PLoS ONE: Den Vaskemiddel-Opløselig Cytoplasmatisk Pool of Survivin blænder anoikis og dens udtryk er forbundet med metastatisk sygdom for Human Colon Cancer

Abstrakt

Survivin er en komponent af det kromosomale passager kompleks (CPC), som er afgørende for nøjagtig kromosom segregering. Forstyrre funktionen af ​​Survivin i mitosen fører til kromosom adskillelse fejl og defekte cytokinese. Survivin indeholder en Baculovirus IAP Repeat (BIR) og blev derfor oprindeligt klassificeret som inhibitor af apopotosis protein (IAP), men dens rolle i apoptose efter cellulært stress forbliver stort set ukendt. Vi demonstrerer her, at Survivin overvejende undertrykker anoikis, en form for programmeret celledød induceret af tab af cellulær adhæsion til ekstracellulær matrix. Interessant celler ektopisk overudtrykker EGFP-Survivin viste efter tab af celle-matrix-vekselvirkning en nedsat ekspression af IKB-α. Efterfølgende subcellulære proteinfraktioneringsteknikker og immunopræcipitationsforsøg afslørede, at XIAP interagerer med detergent-opløselig Survivin som vides at samvirkende aktivere NF-KB-signalering. Undersøgelse af ekspressionsniveauerne af vaskemiddel opløselig Survivin i kolorektale cancer cellelinjer og i kolorektale kræft væv afslørede, at vaskemiddel opløselige cytoplasmatiske survivin niveauer korrelerede omvendt med anoikis modtagelighed i kolorektal cancer. Derfor kan rengøringsmidlet opløselige cytoplasmatiske Survivin være en lovende prædiktiv biomarkør for lymfeknude og fjerne metastaser af kolorektal cancer. Vi konkluderer, at en anti-apoptotiske funktion vaskemiddel-opløselig Survivin i interfaseceller oplever anoikis medieres mindst via XIAP /IKB-α /NF-KB-signalering

Henvisning:. Hori M, Miki T, Okamoto M , Yazama F, Konishi H, Kaneko H, et al. (2013) Den vaskemiddel-Opløselig Cytoplasmatisk Pool of Survivin blænder anoikis og dens udtryk er forbundet med metastatisk sygdom for Human tyktarmskræft. PLoS ONE 8 (2): e55710. doi: 10,1371 /journal.pone.0055710

Redaktør: Srinivasa M. Srinivasula, IISER-TVM, Indien

Modtaget: Juli 20, 2012; Accepteret: December 29, 2012; Publiceret: 6 Feb 2013

Copyright: © 2013 Hori et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Japan Society for fremme af Science (KAKENHI nr 21.591.730 for Masaaki Tatsuka) og Prefectural University of Hiroshima (Vigtigt Research Project, GAKUNAI Kyodo Kenkyu H-24 for Masaaki Tatsuka, Hiroaki Konishi, og Fumio Shimamoto), og Prefectural University of Hiroshima Graduate School of Omfattende videnskabelig forskning til Mayumi Okamoto og Guangying Qi (Research Associate Grant H-24). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Under udviklingen af ​​kræft, metastatiske celler løsnes fra tilstødende tumorceller erhverve celle motilitet, invadere og indtast lymfesystemet eller blodcirkulation, overleve og danne metastatiske læsioner. Disse trin involverer mange gener og veje, og alligevel disse biologiske processer er dårligt forstået trods mange videnskabelige tilgange [1]. Identifikationen af ​​metastatiske tumor-targeting molekyler til diagnostiske og terapeutiske procedurer stadig er nødvendig.

Survivin er medlem af det kromosomale passager proteinkompleks (CPC), som er en vigtig regulator af mitose. Survivin og andre CPC komponenter, Aurora-B, indre centromer protein (INCENP), og Borealin (Dasra B) er afgørende for CPC funktioner, herunder kinetochore vedhæftede fejlretninger og færdiggørelse af cytokinese [2]. Survivin bidrager til den mitotiske lokalisering af CPC og er blevet beskrevet at styrke Aurora-B-aktivitet, som vist i

Xenopus laevis

S. pombe

[3], [4]. I begyndelsen af ​​mitose, phosphorylering af histon H3 på threonin 3 medieret af Haspin og efterfølgende binding af Survivin til dette site er kritisk for at samle CPC på kinetochores [5], [6], [7].

Survivin er periodisk til udtryk under cellecyklus topper i mitose [8]. Previou undersøgelser har vist, at Survivin ekspression hæmmes af p53, og tab af p53-funktion, som ofte observeres i cancerceller, øger dens transkription [9], [10]. Faktisk fleste cancerceller analyseret hidtil opregulerer Survivin [11], [12], når sammenlignet med normale celler eller tilstødende væv. Desuden i mange tilfælde human cancer, Survivin er detekteret selv under interfase [13], [14]. Overekspression af Survivin ofte findes i kolorektal cancer [15], [16], [17]. Her forøgede niveauer af Survivin er blevet beskrevet at korrelere med en dårlig prognose [18], [19], men modstridende data er blevet offentliggjort vedrørende denne [20]. Ud over sin CPC funktioner Survivin menes at have flere roller i apoptotisk regulering [21], [22], [23]. Men inden for den N-terminale ende af Survivin, er der kun én baculovirale inhibitor af apoptose gentagelse (BIR) domæne. Også Survivin indeholder nogen C-terminale RING finger domænet, som er fælles for medlemmer af IAP familien [11], [24]. Selv Survivin oprindeligt blev klassificeret som inhibitor af apoptose (BIR) det er nu anerkendt, at dens vigtigste molekylære funktioner er knyttet til spindlen samling checkpoint og cytokinese. I dag er de anti-apoptotiske funktioner Survivin spørgsmålstegn da de fleste forsøg, som blokerede Survivin funktion førte til udviklingen af ​​mitotiske defekter, som kan interferere med en nøjagtig analyse af dens IAP funktion [25], [26], [27], [28 ]. I en tidligere undersøgelse ablation af Survivin i kylling B lymfocyt var DT40 dødelig på grund af manglen af ​​både CPC funktioner og yderligere andre celleproliferative evner [29]. Men disse celler viste normal modtagelighed for etoposid-induceret apoptose sammenlignet med kontrolceller.

I vores undersøgelse viser vi for første gang, at detergent-opløselig Survivin undertrykker anoikis i forankringsafhængige celler, en form for programmeret celledød induceret af tab af vedhæftning fra den omgivende ekstracellulære matrix. Subcellulære fraktionering eksperimenter forudsat beviser for, at vaskemiddel opløselige Survivin af cytosolen var ansvarlig for at undertrykke anoikis. Mekanismen for anoikis undertrykkelse involverer aktivering af XIAP /IKB-α /NF-KB-signalering og inaktivering af c-Jun. En yderligere vigtig opdagelse med denne undersøgelse er, at detergent-opløselig Survivin er korreleret til invasiv fænotype af kolorektale cancerceller. Derfor kan vaskemiddel-opløselige Survivin være af klinisk værdi, da det sandsynligvis forudsiger lymfeknude og fjernmetastaser i kolorektal cancer patienter.

Resultater

Overekspression af Survivin beskytter celler fra anoikis

i indledende studier søgte vi at analysere virkningen af ​​Survivin overekspression i p53-mangelfulde kinesisk hamster embryonale diploide fibroblaster (CHE celler) og isogene CHE celler, der huser vildtype p53. Til overvågning transfektion brugte vi en forbedret grøn fluorescens protein-tagget Survivin (EGFP-Survivin). Endnu, ektopisk overekspression af EGFP-Survivin havde ingen virkning på apoptose i CHE-p53 + /+ celler behandlet med DNA-beskadigende ioniserende stråling (IR) og UV-C sammenlignet med CHE-p53 + /+ – EGFP-celler (figur 1A) som målt ved annexin V-farvning og terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) -medieret dUTP nick endemærkning (TUNEL) assay. Så vendte vi vores opmærksomhed på CHE celler med defekte p53 status (CHE-p53 – /- celler). Påfaldende, CHE-p53 – /- celler med ektopisk overekspression af EGFP-Survivin produceret metastatiske lungetumorer når injiceres subkutant i svækket immunforsvar mus hvorimod ingen lungemetastaser blev observeret efter xenografting CHE-p53 – /- celler, der udtrykker EGFP (tabel S1). Afprøvning apoptose induktion efter IR- eller UV-C afslørede, at CHE-p53 – /- celler havde signifikant større del af apoptose-positive celler i sammenligning med CHE celler med vildtype p53 [30], [31], [32] (figur 1A ). Denne observation er i overensstemmelse med rapporter ved hjælp gnaver embryonale fibroblaster demonstrerer en mindre følsomhed over for IR- og UV-C end de celler, som mangler funktionel p53, cellecyklus checkpoint kontrol. Interessant, vi heller ikke finde en beskyttende effekt af overudtrykt Survivin i CHE-p53 – /- celler i forhold til CHE celler med ektopisk udtryk for EGFP (figur 1A)

A.. Hyppighed af apoptose i CHE-celler (med p53 + /+ og p53 – /-) transficeret med pEGFP-tom og pEGFP-Survivin efter behandling med X-bestråling (10 Gy) og UV-C (10 J /m

2) . De transficerede celler blev udsat for IR- eller UV-C ved 24 timer efter transfektion. Transfektion frekvenser var 80-90%, og EGFP-positive celler blev talt for Annexin V-positive eller -negative celler (

øverste panel

) og TUNEL assay-positive eller -negative celler (

lavere panel

). X-bestrålede CHE-p53 – /- celler havde signifikant større brøkdel af apoptose-positive celler i forhold til X-bestrålede CHE-p53 + /+ celler (

P

0,03 til Annexin V farvning og

P

0,08 for TUNEL-assay), og UV-C bestrålet CHE-p53 – /- celler havde signifikant større del af apoptose-positive celler i sammenligning med UV-C bestrålet CHE-p53 + /+ -celler (

P

0,001 for Annexin V farvning og

P

0,02 for TUNEL assay). Apoptose-positive celler blev ikke signifikant reduceret i pEGFP-Survivin-transficerede celler sammenlignet med pEGFP-transficerede celler i hvert tilfælde (

P

0,4 til Annexin V-farvning og

P

0,4 for TUNEL-assay). Værdier angiver middel ± S.D. (N = 3). B. Forhøjelse af tilbageholdelse i lungerne efter intravenøs injektion af EGFP- eller EGFP-Survivin-udtrykkende celler. Antallet af overlevende CHE-p53 – /- celler i lungen var signifikant forøget i sammenligning med antallet af overlevende kontrol celler, der udtrykker EGFP. Værdier angiver middel ± S.D. af seks mus. * Signifikant forskel (

P

0,005). C. Caspase-3 aktivering i CHE-p53 – /- celler transficeret med pEGFP-tom og pEGFP-Survivin efter anoikis induktion. De transficerede celler blev løsnet fra ekstracellulær matrix og samtidig serum-udsultet at inducere anoikis ved 24 timer efter transfektion. Celler blev suspenderet i serumfrit medium i 6-36 timer, høstet og lyseret i Laemmli SDS-prøvepuffer til immunoblotanalyse med anti-aktiverede caspase-3-antistof. Transfektions- frekvenser blev kontrolleret ved hjælp af fluorescensmikroskopi og bekræftet at være 80-90%. D. Caspase-3-aktivering i CHE-p53 – /- celler transficeret med pEGFP-tom og pEGFP-Survivin efter behandling med UV-C (10 J /m

2). De transficerede celler blev udsat for UV-C ved 24 timer efter transfektion. Celler blev dyrket i 24 timer, høstet og lyseret i Laemmli SDS-prøvepuffer til immunoblotanalyse med anti-aktiverede caspase-3-antistof. Transfektions- frekvenser blev kontrolleret ved hjælp af fluorescensmikroskopi og bekræftet at være 80-90%.

Hidtil transfektion af pEGFP-Survivin hæmmer ikke strålingsinduceret apoptose i CHE-celler, uanset p53-status og ekspressionsniveauer af Survivin men på den anden side kun CHE-p53 – /- celler, der overudtrykker EGFP-Survivin forårsagede metastatisk sygdom i mus. Vi hypotese derfor, at overekspression af Survivin kan øge overlevelsen af ​​CHE-p53 – /- -EGFP-Survivin celler under stress betingelser, som sandsynligvis mere ligner

in vivo

fysiologiske betingelser for at udbrede tumorceller såsom forankringsuafhængig situation og næringsstofudsultning

Faktisk ved at anvende

iv

injektion af tumorceller i mus vi viste, at antallet af overlevende CHE-p53 -. /- celler i lungen blev signifikant forøget sammenlignet til antallet af overlevende kontrol celler, der udtrykker EGFP (figur 1B).

for yderligere at udforske vores hypotese, testede vi, om overekspression af EGFP-Survivin Tildelt reduceret anoikis-følsomhed, nemlig modstandsdygtighed over for serum starvation- og suspension kultur- induceret apoptose, i CHE-celler. Som afbildet i figur 2A blev det klart, at overekspression af EGFP-Survivin undertrykte signifikant anoikis sammenlignet med CHE-p53 – /- kontrolceller, som målt ved annexin V-farvning og også ved TUNEL-assay, i CHE-p53 – /- celler . Supplerende immunoblotanalyse til påvisning af det forarbejdede eksekutor caspase-3 bekræftede, at overudtrykt EGFP-Survivin beskyttet mod anoikis (figur 1C) siden CHE-p53 – /- celler med ektopisk ekspression af EGFP-Survivin demonstrerede en svagere gradvis forøgelse af forarbejdet caspase-3 i den observerede tidsperiode. På den anden side, havde overekspression af EGFP-Survivin ikke undertrykke caspase-3 aktivering i UV-C-induceret apoptose (figur 1 D).

A. Hyppigheden af ​​anoikis i CHE-p53 – /- celler transficeret med pEGFP-tom og pEGFP-Survivin. De transficerede celler blev løsnet fra ekstracellulær matrix og samtidig serum-udsultet at inducere anoikis ved 24 timer efter transfektion. Transfektionsteknikker frekvenser var 80-90%, og EGFP-positive celler blev talt for anoikis-positive eller -negative celler. Overekspression af EGFP-Survivin undertrykte signifikant anoikis sammenlignet med CHE-p53 – /- kontrolceller. Værdier angiver middel ± S.D. (N = 3). * Signifikant forskel (

P

0,08). ** Signifikant forskel (

P

0,04). B. Caspase-3 aktivering i EGFP- og EGFP-Survivin-udtrykkende celler efter serum sult under vedhæftede eller fritliggende dyrkningsbetingelser. Den eksperimentelle protokol blev illustreret i fig S1. Transfektions- frekvenser blev kontrolleret ved hjælp af fluorescensmikroskopi og bekræftet at være 80-90%. Celler blev holdt i serumfrit medium i 24-72 timer, høstet og lyseret i Laemmli SDS-prøvepuffer til immunoblotanalyse med anti-GFP, anti-survivin, anti-aktiverede caspase-3-antistof, anti-LC3B, og anti -α-tubulin. C. Survivin-induceret apoptose repression sats sammenlignet mellem EGFP-udtrykkende celler og EGFP-Survivin-udtrykkende celler. Niveauer af aktiveret caspase-3-protein blev estimeret ved immunoblotanalyse. Undertrykkelsen satser blev udtrykt i et forhold af aktiveret caspase-3-protein-niveau i EGFP-Survivin-udtrykkende celler til niveauet i EGFP-udtrykkende celler. Værdier angiver middel ± S.D. (N = 3). * Signifikant forskel (

P

0,04). ** Signifikant forskel (

P

0,02). *** Signifikant forskel (

P

0,007). D. DNA fragmentation analyse EGFP-udtrykkende celler og EGFP-Survivin-udtrykkende celler. De transficerede celler blev løsnet fra ekstracellulær matrix og samtidig serum-udsultet at inducere anoikis ved 24 timer efter transfektion. Cellerne blev suspenderet i 24 timer og høstes. Genomisk DNA blev ekstraheret og underkastet elektroforese på agarosegeler. E. Repræsentative billeder af EGFP-udtrykkende celler og EGFP-Survivin-udtrykkende celler under anvendelse laser konfokal mikroskopi. Transficerede celler blev suspenderet i serumfrit medium i 24, og afbildes af Nomarski differentiel interferens kontrast (

bane DIC

), ved rhodamin phalloidin-farvning (

lane F-actin

), ved EGFP fluorescens (

lane EGFP

), og ved DAPI farvning (

bane DAPI

). Rhodamin phalloidin-farvning og DAPI-farvning typisk indikerede, at EGFP-udtrykkende celler undergik anoikis, men EGFP-Survivin-udtrykkende celler ikke gjorde. F. Bestemmelse af cellelevedygtighed ved WST-1 analysen. Transficerede celler blev suspenderet i serumfrit medium i 24 timer og derefter celle levedygtighed EGFP-udtrykkende celler og EGFP-Survivin-udtrykkende celler blev vurderet. Værdier angiver middel ± S.D. (N = 3). * Signifikant forskel (

P

0,04).

Dernæst vi stilling til, om den beskyttende virkning af overudtrykt EGFP-Survivin på caspase-3-aktivering var anoikis-specifik, ved hjælp af en anoikis assayprotokollen (skematisk illustreret i fig S1). Immunoblot analyser viste, at undertrykkende virkning var mere potent i fritliggende dyrkningsbetingelser end i vedhæftede dyrkningsbetingelser (figur 2B). Bemærkelsesværdige, autophagy, en anden type af celledød forårsaget af en kataboliske proces til nedbrydning af cellulære komponenter ved lysosomer, var ikke involveret i effekten (figur 2B,

IB: anti-LC3B

). De kvantitative data viste den effektive undertrykkelse af suspensionskultur-induceret anoikis i EGFP-Survivin-udtrykkende celler sammenlignet med kontrolpatienter celler, der udtrykker EGFP (figur 2C). I tråd med denne observation, overekspression af EGFP-Survivin undertrykt DNA-fragmentering (figur 2D og E) og bevaret celle levedygtighed (figur 2F) i fritliggende kultur tilstand.

Overekspression af Survivin regulerer apoptose-relaterede transkriptionsfaktorer

Vi næste spurgt om, hvilke signalveje kan være involveret i anoikis-undertrykkelse i EGFP-Survivin-udtrykkende CHE-p53 – /- celler. Survivin er blevet beskrevet at inhibere pro-apoptotiske Bcl-2-associeret X protein (BAX) -induceret apoptose [33]. Endnu ekspressionsniveauer af BAX blev ikke ændret efter induktion af anoikis i EGFP-Survivin- samt EGFP-udtrykkende CHE-p53 – /- celler (figur 3,

Bax

). Vi fokuserede derefter på den anden mitokondrier-afledte aktivator af caspase /direkte inhibitor af apoptose-bindende protein med lav pI (Smac /DIABLO), som er blevet påvist at binde til Survivin [34], [35]. Men Smac /DIABLO var målbart i fritliggende kultur tilstand (Figur 3,

Smac /DIABLO

). En anden IAP familiemedlem, X-bundet inhibitor af apoptose protein (XIAP) er blevet rapporteret at danne heterodimerer med Survivin [36]. Nogle former for evidens tyder på, at denne heterodimer er i stand til at aktivere en anti-apoptotisk NF-KB-signalering via phosphorylering og efterfølgende nedbrydning af den molekylære inhibitor af kappa B-α (IKB-α) [37]. Interessant bemærkede vi en opregulering af IKB-a-protein-niveauer i fritliggende dyrkningsbetingelser af kontrol CHE-p53 – /- celler, hvorimod IKB-a ekspressionsniveauer forblev meget lav i EGFP-Survivin-udtrykkende celler (figur 3,

XIAP, IKB-α, og NF-KB

). Samtidig hermed forøgelse af phosphorylering af pro-apoptotisk transkriptionsfaktor, c-Jun, blev undertrykt ved overekspression af EGFP-Survivin i fritliggende dyrkningsbetingelser (figur 3,

JNK, c-Jun-P (S73), og c-Jun

). Disse data antyder, at overekspression af EGFP-Survivin formindsker IKB-α niveau i løsnede celler og efterfølgende føre til aktivering NF-KB og på samme tid til en suppression af c-Jun-medieret transkription. Men vi kunne ikke fundet et bidrag på fokal adhæsion kinase (FAK) til anoikis undertrykkelse i dette cellesystem selvom FAK auto-phosphoryleringssted ved Y397 er blevet rapporteret at være vigtig for anti-apoptotisk aktivitet af FAK [38], [39] .

Den eksperimentelle protokol blev illustreret i figur S1. Transfektions- frekvenser blev kontrolleret ved hjælp af fluorescensmikroskopi og bekræftet at være 80-90%. Celler blev holdt i serumfrit medium i 24-72 timer, høstet og lyseret i Laemmli SDS-prøvepuffer til immunoblotanalyse med anti-β-actin, anti-Bax, anti-Smac /DIABLO, anti-XIAP, anti- IKB-α, anti-NF-KB, anti-JNK, anti-c-jun-P (S73), anti-c-jun, anti-FAK-P (Y397), og anti-FAK.

CPC komponenter, herunder Survivin har en tendens til at associere med chromatin og derfor findes ofte i kernen og er for det meste detergent-uopløselige. Alligevel har andre intracellulære pulje af Survivin blevet beskrevet i cytosolen eller associeret med mitochondrier [40], [41]. Det var af særlig interesse, hvordan survivin associerer med XIAP i en celle. Fra tid-retters eksperimenter blev caspase-3-aktivering fundet 6 timer efter anoikis induktion (figur 1C). Følgelig blev cellerne på tidspunktet 0, 3 og 6 timer efter anoikis induktion anvendes til subcellulære fraktioneringstrin eksperimenter for at undgå misforståelser, der kan opstå ved anvendelse af døde celler induceret af anoikis. Immunoblotanalyser følgende subcellulær fraktionering afslørede, at XIAP meste blev fundet i detergent-opløselige fraktion af cytosolen (figur 4A,

IB: anti-XIAP

). Alligevel blev størstedelen af ​​EGFP-Survivin fundet i detergent-uopløselige pellet fraktion indeholdende kromatin men blev også fundet i mindre grad i detergentsammensætningerne opløselige kerner og cytosol fraktioner (figur 4A,

IB: anti-survivin og IB : anti-EGFP

). Således en interaktion af XIAP og Survivin tydeligvis var begrænset til detergenten opløselige fraktion af cytosolen. Faktisk fandt vi et stabilt protein-protein-interaktion mellem XIAP og Survivin ved anvendelse immunopræcipitationsforsøg hjælp af detergent-opløselige cytoplasmatiske fraktion af CHE-p53 – /- celler med ektopisk ekspression af EGFP-Survivin (figur 4B). Endvidere blev ikke-mærket Survivin mindre effektivt fraktioneret i detergenten opløselige cytoplasmatiske fraktion og anoikis og caspase-3-aktivering blev også mindre effektivt undertrykkes i ikke-mærket Survivin-overudtrykt CHE-p53 – /- celler. På den anden side, en Discosoma rødt fluorescerende protein-tagget Survivin (Survivin-DsRed) blev mere effektivt fraktioneret i detergenten opløselige cytoplasmatiske fraktion og anoikis og caspase-3 blev også mere effektivt undertrykt i Survivin-DsRed-overudtrykt CHE-p53- /- celler (vores upublicerede data)

A.. Subcellulær fraktionering og immunoblotanalyse af aktiveret caspase-3, survivin, og XIAP. Transfektions- frekvenser blev kontrolleret ved hjælp af fluorescensmikroskopi og bekræftet at være 80-90%. Celler blev holdt i serumfrit medium i 3-6 timer, høstet, og lyseret. Cellelysatet blev fraktioneret i vaskemiddel-opløselige cytoplasmatisk (

C

), og nukleare (

N

) fraktioner og vaskemiddel-uopløselige pellet (

P

) fraktionen for immunoblotanalyse med anti-aktiverede caspase-3, anti-survivin, anti-GFP, anti-XIAP, anti-α-tubulin, anti-H3-histon, og anti-β-actin. B. Protein-protein interaktioner mellem EGFP-Survivn og XIAP. Cellelysat fra detergent-opløselige cytoplasmatiske fraktion blev immunpræcipiteret af anti-XIAP-antistof og anti-GFP-antistof og efterfølgende immunoblottet med anti-GFP-antistof (

nedre panel

) og anti-XIAP-antistof (

øvre panel

), hhv. EGFP-Survivin og XIAP var co-imunoprecipitated kun cellelysat danner EGFP-Survivin-udtrykkende celler (

bane 2

).

Den vaskemiddel-opløselige Cytoplasmatisk Survivin er involveret i metastatisk progression af human colorectal cancer

Vi endelig behandlet spørgsmålet om, hvorvidt vaskemiddel-opløselige cytoplasmatisk Survivin, findes i human cancer og en eller anden måde er knyttet til udviklingen af ​​metastatisk sygdom. Vi analyserede otte kolorektale cancercellelinjer, HeLa cervix carcinoma-cellelinie, og 8505C throid carcinom cellelinie ved cellulær fraktionering og immunblotting. Som kontrol vi medtaget normale embryonale diploid fibroblast (NHDF). Blandt de kolorektale cancercellelinjer, blev Survivin fundet i detergent-opløselige fraktioner selvom ekspressionsniveauerne varierede betydeligt (figur 5A). Efterfølgende blev anoikis-følsomhed undersøgt i alle cancercellelinier (figur 5B). Selvom størrelsen af ​​bidraget fra Survivin til anoikis resistente fænotype i kolorektale cancerceller er udefineret, er der en direkte sammenhæng mellem højere ekspressionsniveauer af vaskemiddel-opløselige cytoplasmatisk Survivin og anoikis modstand især for HCT116 og HT29-celler med højeste udtryk for rengøringsmiddel opløselige fraktion af cytoplasmaet. Bemærkelsesværdige, NHDF, LoVo og SW480 celler, hvor detergent-opløselig Survivin ikke var påviselig viste massiv celledød efter induktion af anoikis.

A. Subcellulær fraktionering og immunoblotanalyse af Survivin. Cellelysatet fra eksponentielt voksende celler blev fraktioneret i detergent-opløselige cytoplasmatisk (

C

), og nukleare (

N

) fraktioner og vaskemiddel-uopløselige pellet (

P

) fraktion til immunoblotanalyse med anti-survivin, anti-α-tubulin, anti-H3-histon, og anti-β-actin. Vaskemidlet opløselige cytoplasmatiske Survivin niveau blev estimeret ved immunoblotanalyse, og udtrykt i procent af niveauet for 8505C, som er udifferentieret thyreoideakarcinom viser anoikis modstand (+++, 80%; ++, 40-80%; +, 10-40%, -, 10%). B. anoikis modtagelighed i i kolorektale cancerceller. Celler blev suspenderet i serumfrit medium i 72 timer. Cellernes levedygtighed blev bestemt ved WST-1 analysen.

Hvilke biologiske adfærd i kolorektal cancer er relateret til vaskemiddel-opløselige cytoplasmatisk Survivin er vigtig for deres diagnostiske eller terapeutiske disponible. I vores tidligere immunhistokemiske analyser af kolorektal cancer væv, har fraværet af nukleare Survivin og eksistensen af ​​cytoplasmatisk Survivin fundet at være væsentlige prædiktorer for mortalitet i kolorektal cancer patienter [42]. Men analysen af ​​den immunhistokemiske lokalisering og den subcellulære fraktionering detektion, er ikke den samme. Fem prøver af normal og tilsvarende primære cancervæv fra de samme patienter blev undersøgt ved subcellulære fraktioneringstrin eksperimenter, men uanset niveauerne af Survivin overekspression, sagerne positive til påvisning af detergent-opløselige cytoplasmatisk Survivin var patienter med lymfeknude og andre fjerne metastaser. Her blev andre fyrre undersøgte sager. Omridset af påvisningsmetoden blev illustreret i figur S2. Figur 6 viser en typisk resultater fra to patienter med eller uden detergent-opløselige cytoplasmatisk Survivin i primære cancervæv (tilfælde A er en patient uden metastase og sag B er en patient med metastase). Klinisk-patologisk betydning af detergent-opløselig cytoplasmatisk Survivin ekspression blev bestemt for de fyrre tilfælde. De positive sager blev øget betydeligt i tumorstørrelse ( 0,005), primær kolorektal cancer med lymfeknude metastaser ( 0,001), og primær kolorektal cancer med fjernmetastaser ( 0,01) sammenlignet med de negative sager (tabel 1) .

oultline af metoden blev illustreret i figur S6. Normal og Kræft væv fra humane patienter med tarmkræft uden metastaser (

Case A

) eller med metastaser (

Case B

) blev lyseret. Cellelysatet blev fraktioneret i vaskemiddel-opløselige cytoplasmatisk (

C

), og nukleare (

N

) fraktioner og vaskemiddel-uopløselige pellet (

P

) fraktionen for immunoblotanalyse med anti-Survivin, anti-α-tubulin, anti-H3-histon, og anti-β-actin.

diskussion

i dag er det enstemmigt accepteret, at Survivin er en vigtig del af CPC regulerer chromomal adskillelse og cytokinese [2] selv om de nøjagtige roller Survivin i mitose stadig ikke fuldt forstået. Celler med nedsat funktion af Survivin eller en af ​​dets partnere på grund af RNAi-medieret hæmning eller udtryk af dominerende-negative mutanter viste sammenlignelige fænotyper (dvs. forstyrret segregering af kromosomer og defekte cytokinese) [25], [26], [28] , [43], [44], [45]. Endvidere fænotyper af survivin knock-out mutanter i gær [46], [47] og

C. elegans

[48], [49] bekræftede rolle Survivin som CPP. I hvirveldyr, har den vigtige rolle, Survivin under mitose blevet demonstreret i

Xenopus laevis

[3] og mus [50]. På den anden side, forskellige undersøgelser afslørede en anti-apoptotiske funktion Survivin i forskellige arter og cellelinier. Anti-apoptotiske virkninger af Survivin og den Survivin-lignende protein Deterin blev rapporteret i gær [51] og

D. melanogaster

[52], hhv. Alligevel kan overekspression af Survivin fungere som en anti-apoptotisk faktor, selv i ikke-hvirveldyr under visse betingelser, men det synes tænkeligt, at de Survivin-knockout fænotyper, der blev tolket som tab af anti-apoptotiske funktion kan være primært knyttet til liberaliserede mitoseprocesser .

i dyrkede cellesystemer, en øget apoptotisk modtagelighed, der udkom spontant eller ved apoptotiske agenter, der følger af tab af funktion eller knock-down af Survivin. Survivin knock-out i en T-celle afstamning inducerede p53-afhængige fænotyper, hvilket resulterer i thymocyt udviklingsmæssige defekt [53]. Denne fænotype kunne ikke reddes ved inaktivering af p53, hvilket antyder, at Survivin sandsynligvis er en anti-apoptotisk faktor, uanset p53-status. I normale humane fibroblaster, Survivin knock-down også induceret p53 induktion, hvilket udløste cellecyklusstop uden øjeblikkelig apoptose [54]. Denne fænotype blev reddet ved inaktivering af p53, hvilket antyder, at Survivin er tilbøjelige til at arbejde via p53 under adhærerende kultur tilstand. Disse forskellige resultater er tilsløre oplysninger for forståelsen Survivin-induceret beskyttelse mod apoptose. De forskellige celletyper, adhærente celler og ikke-adhærente celler, er forskellige i p53-induceret fænotyper. Ikke-adhærente celler med normal p53 prædisponere til cellulær stress-induceret øjeblikkelig apoptose [55], såkaldte interfase celledød, sammenlignet med adhærente celler, mens adhærerende celler med p53 primært standse cellecyklussen [56], [57]. Survivin knock-out inducerer p53 i både adhærente og ikke-adhærente celler, derfor udtrykker fænotyper for hver type af cellerne. I vores hypotese, der er understøttet af vores undersøgelse, Survivin er fortrinsvis inhibering anoikis i celler udsat for forankringsafhængige overlevelse og vækst uanset p53-status.

Når de udsættes for det DNA-ødelæggende middel etoposid, Survivin bankede-out DT40 celler viste normal følsomhed overfor dette middel [29]. Dataene antydede, at Survivin er ikke en universel inhibitor for DNA-ødelæggende middel-induceret apoptose. Her observerede vi normale følsomheder til IR- og UV-C i Survivin-overekspression CHE-p53 – /- celler. Efter vores mening ville Survivin har vigtige roller i anoikis undertrykkelse for udvikling af kræft (se nedenfor).

På linje med tidligere rapporter, viser vi her, at Survivin regulerer caspase-3 aktivitet. Det er blevet rapporteret, at Survivin inhiberer caspase-3 aktivering i fysiologiske situationer under apoptose, men denne effekt er sandsynligvis ikke skyldes direkte inhibering af caspase-3 [58], [59], [60]. den præcise anti-apoptotisk mekanisme Survivin stadig dermed en udfordring. To mekanismer er blevet foreslået til at redegøre for inhibering af mitokondrier-regulerede apoptose resulterer i caspase-3-aktivering. Den mest undersøgte molekyle for dette er et pro-apoptotisk protein Smac /DIABLO, hvortil Survivin binder direkte [34]. En Smac /DIABLO-medieret interaktion med Survivin at undertrykke anoikis forekommer usandsynligt, eftersom i vores eksperimentelle omgivelser kun lidt eller ingen ekspression af Smac /DIABLO under anoikis af CHE-celler blev påvist (figur 3). Den anden mekanisme hvordan Survivin opfylder sin IAP funktion er en direkte binding til XIAP [36].