PLoS ONE: Deregulering mellem miR-29b /c og DNMT3A er forbundet med epigenetisk inaktivering af CDH1 Gene, påvirker Cell Migration og Invasion i Gastric Cancer

Abstrakt

de-regulering af miR-29 familie og DNA methyltransferase 3A (DNMT3A) er forbundet med gastrisk cancer (GC). Mens stigende beviser indikerer miR-29b /c kunne regulere DNA methylering ved at målrette DNMT3A, er det i øjeblikket ukendt, hvis epigenetisk inaktivering af miR-29b /c via promotor hypermethylering i GC er forårsaget af unormal udtryk for DNMT3A. Således har vi til formål at vurdere, om der krydstale regulering mellem MIR-29b /c og DNMT3A og om det er forbundet med en malign fænotype i GC. Første, sårheling og Transwell assays viste, at MIR-29b /c undertrykker tumor metastase i GC. En luciferase reporter assay viste, at DNMT3A er et direkte mål for miR-29b /c. Vi brugte bisulfit genomisk sekventering til at analysere status DNA methylering af miR-29b /c. Procentdelen af ​​denatureret CpG’er blev signifikant reduceret i DNMT3A-udtømte celler sammenlignet med kontrollerne. Endvidere blev inddragelsen af ​​DNMT3A at fremme GC cellemigrering forbundet med promotoren methylering-medieret repression af CDH1. I 50 parrede kliniske GC vævsprøver, nedsat MIR-29b /c var signifikant korreleret med graden af ​​differentiering og invasion af cellerne og var negativt korreleret med DNMT3A ekspression. Sammen vores foreløbige resultater tyder på, at følgende proces kan være involveret i GC tumorigenese. MIR-29b /c undertrykker nedstrøms gen DNMT3A, og til gengæld er MIR-29b /c undertrykt af DNMT3A i en DNA methylering-afhængig måde. De-regulering af begge MIR-29b /c og DNMT3A fører til epigenetisk inaktivering af CDH1 og bidrager til metastaser fænotype i GC. Dette fund viser, at DNA-methylering-associeret inaktivering af MIR-29b /c er kritisk for GC udvikling og kan således være et terapeutisk mål

Henvisning:. Cui H, Wang L, Gong P, Zhao C, Zhang S , Zhang K, et al. (2015) Deregulering mellem miR-29b /c og DNMT3A er forbundet med epigenetisk inaktivering af CDH1 Gene, påvirker Cell Migration og Invasion i Gastric Cancer. PLoS ONE 10 (4): e0123926. doi: 10,1371 /journal.pone.0123926

Academic Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, UNITED STATES

Modtaget: September 4, 2014 Accepteret: 9 mar 2015; Udgivet 15. april, 2015

Copyright: © 2015 Cui et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81.171.915, No. 91.229.107 og nr 81.472.548), http: //www .nsfc.gov.cn /. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er den anden mest fatale malignitet på verdensplan. Den tegner sig for i alt ca. 1 million nye tilfælde og 0,7 millioner dødsfald om året, over 70% af der opstår i udviklingslande, især i østasiatiske lande [1]. Selvom helbredes, hvis de opdages tidligt, er de fleste GC patienter diagnosticeret med sent stadium sygdom. For patienter med operabel sygdom, er konventionel kirurgi og kombination kemoterapier angivet. Men den samlede 5-års overlevelsesraten for GC patienter, mindre end 30% [1, 2]. Især er GC ofte ledsaget af peritoneal formidling og metastase til regionale lymfeknuder og fjernere organer gennem lymfe og venøse skibe [3]. Således identificerer molekylære afvigelser i GC kan forbedre vores forståelse af gastrisk carcinogenese og hjælpe os inddele patienterne i biologisk og klinisk relevante undergrupper, samt udvikle nye terapeutiske strategier.

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af endogen, lille, ikke-kodende regulatoriske RNA’er på ca. 20-25 nukleotider, der negativt regulerer genekspression ved inhibering oversættelse eller inducere mRNA nedbrydning gennem baseparring med den 3′-utranslaterede region (3’UTR) af mål-messenger-RNA’er (mRNA’er) [4]. Ændrede ekspressionsniveauer af miRNA er blevet rapporteret i mange cancertyper og resultere i afvigende ekspression af målgener, der påvirker ondartet adfærd, såsom proliferation, modstandsdygtighed over for apoptose og metastase [5-7]. Stigende beviser for, at deregulerede miRNA (f.eks MIR-17, MIR-129, MIR-148a, og MIR-378) bidrager til gastrisk carcinogenese [8-10], som indikerer, at miRNA kan anvendes som diagnostiske og prognostiske biomarkører i GC .

MIR-29 familie (MIR-29s) er en konserveret familie af miRNA, der omfatter miR-29a /b /c. Nedsat ekspression af MIR-29s er blevet beskrevet i flere cancertyper, herunder GC [11-14]. Tidligere undersøgelser viser, at MIR-29s spiller en dominerende rolle i GC celleproliferation, cellecyklusprogression, apoptose, og celle motilitet [14, 15]. Potentielle mål for MIR-29s, der bidrager til den maligne GC fænotype omfatter Cdc42, CCND2, og MMP2 [14, 15]. Desuden har nogle undersøgelser identificeret MIR-29s som bidragydere til regulering af DNA methylering ved at målrette DNMT3s i lungekræft [13]. Endvidere har flere målgener, såsom THC-1, CDK6, laminin-1, og MCL-1, også blevet rapporteret i andre cancer [16]. Især trods dokumentation for miRNA-29s kan fungere som tumor-suppressor gener, et centralt spørgsmål vedrørende miRNA-29s udtryk stadig delvist uløst. Hvad er de mekanismer til kontrol af miRNA-29s udtryk i GC celler? Det er blevet rapporteret, at c-Myc er involveret i MIR-29a /b undertrykkelse [17]. Identificere yderligere suppression mekanismer er af interesse.

Det er kendt, at den transkriptionelle inaktivering af tumorsuppressorgener (GTS) af CpG island hypermethylering er en fælles kendetegn for carcinogenese. Interessant nok ligner proteinkodende GTS, et betydeligt antal miRNA reguleres af promotoren methylering [18-20]. Faktisk har der været et stigende antal undersøgelser viser, at tumor suppressor miRNA, såsom MIR-34b, MIR-129, og MIR-124, ofte er tavse af DNA-methylering i GC [21-23]. Baseret på CpG Island Searcher program analyse, viste vores forudsigelse om, at miRNA-29b /c indeholder CpG øer i deres formodede promotorområder. Imidlertid er det endnu ikke klart, om afvigende DNA hypermethylering tegner sig for den dysregulering af MIR-29b /c. Derudover, er det uvist, om der findes et feedback-regulering mellem MIR-29b /c og DNMT3s. Faktisk har ingen tidligere studie undersøgte status methylering af miR-29b /ci GC celler, og ingen har udforsket forholdet mellem methylering af miR-29b /c og niveauer af ekspression af DNMT3s. I denne undersøgelse fandt vi, at MIR-29b /c undertrykt ekspression af DNMT3A ved at målrette dens 3’UTR, som bidrog til inhibering GC cellemigration og invasion. På den anden side, DNMT3A nedreguleres MIR-29b /c via afvigende hypermethylering af promotoren. Der eksisterer således et potentielt tilbagekoblingssløjfe mellem MIR-29b /c og DNMT3A, hvori nedregulering af MIR-29b /c ophæver undertrykkelse af DNMT3A. I mellemtiden er den opregulering af DNMT3A påvirker ekspressionen af ​​MIR-29b /c ved promotor-methylering. Disse resultater tyder på en cross-talk mellem miR-29b /c og DNMT3A. Deres ubalance og deregulering er grund af en epigenetisk mekanisme, der kan være involveret i GC celle migration og invasion karakteristika.

Materialer og Metoder

Cell kultur

GC-cellelinjer, herunder AGS og BGC-823, blev opnået fra Cell Bank of Chinese Academy of Science og vedligeholdes i RPMI-1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 E /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) i en fugtig inkubator med en CO 5%

2 atmosfære ved 37 ° C.

Vævsprøver

50 par GC væv og deres tilstødende ikke-kræft vævsprøver blev indsamlet mellem 2011 og 2013 fra Jiangning Hospital i Nanjing. Den kliniske information af patienterne med GC, er vist i S1 tabel. Undersøgelsen blev godkendt af Udvalget for etisk gennemgang af forskning på Jiangning Hospital i Nanjing i Kina, og patienterne underskrevet informeret samtykke formularer. Alle vævsprøver blev opnået fra patienter med GC. De blev opsamlet under kirurgi og umiddelbart lynfrosset i flydende nitrogen indtil RNA og protein ekstraktion.

revers transkriptionsreaktion og kvantitativ real-time PCR (qPCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra cellerne og væv høstet ved anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens anvisninger.

for at detektere miRNA ekspression, en hårnåle-RT-PCR blev udført som tidligere beskrevet [24], og U6 små RNA’er var anvendt som en intern kontrol. qPCR blev udført under anvendelse SYBR Premix Ex Taq (Takara, Dalian, Kina) ifølge fabrikantens protokol. Den relative ekspression blev vurderet ved den sammenlignende CT metode. Primersekvenserne af hvert gen er vist i S2 tabel.

Western blot-

Western blots blev udført ved anvendelse af anti-DNMT3A (Abcam, Cambridge, UK), anti-CDH1 (Abcam, Cambridge, UK), anti-vimentin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) og anti-

β

actin antistoffer (Sigma, Ronkonkoma, NY, USA), og detektion blev udført med Super Signal kemiluminescens-substrat (Pierce, Rockford, IL, USA).

transfektion

mIR-29b /c efterligner /hæmmere og negativ kontrol molekyler (scramble kontrol efterligner og inhibitor) blev syntetiseret og renset af GenePharma Company (Shanghai, Kina). Sekvenserne er vist i S2 tabel. De blev transficeret ind i cellerne i en slutkoncentration på 50 nM under anvendelse af lipofectamin 2000 transfektionsreagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) ifølge producentens protokol. Mediet blev skiftet efter 6 timer. Cellerne blev dyrket i 48 timer og høstet til analyse. Den procent transfektionseffektiviteten blev bestemt ved en evaluering af indholdet af miR-29b /c udtryk eller knockdown efter transfektioner (S1A og S1B Fig). Protokollen for oprettelse af DNMT3A stabile Knockdown celler er blevet beskrevet i vores tidligere arbejde [25]. Udtrykket af DNMT3A dramatisk faldt i BGC-shDNTM3A og AGS-shDNTM3A celler (S1c Fig) sammenlignet med kontrol celler.

sårheling, migration og invasion analyser

Cell mobilitet blev udsat for sårhelingen assay-analyse som beskrevet tidligere [26]. En ridse sår blev frembragt under anvendelse af en 200 pi pipettespids på konfluente cellemonolag i seks-brønds plader. Cellerne blev derefter vasket med frisk medium for at fjerne flydende celler, og blev observeret en spredning af sårlukning efter 48 timer og fotograferet under et mikroskop. Potentialet for migration og invasion af de transficerede celler blev evalueret af en Transwell assay. Cellerne blev dyrket til 70% konfluens og transficeret i 24 timer med de MIR-29b /c efterligner eller kontrol efterligner, og MIR-29b /c-inhibitor eller kontrol inhibitor. I migration assay blev cellerne dyrket i 200 ml medium med 1% føtalt bovint serum i det øvre kammer af et ikke-belagt transwell insert. I det nedre kammer, blev 600 ml medium med 10% føtalt bovint serum anvendes som en kemoattraktant for at fremme cellemigration. I invasionen assayet blev det øvre kammer af Transwell skær overtrukket med 50 ml 1,0 mg /ml Matrigel, og cellerne blev udpladet i det øverste kammer i Matrigelcoatede transwell indsats (Millipore, USA). Efter 24 timers inkubation blev de ikke-migrerende eller ikke-invaderende celler forsigtigt fjernes med en vatpind. Alle cellerne blev farvet under anvendelse af 0,1% krystalviolet farvning og talt i 5 felter under et inverteret mikroskop. De uafhængige forsøg blev gentaget tre gange.

bisulfit genomisk sekventering (BGS)

Genomisk DNA blev ekstraheret fra celler ved anvendelse af phenol-chloroform-metoden. Bisulfitbehandling blev udført ved CpGenome Universal DNA Modification Kit (Millipore, USA) ifølge producentens anvisninger. PCR-produkter til bisulfit sekventering blev gel-oprenset og subklonet ind i en pMD19-T-vektor-system (Takara, Dalian, Kina). Mindst ti kolonier blev sekventeret for at vurdere graden af ​​methylering ved hvert CpG site. Primerne er opført i S2 tabel.

Luciferase reporter assay

Protokollen for luciferase reporter analysen er blevet beskrevet tidligere [14]. 3’UTR af human DNMT3A blev PCR-amplificeret og klonet ind mellem Not I- og Xba I-stederne i PGL-3 (Promega, USA). De BGC-823-celler blev udpladet ved en densitet på 5 x 10

5 per brønd i en plade med 12 brønde før transfektionerne. Cellerne blev transficeret med PGL-3 ildflueluciferase reportere (1 pg per brønd), pRL-TK (50 ng per brønd) og MIR-29 efterligner /inhibitor (50 nM) eller negative kontrol efterligner /inhibitorer (50 nM) under anvendelse Lipofectamine- 2000 transfektionsreagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) ifølge producentens protokol. Luciferaseaktivitet blev testet 48 timer efter transfektion under anvendelse af Dual-Luciferase Activity Assay System (Promega, USA). Alle forsøgene blev udført som tre uafhængige gentagelser.

Statistisk analyse

Den uafhængige Students

t

-test blev brugt til at sammenligne resultaterne, der udtrykkes som middelværdien ± sd mellem to forudvalgte grupper. For at bestemme sammenhænge mellem variablerne,

Pearson

‘s korrelationskoefficient blev beregnet. En

P

-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

miR-29b /c er nødvendig og tilstrækkelig til GC celle migration

tidligere undersøgelser indebærer, at mIR-29b /c er kritisk for GC celleinvasion. For yderligere at evaluere, om MIR-29b /c er ansvarlig for GC cellemigrering, en

in vitro

scratch sårheling assay og Transwell assay blev udført. Efter transient transfektion af MIR-29b /c efterligner eller negativ kontrol i BGC-823 celler, sårhelingen assay viste, at cellerne med den tvungne ekspression af MIR-29b /c udviste en bemærkelsesværdigt langsommere helbredelse sammenlignet med kontrolcellerne (Fig 1A). Ligeledes viste Transwell migration analysen, at overekspression af miR-29b /c var forbundet med betydeligt mindre migration end kontrollerne (

P

0,05, figur 1B). Øvrigt i overensstemmelse med andre data i HGC-207 og MGC-803 GC celler [14], MIR-29b /c overekspression celler afslørede også en betydelig reduktion i invasiv evne i Matrigel invasion assay (

P

0,05, figur 1E og Fig 1F). Tilsammen indikerer disse resultater, at MIR-29b /C effektivt ophævet GC cellemigrering og invasion, som derfor bidraget til de tidlige stadier af den maligne progression af GC.

(A) Sårheling assays af de sammenflydende lag af negative kontrolprøver efterligner eller mIR-29b /c efterligner-transficerede BGC-823 celler. Billeder blev erhvervet til 0 og 48 timer efter sårede. (B og C) Repræsentative billeder (øvre) og søjlediagrammer (nederst) skildrer migration (B) og invasion (C) evne BGC-823 celler efter 48 timers transfektion af negative kontrol efterligner eller miR-29b /c efterligner (*

P

0,05). (D) sårheling analyser på de sammenflydende lag af negative kontrol inhibitorer eller miR-29b /c-hæmmere-transficeret BGC-823 celler. Billeder blev erhvervet til 0 og 48 timer efter sårede. (E og F) Repræsentative billeder (øvre) og søjlediagrammer (nederst) skildrer migration (E) og invasion (F) evne BGC-823 celler efter 48 timers transfektion af negative kontrol hæmmere eller miR-29b /c-hæmmere (*

P

0,05). Antal celler, som vandrede eller invaderet blev talt i fem felter. Migrationen og invasion rate er repræsenteret som celletal pr felt.

DNMT3A er en direkte transkriptionel mål for miR-29b /c i GC

For at forstå den mekanisme bag effekten af miR-29b /c på celle migration og invasion, vi undersøgte målene i miR-29b /c. DNMT3A 3’UTR supplerer miR-29b /c og er et direkte mål gen af ​​miR-29b /c, så vi foretaget en reporter assay i BGC-823 celler. Den DNMT3A mRNA 3’UTR blev indsat i den nedstrøms region af et luciferasereportergen fra PGL-3-vektoren (dvs. DNMT3A 3’UTR-Luc). Konstruktionerne blev derefter cotransficeret med pRL-TK og miR-29b /c efterligner eller den negative kontrol efterligner ind i BGC-823 celler. Som vist i figur 2A, blev den relative luciferaseaktivitet signifikant reduceret i de PGL-3 vektorer med DNMT3A 3’UTR (

P

0,05). Men konstruktionerne cotransficeret med den MIR-29b /C-hæmmeren ikke påvirke luciferaseaktiviteten af ​​PGL-3 vektorer med DNMT3A 3’UTR sammenlignet med konstruktionerne cotransficeret med den negative kontrol-inhibitor (fig 2B). For yderligere at validere denne miRNA-target interaktion, blev kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) og western blots udført for at bekræfte reguleringen af ​​DNMT3A af miR-29b /c. Vi kortvarigt transficeret MIR-29b /c efterligner eller negativ kontrol efterligner i BGC-823 celler. Den øgede MIR-29b /c reducerede DNMT3A ekspression på mRNA (Fig 2C) og proteinniveauer (fig 2E, lane1-3). Omvendt miR-29b /c nedregulering ved sin hæmmer øget DNMT3A udtryk på mRNA (Fig 2D) og protein niveauer (Fig 2E, lane4-6). Tilsammen indikerer disse resultater, at DNMT3A er en direkte transkriptionel mål for MIR-29b /c og er negativt forbundet med MIR-29b /c-ekspression i GC-celler.

(A og B) Virkninger af MIR-29b /c på den transkriptionelle aktivitet af DNMT3A detekteret ved luciferase assay. 3’UTR af DNMT3A blev klonet ind i pGL3-basisk luciferase reporter vektor (DNMT3A 3’UTR-Luc), som blev co-transficeret med MIR-29b /c efterligner eller negative kontrol efterligner (A), eller MIR-29b /c inhibitorer eller negative kontrolprøver inhibitorer (B) ind i BGC-823-celler og analyseret for luciferaseaktivitet. Ildflueluciferase værdier var normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet afledt pRL-TK og afbildet som relativ luciferaseaktivitet (*

P

0,05). Resultaterne er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse. af mindst tre uafhængige forsøg. (C og D) QRT-PCR-analyse af DNMT3A relative ekspression i BGC-823-celler transficeret med MIR-29b /c efterligner (C) /inhibitorer (D) eller negativ kontrol-oligonukleotid (*

P

0,05). (E) Western blot-analyse af DNMT3A ekspression i BGC-823-celler transficeret med MIR-29b /c efterligner (bane 1, 2, 3) /inhibitorer (bane 4, 5, 6) eller negativ kontrol-oligonukleotid.

β

actin blev anvendt som en loading kontrol. Bandet intensiteter blev kvantificeret og normaliseret til

β

actin intensiteter med ImageJ software.

miR-29b /c undertrykkes af DNMT3A i en DNA methylering-afhængig måde

Da afvigende hypermethylering er kritisk for miRNA nedregulering, vi spekuleret på, at der eksisterer negativ feedback mellem mIR-29b /c og DNMT3A. For at teste denne hypotese blev tilstedeværelsen af ​​CpG ø metylering i MIR-29b /c promotorregion evalueret af en BGS analyse i DNMT3A-knockdown celler. Som vist i fig 3A, 7 individuelle CpG sites inden CpG øområder (5 kb opstrøms af MIR-29b /c) blev sekventeret for at identificere methylerede cytosinrester. Hyppigheden af ​​miR-29b /c promotor methylering i DNMT3A-knockdown celler var 34,2%, hvilket var betydeligt lavere end de kontrol-celler (58,6%, Fig 3B). Dette resultat viser, at det transkriptionelle inaktivering af MIR-29b /c i GC-celler er associeret med tilstedeværelsen af ​​CpG island hypermethylering, hvilket blev bekræftet ved måling modne MIR-29b /c ved QRT-PCR. Der var signifikant forøget miR-29b /c udtryk i den årlige vækstundersøgelse-shDNMT3A og BGC-shDNMT3A celler sammenlignet med deres kontroller (fig 3C). Disse fund indikerer et vigtigt molekylære basis for miR29-b /c nedregulering og understøtter den hypotese, at der er krydstale mellem MIR-29b /c og DNMT3A.

(A og B) Kortlægning af methylering status af individuelle CpG sites i miR-29b /c-promotor fra BGS assay i BGC-kontrol og BGC-shDNTM3A celler. De regioner, der spænder over CpG øen med 7 bindingssteder for CpG blev analyseret. Sorte cirkler repræsenterer methylerede CpG stedet; hvide cirkler repræsenterer den methyleret CpG site. Hver række repræsenterer bisulfit sekventering af MIR-29b /c-promotor for en enkelt analyseret tilfældig klon. (C) QRT-PCR-analyse af miR-29b /c udtryk i både AGS og BGC-823 DNMT3A-knockdown celler.

DNMT3A fremmer GC cellemigration

Den molekylære forbindelse mellem miR-29b /c og DNMT3A rejste spørgsmålet om DNMT3A involvering i GC celle migration. Vi yderligere anvendt

in vitro

analyser til at bestemme de funktionelle ændringer i celle adfærd efter ændret udtryk for DNMT3A. Den sårhelende assay viste en særlig langsommere bedring i BGC-shDNMT3A celler sammenlignet med kontrolcellerne (figur 4A, Top), men kun en beskeden stigning i de AGS-shDNMT3A celler sammenlignet med kontrolcellerne (figur 4A, nederst). Disse resultater indikerer, at DNMT3A er vigtig for celle mobilitet. Eftersom celleadhæsionsmolekyler er vigtige for cellemotilitet, blev ekspressionen af ​​CDH1 og vimentin undersøgt ved QRT-PCR og western blot. Knockdown af DNMT3A udtryk steget markant den CDH1 udtryk på både mRNA og protein niveauer, men havde ikke en bemærkelsesværdig effekt på ekspressionen af ​​vimentin (Fig 4B og 4C), hvilket tyder på, at CDH1 kan være et mål for DNMT3A-medieret dysregulering af celle motilitet. Derudover har vi foretaget en BGS analyse på CDH1 genet i DNMT3A-knockdown celler. Som vist i fig 4D, procentdelen af ​​methylerede CpG’er placeret inden CDH1 var lavere i DNMT3A-depleterede celler end i kontrolcellerne (35,8% vs. 94,1%). Disse resultater viser, at den unormale ekspression af DNMT3A fører til en epigenetisk inaktivering af CDH1.

(A) Cell migratioin satser DNTM3A knockdown BGC eller AGS celler blev sammenlignet med styring via sårhelende assays. Mikroskopisk observation blev registreret ved 0 og 48 timer efter at ridse overfladen af ​​et konfluerende lag af celler. (B og C) QRT-PCR (B) og western blot (C) analyse af CDH1 eller vimentin udtryk i DNMT3A-knockdown BGC-823 celler.

β

actin blev anvendt som en loading kontrol. (D) Kortlægning af status methylering af individuelle CpG steder i CDH1 promotor ved BGS assay (Venstre) og søjlediagrammer, der viser de CDH1 promoter methylering satser i BGC-kontrol og BGC-shDNTM3A celler (til højre). Regionerne, der spænder over CpG øen med 17 CpG sites blev analyseret. Sorte cirkler repræsenterer methylerede CpG sites; hvide cirkler repræsenterer ikke-methylerede CpG-steder. Hver række repræsenterer bisulfit sekventering af CDH1 promotor for en enkelt analyseret tilfældig klon. (E og F) QRT-PCR (E) og western blot (F) analyse af CDH1 eller vimentin Expresion i BGC-823 celler efter miR-29b /c efterligner eller negativ kontrol efterligner 48 timers transfektion (**

P

0,01).

β

actin blev anvendt som en loading kontrol. (G) Bar grafer, der afbilder CDH1 promoter methylering satser i BGC-823 celler efter miR-29b /c efterligner eller negativ kontrol efterligner 48 timers transfektion. Regionerne, der spænder over CpG øen med 17 CpG sites blev analyseret.

miR-29b /c er involveret i undertrykkelsen af ​​CDH1

For yderligere at undersøge effekten af ​​ændrede miR-29b /c udtryk på CDH1, vi forbigående transficeret mIR-29b /c efterligner eller negativ kontrol efterligne i BGC-823 celler. Sammenlignet med kontrollerne, tvungen ekspressionen af ​​miR-29b /c signifikant forøget ekspression af CDH1 på både mRNA og protein niveauer (Fig 4E og 4F). Efterfølgende blev status for methylering af promotorregionen af ​​CDH1 undersøgt under anvendelse af en BGS assay, Mir-29b /c efterligner eller negativ kontrol efterligner transient transficeret BGC-823 celler. Resultaterne viste, at hyppigheden af ​​CDH1 promotor methylering i miR-29b /c overekspression celler var 5,2% eller 12,9%, hvilket var betydeligt lavere end det niveau, målt i kontrol celler (88,2%, fig 4G). Disse data var i overensstemmelse med det resultat, at DNMT3A knockdown medierer opregulering af CDH1 og viser, at deregulering af MIR-29b /c og DNMT3A er involveret i GC cellemigrering og invasion.

Reduceret ekspression af miR-29b og miR-29c i GC væv

udtryk for miR-29b /c i 50 GC tumorer og parret ikke-tumorvæv blev undersøgt ved QRT-PCR. Sammenlignet med de parrede ikke-tumorvæv, hyppigheden af ​​MIR-29b og MIR-29c nedregulering (defineret som en større end to gange fald) var 66% (33/50) og 60% (30/50), (fig 5A og 5B). Den gennemsnitlige fold skift af miR-29b og miR-29c var signifikant lavere i tumorvæv end i de ikke-tumorvæv (

P

0,01, figur 5C og 5D). At udforske klinisk-patologisk betydning af miR-29b og miR-29c udtryk mønstre i GC tumorigenese, blev analyseret de kliniske funktioner i GC patienter. Alle de 43 patienter analyseret blev kategoriseret i to grupper efter miR-29b og miR-29c ekspressionsniveauerne. Nedsat MIR-29b stærkt korreleret med graden af ​​tumor celledifferentiering og invasion, mens faldet MIR-29c kun korreleret med tumorinvasion (tabel 1). Desuden blev forholdet mellem MIR-29b /c-ekspression og DNMT3A ekspression testet i 33 GC tilfælde. En forening undersøgelse viste, at DNMT3A udtryk negativt var korreleret med miR-29b (

R

= -0,640,

P

0,01, figur 5E) og miR-29c (

R

= -0,349,

P

0,05, figur 5F). Tilsammen indikerer disse data, at MIR-29b /c kan spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​gastrisk carcinogenese.

(A og B) QRT-PCR-analyse, der viser MIR-29b (A) eller MIR-29c ( B) i 50 GC væv (T) og parrede ikke-tumorvæv (N). Kliniske prøver blev opdelt i tre grupper baseret på miRNA relative udtryk scoringer større eller mindre end to gange: N T, N = T og N T. Sagen nummer vises i hver gruppe. (C og D) Scatter plot af MIR-29b (C) eller MIR-29c (D) fold ændringer i GC og deres parrede ikke-tumorvæv. I begge paneler, de vandrette linjer repræsenterer medianen og de lodrette stænger, der repræsenterer intervallet af data (**

P

0,01). (E og F) Sammenhæng mellem DNMT3A og miR-29b (E) eller miR-29c (F) udtryk i 33 kliniske prøver, med lineær regression linjer og Pearson korrelation betydning (miR-29b: R = -0,640; **

P

0,01; miR-29c:. R = -0,349; *

P

0,05; Pearson

χ2

test)

diskussion

konserverede mIR-29 familien, herunder mIR-29a, mIR-29b og mIR-29c, er impliceret i flere kælder processer, såsom proliferation, differentiering, apoptose og metastase, hvilket gør dem en godt analyseret familie af miRNA i tumorigenese [16]. Tidligere undersøgelser har vist, at forøget ekspression af MIR-29a er forbundet med bedre overordnede overlevelsesrater i stadie II tyktarmskræft patienter [27] og lavere niveauer af MIR-29b kunne fremme prostatacancer metastaser ved at regulere epitel-mesenkymale overgang signalveje [28] . Desuden MIR-29c fungerer som en metastase suppressor der inhiberer lungecancer celleadhæsion til den ekstracellulære matrix og migration

in vitro

in vivo

[29]. I GC, væsentligt reduceret niveauer af miR-29b og miR-29c i særdeleshed er blevet observeret i forhold til miR-29a [14], hvilket tyder på, at miR-29b /c kan spille en større rolle. Således blev MIR-29b /c udvalgt til analyse i dette studie. I den foreliggende undersøgelse viste vi en øget MIR-29b /c undertrykker migration og invasion af BGC-823-celler under anvendelse af en sårhelende assay og et Transwell assay. Disse resultater er i overensstemmelse med andre rapporterede data fra SGC-7901, HGC-27 og MGC-803 GC celler [14, 15]. I betragtning af, at miR-29b /c også spille roller i proliferation og apoptose i GC, vi vurderede evne cellevækst og niveauerne af celle apoptose i BGC-823 celler. Resultaterne viste, at der ikke er forskel i spredning på 48 timer for miR-29b /c efterligner eller inhibitorer-transfekterede celler, sammenlignet med de negative kontrol celler (

P

0,05, S2A og S2B Fig). Endvidere Annexin-V-farvning viste ingen dramatisk stigning i niveauet af apoptose i Mir-29b /c efterligner-transficerede celler efter 48 timers inkubation (S2C Fig). Desuden cellecyklus-analyse viste ingen signifikante forskelle i G1, S, G2 /M-faser efter behandling med MIR-29b /c efterligner eller negative kontrol efterligner i 48 timer (

P

0,05, S2D fig). Disse data tyder på, at miR-29b /c forsinker sår område opsving på 48 timer primært på grund af de reducerede celle motilitet evner.

miRNA udøve deres funktioner hovedsageligt ved at målrette de 3’UTRs af forskellige gener. Imidlertid er de detaljerede molekylære mekanismer i MIR-29b /c relateret til malign GC udvikling dårligt forstået. Især miR-29b /c deler samme komplementaritet til steder i 3’UTR af DNMT3A, som blev forudsagt af mål forudsigelse programmer, herunder Targetscan, Miranda og miRBase. Det vides endnu ikke, om MIR-29b /c regulerer unormal metylering af gener associeret med metastase ved interaktion med DNMT3A under udviklingen af ​​GC. Derfor udførte vi en luciferase reporter assay og fandt, at en høj DNMT3A ekspression blev forbundet med lav MIR-29b /c-ekspression i GC-celler, hvilket indikerer DNMT3A er en direkte transkriptionel mål for MIR-29b /c. Men den molekylære basis, der fører til ubalance af MIR-29b /ci GC fortsat ukendt. miR-29 proksimale initiativtagere har bindingssteder for flere transkriptionsfaktorer, såsom c-myc, og CEBPA, som bidrager til deregulering af MIR-29s [30, 31]. Men er ikke blevet rapporteret forskning om epigenetisk regulering af miRNA-29s.

I eukaryote celler, der er tre enzymatisk aktive DNA methyltransferaser (DNMTs), DNMT1, DNMT3A og DNMT3B. Ekspressionen af ​​DNMT3A i GC er betydeligt højere end for DNMT3B [32, 33]. Desuden er kun steget DNMT3A udtryk signifikant associeret med en kortere sygdomsfri overlevelse periode i GC [34], hvilket indikerer DNMT3A spiller mere vigtige roller i gastrisk carcinogenese. af tre uafhængige forsøg.