PLoS ONE: Checkpoint Signaling, Base Excision Reparation, og PARP Fremme overlevelse for tyktarmskræft celler behandlet med 5-fluorodeoxyuridin men ikke 5-Fluorouracil

Abstrakt

fluoropyrimidiner 5-fluorouracil (5-FU) og FdUrd (5-fluorodeoxyuridin, floxuridin) er rygraden i kemoterapi for tyktarmskræft og andre tumorer. På trods af deres udbredte anvendelse, er det fortsat uklart, hvordan disse midler dræber tumorceller. Her har vi analyseret de checkpoint og DNA reparation veje, der påvirker colon tumor respons til 5-FU og FdUrd. Disse undersøgelser viser, at både FdUrd og 5-FU aktivere ATR og ATM checkpoint signalveje, hvilket indikerer, at de forårsager genotoksisk skade. Især imidlertid, udtømning af ATM eller ATR ikke sensibiliserer coloncancerceller til 5-FU, mens disse checkpoint pathways fremmer overlevelsen af ​​celler behandlet med FdUrd, hvilket antyder, at FdUrd udøver cytotoksicitet ved at forstyrre DNA-replikation og /eller inducere DNA-skade, hvorimod 5-FU ikke. Vi fandt også, at deaktivere base excision (BER) reparation vej ved at udtømme XRCC1 eller APE1 sensibiliserede tyktarmskræft celler til FdUrd men ikke 5-FU. I overensstemmelse med en rolle for BER vej, viser vi, at små molekyle poly (ADP-ribose) polymerase 1/2 (PARP) inhibitorer, AZD2281 og ABT-888, bemærkelsesværdigt sensibiliserede både mismatch repair (MMR) -proficient og deficiente tyktarmskræft cellelinier til FdUrd men ikke til 5-FU. Tilsammen disse undersøgelser viser, at rollerne for genotoxin-induceret checkpoint signalering og DNA-reparation adskiller sig væsentligt for disse midler, og også foreslå en ny tilgang til tyktarmskræft terapi, hvor FdUrd er kombineret med et lille molekyle PARP-hæmmer.

Henvisning: Geng L, Huehls AM, Wagner JM, Huntoon CJ, Karnitz LM (2011) Checkpoint Signaling, Base Excision Reparation, og PARP Fremme overlevelse for tyktarmskræft celler behandlet med 5-fluorodeoxyuridin men ikke 5-fluorouracil. PLoS ONE 6 (12): e28862. doi: 10,1371 /journal.pone.0028862

Redaktør: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: August 2, 2011; Accepteret: November 16, 2011; Udgivet: 15 December, 2011

Copyright: © 2011 Geng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Tilskud R01-CA084321 (LK), P50-CA136393 (LK), GT32-M072474 (AH), en Mayo Clinic Eagles Pilotprojekt Award, og Mayo Clinic. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

5-fluoruracil har aktivitet i multiple cancere og er en af ​​de mest udbredte foreskrevne anticancermidler, men dens hyppigste anvendelse er i tyktarmskræft, hvor det er grundlaget for alle moderne coloncancer terapier. Efter optagelse i celler, 5-FU undergår komplekse metaboliske reaktioner (figur 1A; rev i [1]..) For at fremstille 3 kendte cytotoksiske metabolitter: FUTP (5-fluoruridin triphosphat), FdUMP (5-deoxyuridinmonophosphat), og FdUTP ( 5-deoxyuridin-triphosphat). Den FUTP påvirker RNA stofskifte efter inkorporering i cellulære RNA, hvor det forstyrrer snRNA, tRNA, og rRNA behandling samt ribonucleolytic aktivitet exosomet og pseudouridylation af RNA [2] – [8].

( A) Metabolisme af 5-FU og FdUrd. (B, C) HT29 (B) og HCT-8 (C) -celler blev behandlet med 5-FU (80 uM, HT29-celler; 200 uM HCT-8-celler), FdUrd (40 pM for begge cellelinier), eller 10 mM hydroxyurinstof (HU) for de angivne tider. Celleekstrakter blev blottet for phospho-Ser317-Chk1 (P-Chk1), phospho-Thr68-Chk2 (P-Chk2), Chk1, eller Chk2. TS, thymidylatsyntase; TP, thymidinphosphorylase; OP, uridinphosphorylase; UK, uridin kinase; OPRT, orotat phosphoribosyltransferase; RR, ribonukleotidreduktase; FUR, 5-fluoruridin; FUMP, 5-fluoruridin monophosphat; FUDP, 5-fluoruridin diphosphat; FUTP, 5-fluoruridin triphosphat; FdUMP, 5-fluorodeoxyuridin monophosphat; FdUDP, 5-fluorodeoxyuridin diphosphat; FdUTP, 5-fluorodeoxyuridin trifosfat.

I modsætning hertil FdUMP og FdUTP forstyrre DNA stofskifte. Disse metabolitter dannes efter omdannelsen af ​​5-FU til FdUrd (5-fluordeoxyuridin, floxuridin), som også er en FDA-godkendt kemoterapi middel til behandling af coloncancer [9] og er ofte anset for at have en lignende virkningsmekanisme som 5-FU. FdUrd er derefter phosphoryleres til FdUMP og længere phosphoryleret til FdUTP [1]. Den FdUMP hæmmer thymidylatsyntase (TS), som forhindrer omdannelsen af ​​dUMP til dTMP, i sidste ende forårsager udtømning af dTTP, ophobning af dUTP, og afbrydelsen af ​​dNTP nøgletal. I modsætning hertil FdUTP, samt den akkumulerede dUTP, er inkorporeret i DNA

I overensstemmelse med deres evner til at forstyrre dNTP niveauer, både FdUrd og 5-FU aktivere ATR checkpoint signalvejen [10] -. [17 ], en sti, der udløses, når DNA-replikation hæmmes, og at også spiller kritiske roller i at fremme overlevelsen af ​​celler oplever replikation belastningen fra dNTP forstyrrelser og /eller DNA-læsioner [18]. Når den er aktiveret, ATR phosphorylerer multiple substrater, herunder Chk1. De kollektive kinase aktiviteter ATR og Chk1 iscenesætte S-fasen checkpoint og regulere DNA-reparation til at fremme cellernes levedygtighed og inddrivelse [19]. Derudover 5-FU og FdUrd også forårsage dobbeltstrenget DNA pauser [20], [21], som igen aktiverer ATM checkpoint signalvejen. ATM pathway regulerer også celleoverlevelse ved enten at inducere apoptose eller forebyggelse cellecyklusprogression og aktivering DNA-reparation, som begge fremmer overlevelse [22]. Især er det imidlertid fortsat uklart, om ATR og /eller ATM checkpoint pathways spiller vigtige roller i bestemmelse af overlevelse af humane coloncancer-celler, de celler, der er mål for 5-FU og FdUrd i patienter, når de behandles med disse midler .

uracil og 5-FU, som er inkorporeret i genomet er også anerkendt af 2 DNA-reparationsveje som kan spille roller i overlevelsen af ​​celler behandlet med 5-FU og FdUrd. En pathway er base excision reparation (BER) pathway [1], [23]. I denne vej, genomisk indarbejdet uracil og 5-FU er først anerkendt af uracil glycosylaser, som punktafgifter læsionen, hvilket efterlader et abasisk sted. Det abasiske sted behandles yderligere ved en endonuklease (fx APE1), hvilket skaber en enkeltstrenget DNA pause, der genkendes af poly (ADP-ribose) polymerase, som poly (ADPribosyl) ater selv samt andre reparationsproteiner, rekruttere XRCC1 og andre proteiner, som fuldstændig reparation [24]. Undersøgelser af den rolle, BER i celler behandlet med 5-FU eller FdUrd har nået forskellige konklusioner anvendelse af en lang række modelsystemer. Da disse undersøgelser har vist, at deaktivering BER beskytter, sensibiliserer eller har ingen virkning på cytotoksiciteten induceret af 5-FU og FdUrd i disse forskellige systemer, herunder mus [17], [23], [25] – [35], det er uklart, hvad der eventuelt rolle BER spiller i overlevelsen af ​​tyktarmskræft celler udsat for 5-FU eller FdUrd.

den anden impliceret reparation pathway er mismatch repair (MMR) system.

In vitro

undersøgelser har fundet, at MMR-vejen kan fjerne 5-FU fra kunstige substrater indeholder 5-FU: G mispairs. Især dog studier i celler tyder på, at MMR spiller kun en mindre rolle i excision af 5-FU læsioner i genomet [35]. Analyser af virkningerne af MMR-vejen på cellelevedygtighed efter behandling med 5-FU og FdUrd har generelt angivet, at celler med defekte MMR er mere modstandsdygtige over for 5-FU og FdUrd [10], [36] – [38], et resultat overensstemmelse med konstateringen af, at MFR-defekte tyktarmskræft patienter ikke gavn af 5-FU-behandling [39].

i betragtning af de mange virkningsmekanismer af 5-FU og FdUrd og den brede vifte af eksperimentelle systemer, der anvendes i disse undersøgelser (herunder studier i mus cellelinjer og i humane cellelinjer afledt af tumorer, der ikke typisk behandlet med 5-FU eller FdUrd), har vi igangsat undersøgelser for at løse de roller enkelte checkpoint signalering og DNA reparation veje i humane celler afledt fra humane tumorer. I vores første analyse, fandt vi, at 5-FU og FdUrd har meget forskellige virkningsmekanismer i æggestokkene cancerceller [17]. Deaktivering ATR eller BER sensibiliserede disse celler til FdUrd, men ikke 5-FU, hvilket indikerer, at FdUrd dræber celler ved at forårsage DNA-skader, og at 5-FU udøver sin cytotoksicitet ved en anden mekanisme, eventuelt ved at afbryde RNA metabolisme. Især vi fandt også, at PARP-inhibitorer, som har vist hidtil uset aktivitet mod æggestokkene tumorer og andre tumorer, der har muteret

BRCA1

BRCA2

[40] – [43], bemærkelsesværdigt sensibiliserede æggestokkræft celler til FdUrd, men ikke 5-FU [17]. I betragtning af at FdUrd er aktiv i ovariecancer [44], [45], at defekter i

BRCA1

BRCA2

(eller andre gener i det homologe reparation vejen) er almindelige i ovariecancer [ ,,,0],46], og at PARP-inhibitorer vil sandsynligvis have en rolle i behandlingen af ​​ovariecancer [24], og disse resultater viste en hidtil ukendt terapeutisk strategi i ovariecancer. Især dog biologi ovariecancer er meget forskellig fra biologi tyktarmskræft. De onkogener og tumorsuppressorgener almindeligt muteret i tyktarmskræft (

APC, p53, PI3K, KRAS

) adskiller sig fra generne almindeligt muterede i ovariecancer (

NF1, RB1, CDK12, CCNE1, HAK

) [46], [47]. Endvidere DNA-reparationsveje, der er forstyrret i colon cancerceller er meget forskellige fra dem, der afbrydes i ovariecancere. For eksempel generne påkrævet for mismatch reparation pathway (fx

MLH1

MSH2

) er ofte muteret eller epigenetisk stumme i tyktarmskræft [39], [48], mens defekter i homolog rekombination (fx

BRCA1

BRCA2

mutationer) forekommer i ovariecancer [46], [47]. Endelig ovarie- og colontumorer har meget forskellige reaktioner på 5-FU. Mens 5-FU har meget begrænset aktivitet i ovariecancer [49], [50], 5-FU er hjørnestenen for alle kemoterapi anvendes til behandling af tyktarmskræft på grund af dens høje aktivitet i denne sygdom [1]. Derfor givet disse biologiske forskelle mellem ovarie- og coloncancer, og det faktum, at 5-FU universelt anvendes i tyktarmskræft kemoterapi, har vi nu bestemt, hvor 5-FU og FdUrd dræbe coloncancerceller at få vigtig indsigt underliggende biologi disse midler og forbedre deres anvendelse i klinikken til at behandle denne sygdom. Til det formål har vi igangsat en systematisk analyse af de roller genotoxin-aktiverede checkpoint signalering, BER vej, og MMR-vejen ved at nedbryde vigtige signalering mellemprodukter i disse veje ved hjælp af yderst effektive siRNA’er. Disse resultater ikke kun yderligere belyse vores forståelse af signal- og DNA reparation veje, der er vigtige i disse celler, de også afslører, at kolon tumor celler sensibiliseret til FdUrd af små molekyler PARP-inhibitorer, der i øjeblikket i kliniske forsøg, hvilket tyder en ny terapeutisk tilgang, der kombinerer FdUrd, et lægemiddel, der er godkendt til behandling af tyktarmskræft, med en PARP-inhibitor, en ny klasse af stoffer med spændende anticancer aktivitet.

Materialer og metoder

cellelinjer og kultur

HT29, HCT-8, og HCT-116 celler blev opnået fra American Type Culture Collection. HCT-116.ch2 og HCT-116.ch3 [51] celler fra Scott Kaufmann (Mayo Clinic). Celler blev dyrket i RPMI-1640-medier (Mediatech) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals) ved 37 ° C i 5% CO

2. For klonogene assays blev medium suppleret med 100 U /ml penicillin og 100 mikrogram /ml streptomycin (Mediatech)

Materialer

Reagenser var fra følgende leverandører:. 5-fluorouracil (APP Pharmaceuticals ), FdUrd (Bedford Laboratories), ABT-888 (Selleck Chemicals og ChemieTek), AZD2281 (ChemieTek), KU-55.933 (Tocris Bioscience), gemcitabin (Eli Lilly), SuperSignal Pico West (Thermo Scientific). Alle andre materialer var fra Sigma-Aldrich

Antistoffer var som følger:. Phospho-Ser317-Chk1 (R phospho-Thr68-Chk2, ATR, peberrodperoxidase-bundet kanin IgG og peberrodsperoxidase-koblet muse IgG (Cell Signaling); Chk1 (Santa Cruz Biotechnology); Chk2 og ATM (Epitomics); APE1 (Abcam); XRCC1 (Bethyl Laboratories); beta-actin (Sigma-Aldrich); og HSP90, D. Toft (Mayo Clinic, Rochester, MN).

celletransfektioner og små interfererende (SI) RNA’er

siRNA’er blev transficeret ved elektroporering som beskrevet [17]. De transficerede celler blev dyrket i 48 timer før brug. Sekvenser af siRNA’er var: ATM-1, 5′-GCACCAGUCCAGUAUUGGC-3 ‘[52]; ATR-2, 5’-CCUCCGUGAUGUUGCUUGA-3 ‘[53]; XRCC1-2, 5’-CUCGACUCACUGUGCAGAA-3 ‘[54]; APE1, 5’-GGACAGAGCCAGAGGCCAA-3 ‘; MLH1, 5’-GGAAGAUUCUGAUGUGGAA-3 ‘; MSH2, 5’-GAUCCUAAUCUCAGUGAAU-3 ‘; og luciferase, 5’-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3 ‘[55].

klonogene assays, cellelyse, og celle bestråling

Celle cyklus analyser, klonogene assays, cellelyse, immunblotting og immunfarvning blev udført som beskrevet [56], [57]. For klonogene assays ved hjælp af ikke-transficerede celler, blev procent overlevelse for alle individuelle og kombinationsbehandlinger normaliseret til celler behandlet med kun køretøj. For klonogene assays under anvendelse af celler transficeret med siRNA, blev procent overlevelse ved hver medikamentkoncentration normaliseret til den vehikel-behandlede kontrol for den givne siRNA. Cellerne blev bestrålet med en RS-2000 Biologisk strålerøret, Rad Source (Suwanee, Georgien) 4-6 timer efter plating.

Resultater

5-FU og FdUrd aktivere ATR og ATM checkpoint signalering veje i kolon kræftceller

for at vurdere virkningerne af 5-FU og FdUrd på ATM og ATR checkpoint signalveje, sammenlignede vi evner af disse midler til at aktivere checkpoint signalering i to tyktarmskræft cellelinjer: HT29, som har et funktionelt MMR-system, og HCT-8, som har en mutationer i

MSH6

og er MMR deficiente [58]. Celler blev behandlet med koncentrationer af hvert middel, som inhiberer clonogenicity med 90% (IC

90) og, som en positiv kontrol, hvis replikation inhibitor hydroxyurinstof. Aktivering af ATM og ATR pathways blev derefter vurderet ved immunoblotting for phosphoryleret Chk1 og Chk2, to proteinkinaser, som er phosphoryleret og aktiveret af ATR og ATM [59]. Disse undersøgelser afslørede, at 5-FU og FdUrd stærkt aktiveret Chk1 og Chk2 i HT29-celler (fig. 1B), med 5-FU forårsager endnu større grad af Chk1 phosphorylering end gjorde FdUrd. Tilsvarende i HCT-8-celler, begge midler inducerede Chk1 phosphorylering (. Figur 1C); men i disse celler 5-FU inducerede mindre Chk1 end gjorde FdUrd. Analyser af Chk2 phosphorylering ikke var muligt på grund af de meget lave niveauer af Chk2 i HCT-8-celler (data ikke vist). Tilsammen viser disse resultater, at begge midler forårsager genotoksisk skade, der aktiverer checkpoint signalveje i tyktarmen kræftceller.

ATR og ATM fremme overlevelsen af ​​tyktarmskræft celler behandlet med FdUrd men ikke 5-FU

ATM og ATR er de to apikale kinase regulatorer af genotoxin-induceret checkpoint signalering. For at bestemme om enten ATM eller ATR aktivere pathways, der påvirker overlevelsen af ​​celler behandlet med FdUrd eller 5-FU, vi transient forarmet ATM og ATR hjælp siRNA’er, og derefter vurderet kapaciteten af ​​celler behandlet med graduerede koncentrationer af FdUrd eller 5-FU til proliferere under anvendelse klonogene assays. Overraskende havde depletering af ATM eller ATR ikke sensibiliserer enten cellelinie til 5-FU (fig. 2A og 2B), selv om dette middel aktiveret disse veje (se fig. 1B og 1C). En meget anderledes billede opstod, når cellerne blev behandlet med FdUrd. Udtømning af ATR dramatisk sensibiliserede HT29-celler til FdUrd (fig. 2B) og gemcitabin (fig. S1A), en nukleosidanalog, der inhiberer ribonukleotidreduktase og forstyrrer DNA-replikation, når de inkorporeres i DNA [60]. I modsætning hertil ATM depletion (Fig. 2A) og ATM-inhibitoren KU-55.933 [61] (fig. S1c), som begge er sensibiliseret over for ioniserende stråling (fig. S1B og fig S1D), havde minimale virkninger på FdUrd cytotoksicitet. Lignende resultater blev også set i HCT-8 og HCT-116 celler, hvori ATR depletion sensibiliseret begge cellelinier til FdUrd, men ikke 5-FU (fig. 3). Salg

(A, B) HT29-celler, transficeret med kontrol (Luc), ATM (A), eller ATR (B) siRNA’er blev udpladet som enkelte celler, der udsættes for de angivne koncentrationer af 5-FU eller FdUrd i 24 timer, vasket, dyrket i 10 d, og farvet med Coomassie Blue. Transficerede celler blev også sekventielt immunblottet (mellemværker) at detektere ATM, ATR, og HSP90 (som en loading kontrol). *, Ikke-specifikt bånd.

(a, b) HCT-8 (A) eller HCT-116 (B) celler transficeret med kontrol (Luc) eller ATR siRNAs blev udpladet som enkelte celler, udsat for de angivne koncentrationer af 5-FU eller FdUrd i 24 timer, vasket, dyrket i 10 d, og farvet med Coomassie Blue. Transficerede celler blev også sekventielt immunoblottedes for ATR og HSP90 (belastningskontrol). *, Ikke-specifik band.

Afbrydelse af BER ved nedbrydende XRCC1 sensibiliserer til FdUrd men ikke 5-FU

5-FU og FdUrd forårsage ophobning af uracil og 5-fluorouracil i genomisk DNA [23], [62]. Under anvendelse af renset uracil glycosylaser har vist, at syntetiske substrater bærer uracil og 5-fluorouracil substituenter er substrater for BER maskiner [35], [63] – [70]. Desuden vises i en nylig rapport, at i intakte celler, uracil glycosylaser fjerner 5-FU fra genomerne af tyktarmskræft celler udsat for FdUrd [35]; især, men i disse undersøgelser, udtømning af glycosylaser påvirkede ikke følsomhed over for FdUrd. Derfor, for at undersøge, om invaliderende BER påvirkede følsomheden af ​​HT29-celler til FdUrd, vi brugte siRNAs at nedbryder XRCC1 og APE1, to downstream centrale deltagere i BER vej, og undersøgt deres følsomhed over for FdUrd. Betydeligt, udtømning af XRCC1 (fig. 4) og APE1 (fig. S2) sensibiliserede celler til FdUrd. I modsætning hertil XRCC1 udtømning ikke sensibiliserer disse celler til 5-FU (fig. 4), hvilket viser, at BER ikke spiller en rolle ved at fremme overlevelsen af ​​celler behandlet med 5-FU og hvilket yderligere antyder, at 5-FU udøver sin cytotoksiske virkninger uafhængigt af DNA-replikation eller beskadigelse.

HT29-celler transficeret med kontrol (Luc) eller XRCC1 siRNA blev udpladet som enkelte celler, udsat for de angivne koncentrationer af 5-FU eller FdUrd i 24 timer, vaskes, dyrket i 10 d, og farvet med Coomassie Blue. Transfekterede celler blev også sekventielt immunoblottedes for XRCC1 og beta-actin (en belastning kontrol).

Små molekyle PARP-inhibitorer sensibilisere kolon kræftceller til FdUrd men ikke 5-FU

I betragtning af at XRCC1 og APE1 udtømning sensibiliserede coloncancer celler til FdUrd, og at PARP spiller en central rolle i BER, vi ræsonnerede, at PARP-inhibitorer kan sensibilisere colon cancerceller til FdUrd. Vi udsat derfor HCT-8 og HT29-celler til graduerede koncentrationer af FdUrd eller 5-FU sammen med 3 uM ABT-888 (veliparib [71]), en koncentration, der blev rapporteret tidligere for at sensibilisere flere tumorcellelinier til en række kemoterapimidler [17], [72]. Som vist i fig. 5, ABT-888 håndfast sensibiliseret HCT-8 og HT29-celler til FdUrd, mens ABT-888 ikke ændre de antiproliferative virkninger af 5-FU. For yderligere at demonstrere, at PARP-inhibitorer sensibilisere disse celler til FdUrd, vi også testet PARP-inhibitoren AZD2281 (olaparib [73]), som har vist hidtil uset aktivitet hos tungt behandlede patienter med BRCA1- og BRCA2-deficiente tumorer [40] – [43] . Svarende til de resultater, der ses med ABT-888, AZD2281 håndfast sensibiliserede begge cellelinier til FdUrd (Fig. 5), yderligere støtter tanken om, at PARP hæmning sensibiliserer kolon tumorceller til FdUrd.

HCT-8 eller HT29 celler blev udpladet som enkelte celler, der udsættes for de angivne koncentrationer af 5-FU eller FdUrd sammen med 3 uM ABT-888, 300 nM AZD2281 eller vehikel i 24 timer. Efter vask, 3 pM ABT-888 eller 300 nM AZD2281 blev re-added, og cellerne blev dyrket i 10 d og farvet med Coomassie Blue.

Lille molekyle PARP-inhibitor sensibilisering til FdUrd er uafhængig af MMR status

Tidligere rapporter vist, at celler med defekter i MMR er mere modstandsdygtige over FdUrd [10], [36] – [38]. Tilsvarende patienter behandlet med 5-FU er ikke omfattet af 5-FU-baserede kemoterapi [39], hvilket tyder på, at en intakt MMR vej fremmer drab med 5-FU. Fordi kombinere FdUrd med en PARP-inhibitor kan være en potentiel terapeutisk strategi, vi ræsonnerede, at det ville være vigtigt at bestemme, om tumorceller med defekter i MMR, som forekommer hos 15-20% af coloncancer [39], blev sensibiliseret til FdUrd af en PARP-inhibitor. For at vurdere, hvordan MMR status påvirker følsomheden af ​​tyktarmskræft celler til FdUrd alene og kombinationen af ​​FdUrd plus AZD2281 vi brugte to modelsystemer. For første modelsystem, vi brugte siRNAs at nedbryder MSH2 og MLH1. Begge siRNA’er var meget effektive, forårsager næsten fuldstændig tab af MLH1 og MSH2 (fig. 6A) og forstyrrer MNNG (N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidin) -induceret G2 /M arrest (Fig. S3), som kræver en funktionel MMR-vejen [51]. Især blev HT29-celler depleteret for MLH1 eller MSH2 alvorligt sensibiliseret til FdUrd af AZD2281, og var beskedent resistente over FdUrd alene.

(A) HT29-celler transficeret med kontrol (Luc), blev MSH2, eller MLH1 sRNA’er udpladet som enkelte celler, der udsættes for de angivne koncentrationer af 5-FU eller FdUrd i 24 timer, vasket, dyrket i 10 d, og farvet med Coomassie Blue. Transficerede celler blev også sekventielt immunoblottedes for MSH2 eller MLH1 og beta-actin (belastningskontrol). (B) HCT116.ch2 og HCT116.ch3 celler blev udsat for de angivne koncentrationer af FdUrd sammen med vehikel eller 300 nM AZD2281 i 24 timer. Efter vask, AZD2281 blev igen tilsat, og cellerne blev dyrket i 8 d for at tillade kolonidannelse.

For det andet modelsystem, vi beskæftigede parrede kolon cellelinier, HCT-116.ch2 og HCT-116.ch3 [51]. Disse cellelinier blev afledt fra parentale HCT-116-celler, som har biallel inaktiverende

MLH1

mutationer, som gør dem MMR-defekte [74]. HCT-116.ch3 celler indeholder et ekstra kromosom 3, som koder for en funktionel MLH1 der genskaber MMR. HCT-116.ch2 celler, der anvendes som en kontrol, indeholder en yderligere kromosom 2 og ligesom de parentale celler er MMR-deficiente. I overensstemmelse med tidligere offentliggjorte resultater, MMR deficiente HCT-116.ch2 celler var moderat mere resistente over for FdUrd end var HCT-116.ch3 celler (Fig. 6B), som er MMR dygtige [75]. Især dog AZD2281 robust sensibiliserede begge cellelinier til FdUrd. Taget sammen viser disse resultater, at colon cancerceller med defekter i MMR-vejen også kan sensibiliseret til FdUrd af et lille molekyle PARP-inhibitor.

Diskussion

5-FU er blandt de mest brugte anticancer kemoterapeutiske stoffer, og det (eller 5-FU prodrug capecitabin) er rygraden i alle kemoterapi regimer anvendes til behandling af coloncancer [1], den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA [76]. Trods den udbredte anvendelse i behandlingen af ​​coloncancer, er det stadig uklart, hvordan denne agent dræber colon-tumorceller. Tilsvarende FdUrd, som ofte anses for at have en lignende virkningsmekanisme til 5-FU, anvendes også til behandling af kolon tumorer, der har metastaseret til leveren. For at få indblik i, hvordan disse midler påvirker kolon kræftceller vi først gennemført omfattende analyser af roller ATM og ATR checkpoint signalveje i tyktarmskræft celler udsat for 5-FU og FdUrd, og derefter analyseret rolle BER vej, en reparationsvej der fjerner uracil og uracil analoger, der er inkorporeret i genomet. Vi har tidligere sammenlignet de mekanismer, som 5-FU og FdUrd dræbe ovariecancerceller. Især dog 5-FU har meget begrænset klinisk aktivitet mod ovariecancer [49], [50], og DNA-reparationsveje, der er forstyrret i ovariecancer afviger fra dem afbrydes i tyktarmskræft. Konkret ovariecancer ofte udviser “BRCAness” på grund af defekter i

BRCA1

eller

BRCA2

eller andre dårligt definerede ændringer, der forstyrrer homolog rekombination DNA reparation vej [46]. I modsætning hertil i coloncancere basefejlparringsreparationssystemet pathway ofte muteret eller tavshed [39], [48], og MMR-vejen er blevet rapporteret at påvirke celledrab med 5-FU og FdUrd [36] – [38], [77 ], [78]. Derfor, i denne rapport har vi udført head-to-head sammenligning af disse agenter i MMR-dygtige og deficiente tyktarmskræft celler, der er blevet forarmet af centrale checkpoint signal- og BER pathway mellemprodukter. Vigtigere, har disse mekanistiske undersøgelser afdækket nye indsigt i, hvordan disse midler dræber kolon kræftceller og identificeret en potentiel terapeutisk strategi mod tyktarmskræft.

Først vores undersøgelser vist ATR-men ikke ATM-checkpoint signalvejen spiller en kritisk rolle letter overlevelse af celler behandlet med FdUrd. Selvom tidligere undersøgelser dokumenteret, at FdUrd aktiverer ATM- og ATR-afhængige checkpoints [10], [13], [79], har disse undersøgelser ikke sammenligne virkningerne af ATM og ATR udtynding på overlevelsen af ​​tumorceller udsat for begge stoffer. Her har vi behandlet det spørgsmål. Overraskende fandt vi, at selv om FdUrd er blevet rapporteret at forårsage dobbeltstrengede DNA-brud [20], [21], ATM har kun en mindre rolle i FdUrd-induceret drab. I modsætning hertil ATR udtømning alvorligt sensibiliseret til FdUrd, hvilket viser, at ATR spiller en kritisk rolle i stabiliseringen strandede replikationsgafler og forhindre kollaps og dermed fremme celleoverlevelse, når celler behandles med replikations-inhibitorer såsom nukleosidanalogen gemcitabin [60]. Derfor er de foreliggende undersøgelser tyder på, at forstyrrelse af DNA-replikation der opstår, når TS inhiberes og den efterfølgende afbrydelse af dNTP niveauer er sandsynligvis en vigtig mekanisme, ved hvilken FdUrd forårsager cytotoksicitet.

andet, de foreliggende resultater at tydeliggøre rolle BER i colon cancerceller udsat for 5-FU og FdUrd. Tidligere undersøgelser undersøger rolle BER pathway har fundet forskellige resultater, med øget, reduceret eller uændret følsomhed over for 5-FU eller FdUrd i en række eksperimentelle systemer [17], [23], [25] – [35]. I modsætning hertil viser de foreliggende resultater, at XRCC1 udtømning sensibiliserer til FdUrd, men ikke 5-FU. Dette fund, sammen med vores offentliggjorte undersøgelser viser, at et intakt BER pathway beskytter ovariecancerceller behandlet med FdUrd [17], viser, at FdUrd påfører læsioner, der er cytotoksiske for nogle humane cancerceller. I overensstemmelse med disse resultater, to potente og meget specifikke lille molekyle hæmmere af PARP også sensibiliseret til FdUrd. Disse resultater svarer til det, der blev observeret i ovariecancerceller [17]. Men da æggestokkene cancerceller ofte udviser BRCAness (på grund af defekter i homolog rekombination) [46], [80], en fænotype, der gør cellerne udsøgt følsomme over for PARP-inhibitorer [81], det forblev et ubesvaret spørgsmål, om PARP-inhibitorer vil også sensibilisere til FdUrd i colon cancerceller, som ikke har defekter i homolog rekombination. Det skal dog bemærkes, at selv om vores XRCC1 fund stærkt støtte en beskyttende rolle for BER, kan virkningen af ​​de PARP-inhibitorer være mere kompliceret. PARP ikke kun spiller en vigtig rolle i BER men også deltager i andre DNA-reparationsveje og celle signalveje, øge muligheden at den enorme sensibilisering set med de PARP-inhibitorer kan stamme fra indvirkninger på BER samt andre cellulære veje.

for det tredje, de nuværende undersøgelser viser, at nedbryder de apikale regulatorer af checkpoint signalering (ATR og ATM) eller deaktivere centrale medlemmer BER pathway (med XRCC1 og APE1 siRNAs eller PARP hæmmere) ikke bevidstgøre til 5-FU. Sådanne resultater tyder på, at 5-FU udøver sine cytotoksiske virkninger uafhængigt af dets virkninger på DNA-replikation eller integritet. Især dette resultat er i overensstemmelse med en række undersøgelser, der viser, at 5-FU medierer celledrab ved inkorporering i RNA og forstyrre RNA metabolisme [82] – [89]. I modsætning hertil konstateringen af, at deaktivere ATR og BER veje sensibiliserer stærkt til FdUrd, tyder på, at denne agent dræber kolon tumorceller primært ved at påvirke DNA metabolisme, hvilket viser, at 5-FU og FdUrd har meget forskellige virkningsmekanismer.

Endelig, og vigtigst, disse undersøgelser, som blev indledt for at identificere de checkpoint og DNA reparation veje, der regulerer kolon tumor respons på FdUrd og 5-FU, viste, at BER var en kritisk reparation vej, når disse celler blev udsat for FdUrd ( men ikke 5-FU). Baseret på disse resultater, og det faktum, at PARP-inhibitorer forstyrrer BER, så opdagede vi, at små molekyle PARP-inhibitorer robust sensibiliseret MMR-mangel og -proficient kolon kræftceller til FdUrd (men ikke 5-FU). Disse fund kan være af særlig betydning i tumorer med defekter i MMR, som udgør 15-20% af alle coloncancerformer [39]. Tidligere undersøgelser fandt, at MMR-defekte cellelinier er mindre følsomme over for 5-FU og FdUrd. I overensstemmelse med dette resultat, har kliniske studier vist, at 5-FU har begrænset aktivitet mod MFR-mangelfulde tyktarmskræft sammenlignet med MMR-dygtige tumorer [39]. I betragtning af at en) FdUrd er godkendt til behandling af tyktarmskræft; og 2) er der begrænsede behandlingsmuligheder for disse tumorer, fordi tumorer med defekter i MMR er almindeligt anset for at være ikke reagerer på 5-FU-baserede terapier, vores fund, at PARP-inhibitorer håndfast bevidstgøre MMR-defekte celler til FdUrd rejser muligheden for, at behandlinger, som kombinere FdUrd med en PARP-inhibitor kan have aktivitet mod disse tumorer. Ligeledes fordi PARP-inhibitorer også sensibilisere mismatch dygtige tumorer til FdUrd, denne lægemiddelkombination kan også være nyttige i behandlingen af ​​disse tumorer. Yderligere præklinisk og klinisk udvikling af denne kombination er berettiget.

Støtte oplysninger

figur S1. Salg Virkninger af ATR og ATM forstyrrelser på følsomhed over for gemcitabin og ioniserende stråling. (A) ATR udtømning sensibiliserer til gemcitabin. HT29-celler transficeret med kontrol (Luc) eller ATR siRNAs fra eksperiment er vist i fig. 2B blev udpladet som enkelte celler, udsat for de angivne koncentrationer af gemcitabin i 24 timer, vasket og dyrket i 10 d at tillade kolonidannelse. (B) ATM udtynding sensibilisere for ioniserende stråling (IR). HT29-celler transficeret med kontrol (Luc) eller ATM siRNAs fra eksperiment er vist i fig. 2A blev udpladet som enkelte celler, udsat for de angivne doser af ioniserende stråling, og dyrket i 10 d at tillade kolonidannelse.