PLoS ONE: caveolin-1-Enhanced motilitet og Focal Vedhæftning Omsætning Kræv Tyrosin-14, men ikke Ophobning til Rear i metastatisk kræft Cells

Abstrakt

caveolin-1 er kendt for at fremme celle migration og øget caveolin -1 ekspression er associeret med tumorudvikling og metastase. I fibroblaster, caveolin-1 polarisering og phosphorylering af tyrosin-14 er afgørende for at fremme migration. Imidlertid forbliver den rolle, caveolin-1 i migration af metastatiske celler dårligt defineret. Her blev caveolin-1 deltagelse i metastatisk cellemigrering evalueret ved shRNA målretning af endogent caveolin-1 i MDA-MB-231 humane brystkræftceller og ektopisk ekspression i B16-F10-musemelanomceller. Udtømning af caveolin-1 i MDA-MB-231-celler reduceret, mens ekspression i B16-F10-celler fremmes migration, polarisering og fokal adhæsion omsætning i en sekvens af begivenheder, der involverede phosphorylering af tyrosin-14 og Rac-1-aktivering. I B16-F10-celler, ekspression af et ikke-phosphorylatable tyrosin-14 til phenylalanin mutant undladt at rekapitulere de observerede med vildtype-caveolin-1 virkninger. Alternativt giver behandling af MDA-MB-231 celler med Src-familien kinase inhibitor PP2 reduceret caveolin-1 phosphorylering på tyrosin-14 og cellevandring. Overraskende, i modsætning til fibroblaster, caveolin-1 polarisering og re-lokalisering til bagkanten blev ikke observeret i migrerende metastatiske celler. Således udtryk og phosphorylering, men ikke polarisering af caveolin-1 favør den meget mobile fænotype af metastatiske celler

Henvisning:. Urra H, Torres VA, Ortiz RJ, Lobos L, Díaz MI, Díaz N, et al . (2012) caveolin-1-Enhanced motilitet og Focal Vedhæftning Omsætning Kræv Tyrosin-14, men ikke Ophobning til Rear i metastatisk kræftceller. PLoS ONE 7 (4): e33085. doi: 10,1371 /journal.pone.0033085

Redaktør: Burton B. Yang, University of Toronto, Canada

Modtaget: April 7, 2011; Accepteret: 9. februar 2012; Udgivet: April 10, 2012 |

Copyright: © 2012 Urra et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Fondo de Financiamiento de Centros de Excelencia en Investigación # 15010006 (til AQ), nationale fond for videnskabelig og teknologisk udvikling (FONDECYT) # 1.110.149 (til L. Leyton), FONDECYT # 1.090.071 (til AQ), Biomedicinsk Neuroscience Institute P09 -015-F fra Iniciativas Científicas Milenio (til L. Leyton og SH), Fogarty International Research Collaboration Award-National Institutes of Health 5R03TW007810 (til L. Leyton), nationale Kommission for Videnskab og Teknologi (CONICYT) # 79.090.021 “Indsættelse af Young postdoc Forskninger i Academy “(til VT), FONDECYT Indledning # 11.100.287 (til VT) og CONICYT ph.d.-stipendier (til HU, ND, RO, MID og L. Lobos). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cell migration er afgørende i en lang række biologiske processer, herunder fosterudvikling, vævsreparation og regenerering, samt begivenheder associeret med sygdomme som arthritis, atherosklerose og tumorcellemetastase [1]. Oprindeligt celler reagerer på eksterne signaler (såring, kemokiner og vækstfaktorer) ved omlægning af mikrotubulus organisere centrum (MTOC) og Golgi mod forkanten (cellepolarisering trin) [2]. Derefter celler strækker bred (

lamellipodia

) og spike-lignende fremspring (

filopodia

) i en proces, der følges af fokal adhæsion (FA) dannelse, cellelegemet sammentrækning og endelig tilbagetrækning af bageste ende ved adskillelsesorgan FA’er [3]. Mange af disse begivenheder er arrangeret af Rho familie af små GTPaser, som omfatter RhoA, Rac1 og Cdc42. Signaler, som aktiverer Rho GTPaser føre til Spatiotemporal regulering af FA montage, dynamik og omsætning [4], [5].

Mange proteiner, herunder PI3K, PTEN [6], Rho-GTPaser [4], [7] og caveolin-1 [8], [9], er blevet vist at omfordele hele cellen under polariseret migration. Caveolin-1 er af særlig interesse, da det er kendt for at fremme celle migration [10], invasion [11], [12], [13] og foreslås at være involveret i tumorcellemetastase (revideret i [14], [ ,,,0],15]).

caveolin-1 er en integreret membranprotein involveret i caveolae biogenese, cholesterolhomeostase, intracellulær handel og signaltransduktion, blandt andre funktioner (revideret i [15]). Den præcise rolle caveolin-1 i tumorigenese stadig anledning til intens debat, og om proteinet virker som en tumor suppressor eller som en promotor for metastaser synes at være celletype og kontekstafhængig [14], [15]. Således i kræftmodeller herunder prostata, bryst og tyktarm, er caveolin-1-ekspression vides at være opreguleret og protein niveauer korrelerer med tumorprogression og metastase [15]. I overensstemmelse med en rolle i metastase, caveolin-1 blev rapporteret at øge celle migration og invasionsevne [11], [12], [16], [17]. Men den rolle caveolin-1 under celle migration har været det meste kendetegnet ved ikke-metastatiske celler. For eksempel, i muse embryonale fibroblaster (MEF’er), caveolin-1-fremmet cellemotilitet involveret celle polarisering og øget hastighed og persistens af cellemigrering [18]. Desuden caveolin-1 formindsker Rac1 og Cdc42, men øger RhoA aktivitet ved at inhibere Src /p190RhoGAP signalvejen [10], [18]. Interessant nok caveolin-1 selv akkumulerer på bagsiden af ​​migrerende fibroblaster, neuroner og endotelceller i 2D modeller [19], [20], [21], men i transmigrating endotelceller og neuroner, caveolin-1 fortrinsvis akkumulerer i cellen foran [20], [22]. Caveolin-1-afhængig cellevandring og akkumulering på bagsiden af ​​MEF’er kræver aminosyresekvensen 1-60, som omfatter et formodet N-terminal caveolin-1 polarisering domæne [21], [23].

Caveolin- 1 stabiliserer fokal adhæsionkinase (FAK) ved FA’er ved at formindske shuttling mellem FA’er og cytosoliske pools, som vist ved hjælp af fluorescens bedring efter fotoblegning analyse af den mobile del. Siden FAK, og mere specifikt phospho-Y397-FAK, er kendt for at forbedre FA omsætning blev caveolin-1 foreslået at deltage i reguleringen af ​​denne proces [24]. Faktisk viste efterfølgende undersøgelser, at caveolin-1-afhængig stabilisering af FAK, cellemigration og invasion involverede Src /Rho /ROCK akse samt phosphorylering af caveolin-1 på tyrosin-14 [11]. Snarere intriguingly, caveolin-1 viste sig også at øge stabiliteten af ​​spirende FA’er (eller fokale kontakter) og RhoA-aktivering [18]. Salg

Interessant Src-kinase-medieret phosphorylering af caveolin-1 på tyrosin-14 vises at være essentiel for caveolin-1-drevet cellemigrering. I metastatiske brystcancerceller (MDA-MB-231), er caveolin-1 højt udtrykt og phosphorylerede på tyrosin-14, i sammenligning med ikke-metastatiske cancerceller [11]. Selv om de foreløbige undersøgelser antydet en formodet rolle for caveolin-1 phosphorylering på tyrosin-14, forbliver kontroversielle spørgsmål angående den præcise inddragelse af phospho-caveolin-1 i adhæsionskomplekser med den ekstracellulære matrix [25]. Vigtigst er dog, rolle caveolin-1 i migration af metastatiske celler kræver yderligere undersøgelser med henblik på at forstå, hvordan dette protein kan bidrage til processer som metastaser.

I denne undersøgelse vi specifikt undersøgt rolle caveolin -1 i metastatisk cellemigrering ved anvendelse af to forskellige modeller: MDA-MB-231 humane brystcancerceller og muse melanomacellelinie B16-F10. I begge cellelinier, caveolin-1 fremmet cellemigration ved at øge FA omsætning, polarisering, hastighed, persistens og retningsbestemmelse. Disse funktioner af caveolin-1 blokeres for alt ved at interferere med phosphorylering på tyrosin-14, som vist ved farmakologisk inhibering og mutationsanalyse. Interessant nok i begge metastatiske celle modeller, caveolin-1 lokalisering til cellen bag ikke var forpligtet til at fremme migration.

Resultater

caveolin-1 akkumulerer på bagkanten af ​​Migrering MEF-3T3 og DI-TNC1 celler, men ikke Metastatisk MDA-MB-231 og B16-F10 celler

Tidligere undersøgelser har vist, at caveolin-1 akkumulerer på bagsiden af ​​migrerende celler, herunder MEF’er, HUVEC’er og neuroner [19], [ ,,,0],20], [21]. Vi søgte at udvide disse observationer til hurtigt migrerende metastatiske celler, ved at vurdere lokalisering af caveolin-1 i en sårhelende assay efterfulgt af immunfluorescens analyse. Den humane brystcancer-cellelinie MDA-MB-231 og DI-TNC1, samt MEF-3T3-celler, alle udtrykte høje endogene niveauer af caveolin-1 (figur 1A). Uventet caveolin-1 mislykkedes at akkumulere på bagsiden af ​​MDA-MB-231 celler under overgangen til det sårede område (figur 1B). Efter aftale med tidligere rapporter [8], [9] blev polarisering af caveolin-1 detekteret i MEF-3T3 fibroblastceller, såvel som i astrocytiske DI-TNC1 celler (Figur 1B). For at vurdere omfanget af caveolin-1 polarisering blev fluorescensintensiteter på bagsiden og fronten kvantificeret i diskrete zoner ved hjælp af

billede J

software og den bageste /forreste nøgletal er beregnet på forskellige tidspunkter af migration, som tidligere beskrevet [21], [23]. For både MEF-3T3 og DI-TNC1, men ikke MDA-MB-231-celler, blev tidsafhængige stigninger i caveolin-1 polarisering detekteres, hvorved ophobning bagtil var næsten fuldstændig efter 360 minutter for migration (figur 1C). Manglende caveolin-1 polarisering i MDA-MB-231-celler kunne ikke tilskrives høje endogene ekspressionsniveauer i disse celler, eftersom det efter shRNA-medieret nedregulering af caveolin-1, rest caveolin-1 mislykkedes at polarisere i disse celler ved migration (se tekst nedenfor, Figur 2A, 2B og 2C).

(A) Total proteinekstrakter fra DI-TNC1, MEF-3T3 og MDA-MB-231-celler blev separeret ved SDS-PAGE (35 pg totalt protein pr bane) og analyseret ved Western blotting med antistoffer mod caveolin-1 og β-actin. (B) Sammenflydende monolag af DI-TNC1, MEF-3T3 og MDA-MB-231-celler blev såret med en pipettespids og fastsat til 0 (venstre felt) og 60 minutter (højre panel) efter monolag skade. Celler blev farvet med et kanin polyklonalt anti-caveolin-1-antistof efterfulgt af et anti-kanin IgG-antistof (grøn) og kerner blev visualiseret med DAPI (blå). Det første lag af celler overfor sårede område er adskilt fra resten af ​​en hvid streg. Scale bar, 20 pm. (C) caveolin-1 fordeling blev vurderet ved måling af fluorescensintensiteten i fire tilfældigt udvalgte områder af ens dimensioner ved forenden og bagenden af ​​cellen med

Billede J

software, som beskrevet detaljeret i Materialer og metoder . Data viser forholdet mellem fluorescensintensiteten “for /bag” (gennemsnit ± SEM, n = 3). Statistisk signifikante forskelle sammenlignet med tiden 0 minutter til hver celletype er angivet (**, P 0,01; *, P 0,05). (D) B16-F10-celler transficeret med enten pLacIOP (mock) eller pLacIOP-caveolin-1 (CAV1) behandlet eller ikke med 1 mM IPTG i 24 timer og totale proteinekstrakter blev fremstillet, separeret ved SDS-PAGE (35 ug totalt protein per bane) og analyseret ved Western blotting. (E) Sammenflydende monolag af pLacIOP-caveolin-1 transficerede B16-F10-celler i fravær eller nærvær af 1 mM IPTG blev såret med en pipettespids og fikseret enten på 0 eller 60 minutter efter sårdannelse. Prøver blev farvet med anti-caveolin-1-polyklonalt antistof (grøn) og DAPI (blå). Kanten af ​​såret er skitseret med en hvid streg. Scale bar, 20 pm. (F) caveolin-1 lokalisering blev analyseret på forskellige tidspunkter, som beskrevet i C. data er middelværdien ± SEM fra tre uafhængige forsøg.

For at forlænge vores resultater i MDA-MB-231 celler blev caveolin-1 polarisering også vurderet i mus melanom B16-F10-celler. Disse celler udtrykker lave endogene niveauer, og derfor blev caveolin-1 blev indført ved stabilt transfektion af celler med placIOP plasmid indeholdende et insert, der koder for fuld-længde proteinet. En fordel af dette plasmid er, at den tillader IPTG-inducerbar ekspression [26]. Som vist transfektion med pLacIOP-caveolin-1 (

CAV1 betingelse

) førte til en 5 gange stigning i caveolin-1-niveauer i sammenligning med celler transficeret med tom vektor pLacIOP (

mock betingelse

, figur 1D). Ekspression blev yderligere forøget med 1 mM IPTG ved en anden 5-gange sammenlignet med ikke-inducerede celler (figur 1D). Således blev caveolin-1 lokalisering evalueret i både inducerede (høj ekspression) og ikke-inducerede celler (lav ekspression) upon migration i en sårhelende assay. Som for MDA-MB-231 celler, caveolin-1 undlod at re-lokalisere i migrere B16-F10-celler (Figur 1E) og ophobning på bagsiden blev aldrig observeret på noget tidspunkt i løbet af migration (figur 1F).

tilsammen disse resultater tyder på, at i modsætning til observationer i ikke-metastatiske celler evalueret her (MEF-3T3, DI-TNC1) og i litteraturen [19], [20], [21], caveolin-1 ikke undergår polarisering under migration af metastatiske celler. Da konsekvenserne af en sådan caveolin-1 opførsel for celle migration er ukendte, blev bidrag caveolin-1 til flere migration-associerede karakteristika af MDA-MB-231 og B16-F10 celler evalueret i de følgende eksperimenter.

Cell polarisering er det første skridt kræves for celle migration og retningsbestemt bevægelse. Re-lokalisering af foran kernerne MTOC og bag Golgi er vigtige ved fastlæggelse af retningen af ​​migration [27]. At undersøge, hvilken rolle caveolin-1 i MDA-MB-231-celle polarisering, blev endogent protein nedreguleret af shRNA (shRNA-caveolin-1 # 5) (figur 2A). Som observeret i figur 1, har residual endogen caveolin-1 ikke ophobes på bagsiden af ​​migrerende celler (figur 2B, 2C). , Polarisering af MDA-MB-231 celler med formindsket dog caveolin-1-ekspression blev væsentligt reduceret, som det fremgår af Golgi orientering (figur 2B, 2D, figur S1A, S1B). Kvantitativ analyse viste, at shRNA-medieret nedregulering af caveolin-1 forsinket MDA-MB-231-celle polarisering, idet forskellene var ikke længere signifikant efter 360 minutter (Figur 2D). Som det kunne forudsiges for en dosisafhængig caveolin-1 effekt blev delvist tab af cellepolarisering observeret med en anden shRNA (shRNA-caveolin-1, sekvens # 3) at målrettede caveolin-1 med lavere effektivitet (Figur S1A, fig S1c) . Således caveolin-1 synes at spille en tidlig, men forbigående rolle i polarisering af metastatiske MDA-MB-231-celler. Ligeledes B16-F10 cellepolarisering steg på en tidsafhængig måde ved migration til en sårede område og antallet af polariserede celler var væsentligt højere i caveolin-1-udtrykkende celler efter IPTG-induktion (fig 2E, 2F, figur S2). En mindre stigning i celle polarisering blev observeret i lav caveolin-1-udtrykkende celler (ingen IPTG induktion) sammenlignet med mock kontrol (figur 2F). Disse resultater indikerer, at i både B16-F10 muse melanom og MDA-MB-231 humane brystcancerceller, caveolin-1 fremmer celle polarisering på en måde, som ikke kræver caveolin-1 akkumulering på cellen bag.

(a) Samlet proteinekstrakter blev fremstillet ud fra både forældrenes MDA-MB-231 og celler stabilt transduceret med en kontrol shRNA målrettet luciferase (sh-ctrl) eller en shRNA målrettet caveolin-1 (shRNA-caveolin-1 # 5, sh-CAV1 ). Ekstrakter blev separeret ved SDS-PAGE (35 ug totalt protein per bane) og analyseret ved Western blotting med antistoffer mod caveolin-1 og β-actin. (B) Konfluente monolag af forældremyndigheden, shRNA-kontrol (sh-ctrl) eller shRNA-caveolin-1 (sh-CAV1) behandlet MDA-MB-231 celler blev såret med en pipettespids og fastsat til 0 (venstre panel) og 60 minutter (højre panel) efter monolag skade. Prøverne blev farvet med anti-caveolin-1 (grøn) og anti-Golgin-97 (rød) antistoffer, mens kernerne blev farvet med DAPI (blå). Det første lag af celler overfor sårede område er adskilt fra resten af ​​en hvid streg. Scale bar, 20 pm. (C) caveolin-1 lokalisering blev analyseret som beskrevet i figur 1C, ved at måle forholdet mellem fluorescensintensiteten “for /bag”. Data er middelværdien ± SEM, n = 3. (D) polarisering af både parentale (-) og shRNA behandlet MDA-MB-231-celler med shRNA-luciferase (sh-ctrl) eller shRNA-caveolin-1 (sh-CAV1) blev målt ud fra (C) som beskrevet i Materialer og metoder, ved at analysere det ydre lag af celler vender de sårede område (B). Procentdelen af ​​polariserede celler blev evalueret ved 0, 60 og 360 minutter efter sårdannelse. Data blev beregnet som gennemsnit af tre uafhængige forsøg (gennemsnit ± SEM). * Sammenligning med kontrol shRNA P 0,05. (E) B16-F10-celler transficeret med enten pLacIOP (mock) eller pLacIOP-caveolin-1 (CAV1) blev behandlet eller ikke med 1 mM IPTG i 24 timer, dyrkes i monolag og såret med en pipettespids for at tillade migration for 1 timer. Prøver blev farvet med anti-Gigantin-1-polyklonalt antistof (blå), phalloidin-Alexa488® (grøn) og propidiumiodid (rød). Det ydre lag af celler overfor sårede område er skitseret med en hvid streg. (F) Cell polarisering blev målt som beskrevet i Materialer og metoder, ved at analysere det ydre lag af celler overfor sårede område. Procentdelen af ​​polariserede celler blev evalueret 0-360 minutter efter sårdannelse monolaget. Data blev beregnet som gennemsnit af tre uafhængige forsøg (gennemsnit ± SEM). Statistisk signifikante forskelle sammenlignet med pLacIOP-transficeret B16-F10 (mock) celler er vist (**, P 0,01 på tid 360 min; *, P 0,05 på tid 60 min)

caveolin. -1 Fremmer migration af metastatiske celler

rolle caveolin-1 i celle migration er kontroversiel og synes at være celle-kontekst afhængig, da det er blevet beskrevet både som en positiv [18], [19] og negativ regulator af migration [28], [29], [30]. I disse undersøgelser overvejende fibroblaster og endotelceller blev karakteriseret. Evaluerede vi således effekten af ​​caveolin-1 i migration af metastatisk MDA-MB-231 og B16-F10-celler. I begge tilfælde caveolin-1-ekspression stillede migration, som observeret i en Boyden Chamber assayet (figur 3A, 4A) og efter analyse ved time-lapse video mikroskopi kombineret med individuel celle sporing (figurerne 3B, 4B). Caveolin-1 nedregulering i MDA-MB-231 celler ved shRNA faldt track længde og retningsbestemmelse af migration sammenlignet med forældre- og kontrol celler (figur 3B). Dataene støtter tanken om, at caveolin-1 tilstedeværelse i disse celler favoriserer vedvarende celle migration. Faktisk caveolin-1 nedregulering nedsat cellemigration associerede parametre, herunder pulverkaffe (figur 3C) og gennemsnitlig hastighed (figur 3D), persistensen (opnået som forholdet mellem nettet og samlede afstand, figur 3E) og retningsbestemmelse af migration (udtrykt som procentdelen af ​​celler, der bevæger sig inden for et 60 ° vinkel fra udgangspunktet) (figurerne 3B, 3F). Lignende resultater blev opnået i B16-F10-celler, hvor caveolin-1-ekspression øgede transmigration i et Boyden Chamber assayet (figur 4A) og migration i en sårhelende assay (figur 4B), samt øjeblikkelig og gennemsnitlig hastighed, persistens og retningsbestemthed af migration (figur 4C, fig S3). Disse data er i overensstemmelse med tidligere observationer i MEF-3T3-celler [10], [11], [18] og foreslår, at caveolin-1 modulerer migrering af metastatisk MDA-MB-231 og B16-F10 celler, men gør det selv i fravær af ændringer i intracellulær fordeling.

(a) Migration af MDA-MB-231-celler behandlet med shRNA målretning enten luciferase (sh-ctrl) eller caveolin-1 (sh-CAV1) blev vurderet i en Boyden kammer assay. Celler (5 x 10

4) blev podet på fibronectincoatede (2 ug /ml) transwell-plader og fik lov til at migrere i 2 timer. Celler, som migrerede til undersiden blev detekteret med krystalviolet-farvning (middelværdi ± SEM, n = 3). ** P 0,01. (B) Parental og shRNA behandlet MDA-MB-231 celler blev dyrket som sammenflydende monolag, sårede med en pipettespids og migration blev indspillet af time-lapse video mikroskopi (i alt 15 timer, 12 minutter ramme interval). Cell numre blev bestemt ved hjælp af

billede J

software (

“Manuel Tracking”

plug-in). Spor af enkelte celler ved den sårede kant er vist (øvre panel). Kanten af ​​såret er angivet med en hvid streg. Encellede spor er vist i et kartesisk koordinatsystem for hver celletype (nederste panel). (C) Øjeblikkelig hastighed blev analyseret for hver celletype i (B) og afbildet som en funktion af tid (0-15 timer). (D) Mean hastighedsværdier blev opnået fra (C) og afbildet for hver celletype. (E) Vedholdenhed migration blev beregnet som forholdet mellem netto distance og den samlede afstand af migration i (B). Gennemsnitlige værdier blev opnået for forældrekontrol, sh-ctrl og SH-CAV1 celler (gennemsnit ± SEM). (F) Direktionalitet af migration blev opnået fra analysen vist i (B), underpanel. Spor, der lå inden for en 60 ° vinkel i forhold til retningen af ​​cellebevægelse blev anset orienteret (skraveret område). Procentdelen af ​​celler med orienterede spor blev beregnet og afbildet (middelværdi ± SEM, n = 3). * P. 0,05

tyrosinphosphoryleringen på caveolin-1 er påkrævet for Migration af metastatiske celler

caveolin-1 gennemgår Src-medieret fosforylering på tyrosin-14, som menes at være væsentlig for fibroblast cellemigrering [18]. Inddragelsen af ​​phosphorylering af caveolin-1 på tyrosin-14 til at fremme cellevandring støttes yderligere af observationer i brystcancer-cellelinier, herunder MDA-MB-231-celler [11]. Således evalueret vi rollen som tyrosinphosphorylering i B16-F10 melanoma cellelinie. Interessant, ekspression af ikke-phosphorylatable caveolin-1 (mutant Y14F) undlod at fremme B16-F10 cell migration (figur 4A, 4B). Selvom Y14F mutanten ikke blev udtrykt i samme grad som vildtype-proteinet, er det usandsynligt, at en sådan differentieret ekspression udgør manglende evne af dette protein til at fremme cellevandring (figur 4A), da det for en population af B16F10 (caveolin-1) celler (klon 3) med samme grad af caveolin-1 til dem fundet i caveolin-1 (Y14F) celler (se figur S3), vandringshastigheder svarede til dem, detekteres ved den oprindelige population af B16F10 (caveolin-1) celler (figur 4A). Video mikroskopi-analyse viste, at spor af mock kontroller og caveolin-1 (Y14F) celler var kortere end de, der opnås fra celler, der udtrykker vildtype caveolin-1 (figur 4B). Derudover migration var mere tilfældige i celler der mangler caveolin-1 eller udtrykker caveolin-1 (Y14F) og parametre for gennemsnitlig hastighed, udholdenhed og retningsbestemmelse af migration var lavere i caveolin-1 (Y14F) celler sammenlignet med celler, der udtrykker vildtype caveolin -1 (figur 4C). Disse resultater indikerer, at caveolin-1 fremmer cellemigration i B16-F10-celler ved at øge celle polarisering, hastighed, udholdenhed og retningsbestemmelse af cellebevægelse og at evnen til at gøre det afhænger af tilstedeværelsen og formentlig phosphorylering af tyrosin-14.

(A) B16-F10-celler transficeret med pLacIOP (mock) blev pLacIOP-caveolin-1 (WT) eller pLacIOP-caveolin-1 /Y14F mutant (Y14F) behandlet med 1 mM IPTG i 24 timer. Derefter blev cellemigrering vurderet i et Boyden kammer assay ved at pode celler (5 x 10

4) på ​​fibronectincoatede (2 ug /ml) transwell-plader og tillader migration i 2 timer. Celler, som migrerede til undersiden blev detekteret ved krystalviolet-farvning (middelværdi ± SEM, n = 3). * P 0,05. Bundpaneler viser samlede proteinekstrakter, adskilt ved SDS-PAGE (35 ug totalt protein per bane) og analyseret ved Western blotting. Tal under paneler indikerer relative caveolin-1-niveauer (caveolin-1 /WT = 22,0 ± 1,8, caveolin-1 /Y14F = 16,6 ± 3,8; værdier sammenlignet med den mock tilstand og opnået som gennemsnit fra tre uafhængige målinger ± SEM). (B) Konfluerende monolag af B16-F10 celler transficeret med pLacIOP (mock), pLacIOP-caveolin-1 (WT) eller pLacIOP-caveolin-1 /Y14F (Y14F) blev såret med en pipettespids og registreres af time-lapse video mikroskopi i 10 timer (12-min rammeinterval). Cell spor blev bestemt som angivet i fig legende 3B. Spor af enkelte celler ved den sårede kant er vist (øvre panel). Kanten af ​​såret er skitseret af en hvid streg. Encellede spor er vist i et kartesisk koordinatsystem for hver celletype (nederste panel). (C) Middelværdien hastighed (um /min) blev afledt fra den foreliggende hastighed (fig S3), som beskrevet i (D). Vedholdenheden og retningsbestemmelse af migration blev opnået som beskrevet i figur 3E og 3F, hhv. De viste data er middelværdier ± SEM (n = 3). * P. 0,05

Data opnået i B16-F10-celler blev yderligere bekræftet af farmakologisk hæmning af SRC familien kinaser, der phosphorylerer caveolin-1 på tyrosin-14 [31]. Cellevandring og phosphorylering af caveolin-1 blev vurderet i nærvær eller fravær af den selektive Src-kinase inhibitor, PP2 (4-amino-5- (4-chlorphenyl) -7- (dimethylethyl) pyrazolo [3,4-d] pyrimidin ), i begge MDA-MB-231 og B16-F10 celler. Serumstimulering steg sårlukning i både MDA-MB-231 og B16-F10-celler. Sårlukning blev moduleret af caveolin-1-ekspression, som shRNA medieret nedregulering i MDA-MB-231-celler faldt (figur 5A, histogram søjler), hvorimod ektopisk ekspression i B16-F10-celler forøgede sårlukning (figur 5B, histogram søjler) . Vigtigere, behandling med PP2, men ikke kontrol vehikel (dimethylsulfoxid, DMSO) forhindrede caveolin-1-forstærket sårlukning i både MDA-MB-231 (figur 5A) og B16-F10-celler (figur 5B). Desuden har både endogen og ektopisk udtrykte caveolin-1 ikke undergå phosphorylering i nærværelse af denne inhibitor (figur 5A, 5B, Western blots). Det skal bemærkes, at lille pY14-caveolin-1 var detekterbar i mock-transficerede B16-F10-celler, formodentlig fordi endogene niveauer af caveolin-1 var for lave. Vigtigere, blev ingen signifikante ændringer i proliferation observeret for begge cellelinier i nærvær af inhibitoren (data ikke vist). Disse resultater er i overensstemmelse med den ide, at evne caveolin-1 at øge metastatisk celle migration afhænger tyrosin-14 phosphorylering med Src familie kinaser.

MDA-MB-231 celler stabilt transduceret med shRNA enten målrette Luciferase ( sh-ctrl) eller caveolin-1 (sh-CAV1) blev præinkuberet med DMSO (D) eller 10 pM PP2 i 30 minutter, såret med en pipettespids, stimuleret (+) eller ikke (-) med 3% af serum og billeder blev optaget ved 0 og 16 timer efter sårdannelse. De sårede område blev målt med

billede J

software og procentdelen af ​​sårlukning blev plottet (øverste panel). Totale proteinekstrakter blev fremstillet og analyseret ved Western blotting med antistoffer mod caveolin-1, pY14-caveolin-1 og actin. (B) Sammenflydende monolag af B16-F10-celler transficeret med enten pLacIOP eller pLacIOP-caveolin-1 blev præinkuberet med 1 mM IPTG i 24 timer. Derefter blev celler behandlet med DMSO (D) eller PP2, såret med en pipettespids, stimuleret med 3% af serum og analyseret ved 0 og 7 timer efter sårdannelse, som beskrevet i (A). Totale proteinekstrakter blev fremstillet og analyseret ved Western blotting. Værdier i (A) og (B) blev midlet fra 3 uafhængige eksperimenter (gennemsnit ± SEM). * P. 0,05

caveolin-1 Fremmer Focal Vedhæftning Omsætningen i metastatiske celler

caveolin-1 reducerer shuttling af FAK mellem fokal vedhæftning og cytosoliske pools, hvilket tyder på en rolle for caveolin -1 i omsætningen af ​​FA’er [24]. Vigtigst er cellemigration tæt reguleret på niveau med FA omsætning [32], [33]. Vi evaluerede således effekten af ​​caveolin-1 på FA omsætning i metastatiske cancerceller ved transfektion med GFP-vinculin efterfulgt af time-lapse videomicroscopy analyse. GFP-vinculin var forbundet med FA’er både mock og caveolin-1 udtrykker B16-F10-celler (figur 6A). Selv om en lille procentdel af den samlede FA’er undergik omsætningen i B16-F10-celler (5-10% af den samlede FA’er), blev en betydelig stigning i kinetikken for FA demontering observeret i caveolin-1-udtrykkende celler sammenlignet med mock kontrol (figur 6A , pile, figur 6B, øverste graf). Vigtigt er det, udtryk for caveolin-1 forøget omdrejningspunkt kontakt (FC) levetid (figur 6A, pilespidser, 6B, nederste graf) efter aftale med tidligere bemærkninger [18]

(A) B16-F10 celler transficeret. med pLacIOP (mock) eller pLacIOP-caveolin-1 (CAV1) blev transficeret med pEGFP-vinculin i 24 timer, podet på fibronectincoatede dækglas (2 ug /ml) og dyrket i nærvær af 1 mM IPTG i 24 timer (se Materialer og metoder). Derefter blev cellerne serum-udsultet i 4 timer, pulseret med 10% serum og registreres af time-lapse video mikroskopi i 60 minutter (1-min rammeinterval). Zoomet områder vises på udvalgte tidspunkter for mock og CAV1 celler. Focal sammenvoksninger (FA, pile) og repræsentationer kontakter (FC, pilespidser) blev defineret af størrelse. Billeder er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter. (B) Kinetik af Fas og FCS målt fra forsøg er vist i A. FA adskillelse og FC levetid blev målt i mindst 6 strukturer pr eksperiment (middelværdi ± SEM, n = 3). * P 0,05. (C) B16-F10 mock eller CAV1 celler podedes på fibronectincoatede dækglas (2 ug /ml), dyrket i nærvær af 1 mM IPTG i 24 timer og behandlet med 10 pM nocodazol i serumfrit medium i 4 timer. Derefter nocodazol blev fjernet ved udvaskning med serum-frit medium, og cellerne blev inkuberet ved 0-20 minutter ved 37 ° C. Efterfølgende blev cellerne fikseret og farvet med anti-vinculin antistof (rød) og DAPI (blå) til at mærke FA’er og kerner, henholdsvis. (D) FA’er blev kvantificeret fra forsøg, der er beskrevet i (C) ved hjælp af

billede J

software. Mindst 10 billeder pr tidspunkt blev analyseret. Data blev beregnet som gennemsnit af tre uafhængige forsøg (middel ± SEM, n = 3). (E) B16-F10 mock (-), CAV1 (WT) eller CAV1 /Y14F (Y14F) -celler blev behandlet med 10 pM nocodazol, som beskrevet i figur 6C. Nocodazol blev efterfølgende udvasket i 60 minutter og FA’er blev analyseret med et anti-vinculin antistof (rød) og kerner med DAPI (blå). FA’er blev kvantificeret som i (D). Data er repræsentative fra tre uafhængige forsøg (gennemsnit ± SEM). * P 0,05. (F) MDA-MB-231-celler stabilt transduceret med shRNA enten målretning Luciferase (sh-ctrl) eller caveolin-1 (sh-CAV1) blev transficeret med pEGFP-vinculin i 24 timer, serum-udsultet i 4 timer, pulseret med 10 % serum og registreres af time-lapse video mikroskopi, som beskrevet i (A). FA afmontering og FC levetid blev målt i 5 strukturer per eksperiment. Data blev beregnet som gennemsnit af tre uafhængige forsøg (middel ± SEM, n = 3). (G) Focal adhæsion demontering blev målt efter nocodazol fjernelse i MDA-MB-231-celler behandlet med shRNA målretning luciferase (sh-ctrl) eller caveolin-1 (sh-CAV1), som beskrevet i (C) og (D). Data blev beregnet som gennemsnit af 12 målinger (gennemsnit ± SD).