapporteres. En erfaren patolog revideret og markerede adenocarcinom områder af hematoxylin og eosin farves dias. Tumorer var manuelt mikro-dissekeret fra paraffinindlejrede blokke, og 10 um tykke snit blev opsamlet i et 1,5 ml rør. Paraffin blev fjernet fra vævet blokke med xylen, og prøver blev lufttørret. DNA blev ekstraheret fra prøverne og oprenset ved anvendelse af et QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. DNA mængde blev bestemt ved NanoDrop spektrofotometri (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE).

PCR-amplifikation og Pyrosequencing

Pyrosequencing til analyse af en

KRAS

genfragment spænder codon 12 og 13 blev udført som beskrevet tidligere med nogle modifikationer [18]. Sekvenser af primere blev beskrevet tidligere [18]. Reaktionsbetingelser med 1 uM fremadrettet primer (5′-GGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3 ‘), biotinyleret reverse primer (5′-biotin-TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3’), og 50 til 100 ng /pl DNA-template gav et 82-bp produkt. Reaktioner blev udført i 1 x PCR-buffer indeholdende 2,5 mM MgCl

2, 0,2 mM dNTP (Biolabs, England), og 0,625 U Amplitag Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems, USA) i en 30 pi totalvolumen. PCR-betingelserne var et denatureringstrin ved 95 ° C i 10 min, derefter 1 minut ved 95 ° C, 1 min ved 55 ° C, 1 min ved 72 ° C i 35 cykler, efterfulgt af 7 minutter ved 72 ° C. PCR-produkter blev bekræftet ved 8% polyacrylamidgelelektroforese ved 140 V i 40 min, og gelerne blev farvet med SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (1: 400, Lonza, USA) i 30 min. PCR-produkterne blev sekventeret ved hjælp af pyrosekventering PyroMark Gold Q96 reagens (Qiagen, Tyskland). PCR-produkter i 30 pi blev blandet med 3 pi streptavidin-konjugerede Sepharose-perler (Streptavidin Sepharose HP, Amersham Biosciences AB, Sverige), 40 pi bindingsbuffer og 17 pi destilleret vand efterfulgt af omrystning ved 1400 rpm i 10 min. De immobiliserede biotinylerede PCR-produkter: streptavidin-konjugeret Sepharose perler komplekser blev indfanget med et vakuum prep værktøj. Enkeltstrenget DNA oprensning blev opnået ved 1x vask vakuum prep værktøj sekventielt med 70% ethanol i 5 s, denaturering opløsning i 5 s, og vaskebuffer i 10 s. Biotinyleret enkeltstrenget DNA blev tilsat til en 96-brønds mikrotiterplade, der indeholdt 40 pi 0,4 uM sekventering PF1-primer (5′-TGTGGTAGTTGG AGCTG-3 ‘) til analyse ved nukleotiderne 35 og 38 positioner, og PF2-primer (5 ‘-TGTGGTAGTTGGAGCT-3’) til analyse i nukleotid 34 position [18]. Pladen blev inkuberet ved 80 ° C i 2 minutter, efterfulgt af afkøling til stuetemperatur i 5 min, og lastes på PyroMark Q96 ID-system (Qiagen, Tyskland).

DNA Cloning

Genomisk DNA af otte kliniske prøver huser

KRAS

vildtype DNA og syv punktmutationer i

KRAS

codon 12 og 13 (G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, og G13D) blev udsat for PCR-amplifikation ved hjælp universelle

KRAS

primere (K-

ras

-codon 12/13-F 5′-CTG GTG GAG TAT TTG ATA GTG TAT T-3 ‘og K-

ras

-codon 12/13-R 5′-ATC TGT ATC AAA GAA TGG TCC TG-3 ‘). Alle 259-bp PCR-produkter blev klonet ind psc-A-amp /can vektor og transformeret til kompetent

Escherichia coli

celler ved hjælp af en Strataclone PCR kloning kit (Agilent Technologies, USA). De transformerede bakterier blev spredt ud på selektive LB-agarplader (Oxoid, USA) med ampicillin og X-Gal (Promega, USA). Efter inkubation natten over ved 37 ° C blev hvide kolonier tilfældigt udvalgt og dyrket i LB-medium natten over. Plasmider blev ekstraheret ved anvendelse af Wizard

® genomisk DNA oprensningskit (Geneaid, Taipei, Taiwan) og efterfølgende screenet for insert fragment ved PCR. Positiv PCR-produkter blev sekventeret ved Bioneer Corporation, Daejeon, Sydkorea.

Primer Design

allel-specifik (AS) primere blev designet til hver af syv mutationer, og en mutation-uspecifik region blev anvendt som reference amplicon. Det 3 ‘terminal bunden af ​​hver AS primer blev vedtaget i henhold til dens tilsvarende mutation. Amplification reaktioner blev udført med de vigtigste

KRAS

fremad primer og fem AS primere (G12R-F, G12C-F, G12D-F, G12A-F, og G13D-F) deler med én fælles antisense

KRAS

revers primer, og reaktioner med to AS-primere (G12S-R og G12V-R) deling med en sund fornuft

KRAS

fremad primer (figur 1). Sekvenser af primerne anvendt i denne undersøgelse er anført i tabel 1. Alle primere blev syntetiseret og leveret af BioDesign Co, Ltd (BioDesign, Pathumthani, Thailand).

Positionerne af primerne er illustreret. Som primere har samme fremadrettede primer eller revers primer. Optrukne pile angiver den forreste og reverse primere. Det 3 ‘terminal bunden af ​​hver AS primere blev tilpasset i henhold til dens tilsvarende mutation, og er fed og understreget. Kodoner og muterede baser er understreget.