PLoS ONE: Identifikation af gener der påvirker toksicitet af anti-Cancer Drug Bortezomib af Genome Wide Screening i S. pombe

Abstrakt

Bortezomib /PS-341 /Velcade, en proteasominhibitor, er almindeligt anvendt til behandling af myelomatose. Mens flere mekanismer cytotoksiciteten af ​​lægemidlet blev foreslået, den faktiske mekanisme stadig vanskeligt at definere. Vi havde til formål at identificere gener, der påvirker cytotoksicitet Bortezomib i fission gær

S.pombe

da stoffet hæmmer denne organismens celledeling cyklus som proteasom mutanter. Blandt de 2815 gener screenet (dækker 56% af de samlede ORF’er), 19 gener, hvis sletninger fremkalde stærk syntetisk letalitet med Bortezomib, blev identificeret. Produkterne af de 19 gener omfattede fire ubiquitin enzymer og en nuklear proteasom faktor, og 13 af dem er konserveret hos mennesker. Vores resultater vil give nyttige oplysninger til forståelse handlinger Bortezomib inden celler

Henvisning:. Takeda K, Mori A, Yanagida M (2011) Identifikation af gener der påvirker toksicitet af anti-Cancer Drug Bortezomib af Genome Wide Screening i

S. pombe

. PLoS ONE 6 (7): e22021. doi: 10,1371 /journal.pone.0022021

Redaktør: Michael Polymenis, Texas A M University, USA

Modtaget: Marts 16, 2011; Accepteret: 12 Juni 2011; Udgivet: 8 jul 2011

Copyright: © 2011 Takeda et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. KT var støttet af forskningsbevilling på Astellas Foundation for forskning i stofskiftesygdomme (https://www.astellas.com/jp/byoutai/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ubiquitin /proteasom-vejen er en væsentlig proteolytisk maskiner i celler og har afgørende roller i celledelingscyklussen, apoptose, etc [1]. Derfor er denne vej anses for at være et stærkt potentielt mål for klinisk behandling af sygdomme, såsom cancer, og kemikalier, der modulerer aktiviteten af ​​ubiquitin /proteasom-vejen er blevet intensivt undersøgt [2], [3]. Bortezomib /PS-341 /Velcade er et peptid boronsyre, der inhiberer chymotrypsin-lignende aktivitet af beta 5-underenheden af ​​proteasomet

in vitro

. Bortezomib har stærke potentielle anti-tumor effekt i

in vitro

og dyreforsøg og er udviklet som et anti-cancer lægemiddel til behandling af myelomatose og andre kræftformer [3], [4]. Inhibering proteasomet forårsager pleiotropiske virkninger. Derfor har flere mekanismer til cytotoksiciteten af ​​Bortezomib blevet foreslået, ligesom inhibering af anti-apoptotiske proteiner, stabilisering af p53, forstyrrelse af cellecyklusprogression, etc [5]. At øge kendskabet til mekanismerne i de anti-tumor og negative virkninger af Bortezomib, vil det være en fordel at identificere gener, der involverer i cytotoksicitet af dette stof. En pioner indsats for at identificere sådanne gener blev rapporteret af Lightcap gruppe i 2010 [6].

fission gær

Schizosaccharomyces pombe

er en simpel encellet eukaryot og er blevet brugt som model organisme af grundlæggende cellebiologi, på grund af dets genetiske medgørlighed og dets lighed med højere eukaryoter. Et bibliotek af 2815 gen-slettede stammer er til rådighed for genom-dækkende undersøgelser af narkotika følsomhed [7], [8], [9].

Her har vi forsøgt at identificere evolutionært bevarede gener påvirker cytotoksicitet Bortezomib ved at drage fordel af genet-deletion bibliotek i

S. pombe

og etableret en metode til at udføre genom-dækkende syntetisk dødelig screening med Bortezomib. Blandt de 2815 gener screenet, sletning stammer af 19 gener havde stærk syntetisk letalitet med Bortezomib (sådanne gener blev herefter udpeget som syntetisk dødelig med Bortezomib, SLB). Af de 19 SLB generne, er 13 bevaret fra gær til menneske og omfatter faktorer involveret i ubiquitin /proteasom afhængig proteolyse, kromatin lyddæmpning, nuklear /cytoplasmatisk transport, aminosyre og vitamin metabolisme, vesikulær menneskehandel, RNA stofskifte osv

Resultater

mitosestandsning og fiasko i kromosom adskillelse induceret af bortezomib

Vi fandt, at bortezomib (LC Laboratories) effektivt hæmmede spredning af

S. pombe

, mens MG132, en autentisk proteasominhibitoren i pattedyrceller ikke hæmme proliferation (figur S1). Vi derefter undersøgt niveauet af poly-ubiquitineret proteiner i tilstedeværelsen eller fraværet af Bortezomib (figur S1). kulturer log-fase blev høstet efter 0, 4, og 9 timer efter tilsætning af 1 mM Bortezomib og totale proteiner blev ekstraheret i immunoblotanalyse. I nærvær af Bortezomib, poly-ubiquitineret proteiner akkumuleret i en tidsafhængig måde. Vi konkluderede derfor, at Bortezomib effektivt hæmmer cellulær proliferation og proteolytisk aktivitet af proteasomet i

S. pombe

.

Temperatur-følsomme mutanter af proteasom komponenter (

mts3-1

for Rpn12 af 19S lovgivningsmæssige partikel og

mts2-1

for Rpt2 af 19S lovgivningsmæssige partikel ) bliver arresteret på M fase på grund af hæmning af nedbrydning af mitotiske regulatorer som CDC13 (cyklin) [10], [11]. Dette fund førte os i detaljer at undersøge, hvordan Bortezomib påvirker cellecyklus. Efter tilsætning bortezomib til midten log-fase-kulturer blev cellekoncentrationer og levedygtighed målt over tid (figur 1A). Celleproliferation vinder ophørt og levedygtighed faldt til 21, 10, og 4,7% ved 4, 6 og 9 timer efter tilsætning Bortezomib. Uden Bortezomib, cellerne fortsatte dividere og vedvarende levedygtighed. For at undersøge, hvordan cellens cyklus blev ramt af Bortezomib, kromatin DNA, mikrotubuli, og spindel-legemer (SPB: homolog med centrosom) blev visualiseret ved grøn eller rød fluorescerende protein tagging til histon H2A (for kromatin), alpha-tubulin (mikrotubuli) og Sid4 protein (SPB, gær ækvivalent centrosom, vist som en prik i figur 1C) hhv. Forholdet af celler med over-kondenserede kromosomer og metafase spindler var højest (30%) 1 time efter Bortezomib tilsætning og faldt derefter (figur 1B og 1C-a). Som forholdet mellem celler i metafase faldt, forholdet mellem celler med et forskudt kerne forøget (figur 1C-b), hvori søsterchromatider ikke blev adskilt, og kernen blev fortrængt fra centrum. Som forholdet mellem »fordrevne kerner« var højest ved 4 timer og faldt efterfølgende, kernefri celler og celler med giant kerne forøget (figur 1B og C-c). Det var sandsynligvis et resultat af cytokinesen færdiggørelse i celler med et forskudt kerne. Således, i nærvær af bortezomib celler blev kortvarigt standset ved metafase, ude af stand til at adskille søster-kromatider, og levedygtighed blev tabt. Disse fænotyper induceret af Bortezomib er næsten identiske med Mitotiske defekter forårsaget af

mts2-1

, den temperaturfølsomme mutation i Rpt2 underenhed af 19S partikel [10]. I tilfælde af

mts3-1

mutation (Rpn12 af 19S), metafase standsning fænotype er strengere; 75% af cellerne kortvarigt standset ved metafase [11]. I begge tilfælde, metafase anholdelse er timelige og kernen efterfølgende forskudt som vist i tilfældet med Bortezomib behandling. Da defekten i metafase /anafase overgangen skyldes hæmning af proteolyse, bør ubiquitinerede substrater af proteasomet såsom CDC13 (cyclin) akkumulere [12]. For at undersøge dette, celler, ektopisk udtrykte hexa-histidin (His6) -mærket ubiquitin blev fremstillet og dyrket i nærvær eller fravær af Bortezomib i 4 timer ved 26 ° C. Proteinerne blev derefter ekstraheret fra begge kulturer under denaturerende betingelser med 6M guanidin-HCI, og de resulterende ekstrakter blev påført på TALON perler (Clontech), som absorberer His6 tag, at oprense ubiquitinerede-proteiner. Talon-oprensede proteiner blev analyseret ved immunblot under anvendelse af et antistof mod CDC13 (figur 1D). I nærvær af Bortezomib blev multi-ubiquitinerede CDC13 observeret, som rapporteret i temperaturfølsomme mutanter af proteasomet [12]. Disse resultater viste, at en kemisk inhibitor til proteasomet kan anvendes til at erstatte de ts proteasom mutanter. Dette stof kan være nyttigt at analysere fænotyper af proteasom-defekt ved en lav temperatur, for eksempel i meiose eller i de forsøg, hvor varmechok-respons bør undgås. Derfor vedtog vi Bortezomib til yderligere genetisk screening for at identificere de gener, der påvirker proteasomalaktivitet dysfunktion fænotype.

(A) Bortezomib (1 mM) hæmmede celleproliferation. Koncentrationer af celler og levedygtighed præsenteres. BZ: Bortezomib (B) Bortezomib (1 mM) inhiberede den normale progression af M-fasen. Grafen viser forholdet mellem celler med metafase spindler og over-kondenseret kromosomer (blå, celler er vist i figur 1C-

en

), celler med en forskudt kerne (rød, figur 1C-

b

), celler uden en kerne og med en kæmpe kerne (orange, figur 1C-

c

), og celler med kromosom revet af skillevæggen (grøn, figur 1C-

d

, og

e

). (C) Kromosomer, mikrotubuli, og SPB blev observeret i tilstedeværelse af Bortezomib. Celler viser mitotiske abnormiteter korrespondent til figur 2B er vist i a-e (øvre panel: + BZ). Billeder af normal progression af celledeling er vist i nedre panel (-BZ). Bar = 10 um (D) Poly-ubiquitineret cyclin /CDC13 akkumuleret i nærvær af Bortezomib. Se tekst for detaljer.

proteasom-relaterede mutanter er overfølsom over for Bortezomib

Forud for omfattende screening, vi undersøgte, hvordan Bortezomib cytotoksicitet påvirkes af mutationer relateret til ubiquitin /proteasom system. I forhold til vildtype var fem proteasom relaterede mutanter som følger:

mts2-1

,

mts3-1

,

pts1-727 Hotel (muteret i beta 5 underenhed af de 20S kompleks [13]),

ump1-620 Hotel (muteret i 20S modning faktor Ump1 [13]), og

Δcut8

(gen-sletning mutant af

cut8

+

nødvendige for korrekt kernelokalisering af proteasomet [14], [15]). Hver stamme blev inkuberet på en rig JA agarplade at danne en koloni og derefter spottet på agarplader indeholdende 0, 100, 250, eller 500 uM Bortezomib, bistået af et robotsystem (rotor, Singer, UK). Efter 3 dages inkubation ved 26 ° C blev kolonidannelse evne hver plet evalueret (figur 2A og B). Den vildtype dannede kolonier på alle pladerne, mens proteasom-relaterede mutanter var defekte i koloni-formation på bortezomib plader (

Δcut8 dele på 100 uM og andre på 500 uM). Den klare overfølsomhed af

Δcut8

til Bortezomib førte os til at vedtage den ovenfor beskrevne metode for yderligere genom-dækkende screening af syntetiske dødelige mutanter med bortezomib.

(A) Strategi for syntetisk dødbringende screening ( B) Mutanter af komponenter af ubiquitin /proteasom vej er overfølsomme over for Bortezomib. Otte kolonier af hver stamme blev replika-udpladet på agarplader med forskellige koncentrationer af Bortezomib og blev inkuberet i 3 dage ved 26 ° C. (C) Sammendrag af syntetisk dødelig screening med bortezomib. Se tekst for detaljer. (D) Validering af isolerede mutanter, der havde vækst defekter i 100 uM Bortezomib ved spotting 5-fold serielle fortyndinger af vegetative voksende celler.

Genom-dækkende syntetisk-dødelig screening med Bortezomib

for at identificere de gener, der påvirker cytotoksicitet Bortezomib i

S. pombe

, vi screenede 2815 gen-deletionsmutanter for syntetisk væksthæmning på JA agarplader med Bortezomib hjælp Robot-assisteret replika plating. Fra den primære screening, 59, 62, og 135 stammer blev isoleret som havde vækstdefekter i medier med 100, 250, og 500 uM Bortezomib hhv. Der var ingen entydig Bortezomib-resistent mutant, der voksede hurtigere end vildtype-stammen på 500 uM Bortezomib medium. Et resumé af screeningen er vist i figur 2C (eksempler på rå resultater af den primære screening og listen over gener er vist i figur S2 og tabel S1). De 59 stammer, der havde vækstdefekter med 100 pM Bortezomib blev testet igen ved spotting 5-fold seriefortyndinger af log-fase kulturer af hver stamme (fra 10 celler til 6250 celler) på YES-plader med og uden Bortezomib (figur 2D). Vi udførte disse retests in duplo. Som et resultat, 19 gen-deletionsmutanter reproducerbart viste vækst defekter på YES plader med 100 uM Bortezomib. Sytten og 12 stammer viste vækstdefekter med 250 og 500 pM Bortezomib hhv. Resten af ​​mutanterne viste ikke klare vækstdefekter med bortezomib i spotting test. Ingen af ​​testet på lavere doser mutanter (1 nM-10 pM) i Bortezomib viste signifikante vækstdefekter (figur S3). Derfor vedtog vi en 100 uM koncentration af Bortezomib for overfølsomhed screening af

S.pombe

mutanter i vores nuværende studie, men i den tidligere og lignende undersøgelse på humane celler, en 4 til 7-nM koncentration af Bortezomib var til screening [6]

de 19 gener, der viste tydelige vækstdefekter på 100 uM bortezomib plader i spotting testen blev kategoriseret efter funktion:. fem tilhørte ubiquitin /proteasom vej, fire til nukleare /kromatin proteiner og nuklear transport, tre til vesikulær trafik, tre til aminosyre og vitaminer metabolisme, tre til RNA metabolisme, og proteinkinase A (tabel 1). Tabel 1 viser de systematiske navne, primære navne (hvis relevant), spirende gær

Saccharomyces cerevisiae

og menneskelige ortologer, og en kort beskrivelse af hver SLB gen. Blandt de 19 SLB-generne, er 13 gener rapporteret at have potentielle ortologer hos mennesker.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, vi demonstreret, at bortezomib, en inhibitor af proteasomet udbredte som et anti-cancer lægemiddel, effektivt inhiberer proliferation af

S.pombe

og inducerer mitosestandsning samt temperaturfølsomme mutationer af proteasomalaktivitet underenheder. Nitten gen-deletionsmutanter blev identificeret ved genomet-dækkende screening for at være syntetisk dødelig med Bortezomib.

På trods af den stærke effekt af Bortezomib at arrestere cellecyklus, anden proteasominhibitor, MG132, havde svagere hæmmende virkning på spredning i den foreliggende undersøgelse. MG132 er imidlertid rapporteret at inhibere protesome-afhængig proteolyse i cellelysatet af

S.pombe

, hvilket indikerer, at proteasom af

S.pombe

er følsom over for denne inhibitor [16]. I

S. cerevisiae

er MG132 anvendes til at hæmme proteolyse

in vivo

under genet sletning af PDR5, de store stof efflux pumpe, som effektivt kan udskille MG132 fra cellen [17].

S.pombe

besidder to PDR5 ortologer, Pdr1 og Bfr1. Forskellen i virkningerne af Bortezomib og MG132 kan skyldes deres forskelle i celle permeabilitet eller effekten af ​​udskillelse af narkotika efflukspumper. Bortezomib kan tjene som et nyttigt redskab til at studere ubiquitin /proteasom vej i

S.pombe

.

Vi udførte den syntetisk dødelige skærmen for at identificere gener, som påvirker følsomheden for bortezomib, ved hjælp af 2815 gen-deletionsmutanter af

S. pombe

. Nitten deletionsmutanter blev identificeret med alvorlige vækstdefekter induceret af 100 uM Bortezomib (anført i tabel 1 og figur 3). Fem af de ansvarlige gener (betegnet SLB) var ubiquitin /proteasom-relateret: pof3, cul3, mug30, ubp16 og cut8. Deres syntetisk letalitet med Bortezomib kan forklares gennem lægemidlets hæmmende indsats mod proteasom. For eksempel ubiquitin ligaser tilvejebringe substraterne for proteasom således at forsvindende begge kan forårsage alvorlige syntetiske virkninger. Andre har ikke været rapporteret at være relateret til proteasomfunktionen. Men nogle af SLB gener stadig kunne forklares gennem proteasom funktioner. For tre vesikulær menneskehandel SLB gener (sec28, ftp105, og ryh1), defekter i Udskillelsen påberåbe ER (endoplasmatisk reticulum) stress, der kan øge kravet i proteasomet aktivitet [18]. En af vesikulær trafficking SLB gener, ftp105, koder Golgi lokalisering protein, der blev rapporteret til at interagere med deubiquitinase Usp5 og være påkrævet for Golgi lokalisering af Usp5 [19]. Den humane ortolog af Ftp105 er C17orf28 /DMC1 (nedreguleret i forskellige cancertyper), en potentiel tumor suppressor [20]. Derfor vil den syntetiske dødelighed af ftp105 sletning med Bortezomib blive undersøgt yderligere i fremtiden. Ryh1 blev for nylig rapporteret at regulere TORC 2 (mål for rapamycin kompleks 2) i

S.pombe

[21]. Vedrørende nukleare SLB proteiner, måske mere proteasom være påkrævet, når kromatin dynamik er kompromitteret i deletionsmutanter af kromatin regulatorer, som det nukleare proteasomet er kendt for at bidrage til kromatin forordninger såsom DNA-skader reparation, DNA-replikation, og transkription [15], [22 ], [23], [24]. En af nukleare SLB genprodukter er Rik1, en komponent i CLRK ubiquitinligase kompleks kræves for kromatin lyddæmpning [25], [26]. Selvom substrater for CLRK ubiquitinligase ikke er kendt, kan det være en nysgerrig eksperiment for at undersøge, om Bortezomib påvirker DNA kromatin lyddæmpning. PKA blev rapporteret at være involveret i metafase /anafase regler i fission gær og i Xenopus-æg systemer

in vitro

[12], [27], [28]. Mens nogle af de andre SLB gener, såsom vitamin metaboliske faktorer, er vanskelige at blive forklaret, kan de være impliceret et af meget forskelligartede cellulære funktioner proteasomet. Bortezomib kan eventuelt have andre end proteasom inden celler af

S-mål. pombe

. Således evaluering af SLB gener tilsyneladende ikke er relateret til ubiquitin /proteasom kunne være værd for at overveje andre mål. Kombination af SLB gendeletion og proteasomalaktivitet temperaturfølsomme mutationer vil være nyttigt at vurdere, om det syntetiske letalitet skyldes inhibering af proteasomet eller andre perturbationer forårsaget af Bortezomib. Hvis det syntetiske letalitet skyldes hæmning af proteasomet, forventes den dobbelte mutant af SLB genet og proteasomet at vise en væsentligt kraftigere fænotype end en enkelt proteasomalaktivitet mutant. Faktisk, en mutant af

cut8

, en SLB-gen, viser syntetisk letalitet til proteasomalaktivitet mutationer

mts2-1

mts3-1

[14]. Selv om det bør holdes for øje, at Bortezomib har et andet mål, de foreliggende resultater har potentielt store konsekvenser for grundlæggende proteasom biologi ved at åbne muligheder for at opdage nye og uventede relationer mellem proteasomet og andre cellulære veje. En lignende genom-wide screen i humane celler antydede, at protein-oversættelser, ER /Golgi-vejen, DNA beskadigelse reparation pathway og regulering af Myc og polyaminer er involveret i Bortezomib-induceret celledød [6]. Resultaterne af denne undersøgelse nyligt tyder på, at gener involveret i vitamin- og aminosyre metaboliske veje, kromatin lyddæmpning, nuklear /cytoplasma pendulfart, og lejren pathway er relateret til proteasom i fission gær

S.pombe

. Derfor skal der gøres en yderligere indsats for at forstå mekanismerne i den syntetiske dødelighed af disse uventede SLB gendeletioner med bortezomib.

Tretten bevarede SLB gener er vist i rødt.

Vi identificerede 13 bevarede SLB gener potentielt interessante for yderligere undersøgelser. Som nævnt i de Resultater, 4 til 7 nM Bortezomib blev anvendt til at screene generne påvirker cytotoksicitet af bortezomib cancer cellelinjer, og 100 uM af Bortezomib blev brugt til

S.pombe

mutant screening i nærværende undersøgelse . Forskellen i Bortezomib følsomhed kan afspejle forskellen i biologi af disse organismer, såsom gennemtrængelighed narkotika og narkotika udskillelse. Generelt gærceller er mere modstandsdygtige over perturbationer ved kemiske inhibitorer. Derfor bør menneskelige ortologer af konserverede SLB gener undersøges ved lille interferens-RNA for at se, om deres knockdown påvirker overlevelsesevne humane celler ved lavere doser af Bortezomib. Hvis der opstår de samme syntetiske virkninger i humane celler, sådanne SLB gener har potentiale for innovation af nye behandlingsformer eller diagnoser. For eksempel, hvis der udvikles kemiske inhibitorer for disse konserverede SLB produkter, vil sådanne kemikalier være kandidater anvendes til cocktail behandling med bortezomib. På den anden side kan patienter med en genetisk svag baggrund på grund af disse SLB orthologer har alvorlige bivirkninger i Bortezomib administration. Således forventes yderligere undersøgelser på SLB ortologer i menneske i fremtiden.

Materialer og metoder

Strain, medium, kultur, og medicinsk behandling

S. pombe

heterothallic haploider 972

h

–

975

h

+

deres derivater blev anvendt. Komplet rig YE, YES og minimal EMM2 medier blev brugt [29]. Stamopløsninger af Bortezomib (LC Laboratories, Woburn, MA) blev fremstillet i DMSO og lægemidler blev tilsat til flydende kultur eller agar medium ved den angivne koncentration.

Syntetisk letal screening

I hele genomet screening, vedtog vi sletning bibliotek af

S. pombe

haploide indkøbt fra Bioneer Corp. (Korea). De kontrol vildtype stammer er ED666 (

h

+ ade6-M210 Ura4-D18 leu1-32

) og ED668 (

h

+ ade6-M216 Ura4-D18 leu1-32

), som også blev indkøbt fra Bioneer Corp. haploide gen-deletion bibliotek blev tilvejebragt som glycerol-stamopløsninger i 96-brønds plader. Først blev 5 pi af hver bestand af deletion-stamme plettet på YES-plader fra en 96-brønds plade under anvendelse laboratoriet automation system BioMek FX (Beckman Coulter, Brea, CA). Efter 3 dages inkubation ved 26 ° C blev en koloni af hver stamme indtog og spottet på en anden JA plade (betragtede moderen plader) under anvendelse rotoren robot (Singer Instruments, UK). En koloni blev quadruplicated at kontrollere reproducerbarhed. Fra moderen plader, plettet kolonier blev igen indtog og plettet på YES-plader indeholdende 0, 100, 250, og 500 uM Bortezomib hhv. Spotted plader med forskellige koncentrationer af lægemidlet blev inkuberet i 3 dage ved 26 ° C, og kolonidannelse af hver stamme blev evalueret. For validering af den primære screening, blev bortezomib følsomheder af udvalgte stammer fra den primære screening igen med spotting tests.

Immunoblot og proteinoprensning

For immunoblotanalyse samlede proteiner blev udvundet ved hjælp af trichloreddikesyre (TCA) metode. Identiske mængder af proteiner blev separeret ved SDS-PAGE-gel og blottet til nitrocellulosemembraner. Anti-poly-ubiquitin (FK-2, mus monoklonale, MBL, Japan), anti-alpha-tubulin (TAT1, mus monoklonale, en gave fra Dr. Gull) og anti-CDC13 (kanin polyklonale) blev anvendt som primære antistoffer. Peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer og et ECL chemiluminescens systemet (GE Healthcare) blev anvendt til at amplificere signalet ekspression. For at rense ubiquitinerede proteiner, blev den tidligere beskrevne metode anvendes med mindre modifikation [15].

Fluorescensmikroskopi

Alle billeder blev erhvervet ved hjælp af et fluorescerende mikroskop indstilling Axioplan 2 (Zeiss, Tyskland). Metoder til konstruktion af GFP eller RFP fusionerede gen blev beskrevet tidligere [30].

Støtte oplysninger

figur S1.

Bortezomib hæmmer spredning af

S.pombe

. (A) Bortezomib og MG-132 blev tilsat til en log-fase-kultur af

S. pombe

i de angivne koncentrationer og cellulær proliferation blev undersøgt i 8 timer. Fold-stigninger på 8 timer efter narkotika tilføjelse præsenteres på Y-aksen. (B) Niveauer af poly-ubiquitineret proteiner blev undersøgt i nærvær (+) eller fravær (-) af 1 mM Bortezomib. Poly-ubiquitineret proteiner akkumuleret i en tidsafhængig måde efter tilsætning af Bortezomib

doi:. 10,1371 /journal.pone.0022021.s001

(TIF)

Figur S2.

Et eksempel på den primære screening er vist. Som beskrevet i teksten, blev hver koloni af hvert gen-deletion-stamme spottet til hver position (A1, A2 …) af JA agarplader med 0, 100, 250, og 500 uM Bortezomib. For at screene 2815 stammer blev 31 sæt af disse plader forberedt. Efter inkubering ved 26 ° C i 3 dage blev kolonidannelse evalueret. Vildtypestammer blev spottet til positioner H2 og H3 (hvid stiplet linie). Stammer spottet på A3, B8, B10, og C10 blev udvalgt som kandidater, der viser alvorlige vækstdefekter med 100 uM Bortezomib og blev testet igen ved seriel fortynding spotting

doi:. 10,1371 /journal.pone.0022021.s002

(TIF )

Figur S3.

Følsomhed til lavere doser af Bortezomib. Koloni-dannelse evne fem SLB mutanter blev undersøgt på YES agarmedium indeholdende 0, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 pM, 10 pM og 100 pM Bortezomib som beskrevet i figur 2 (D). Under 10 uM Bortezomib blev betydelig vækst defekt ikke observeret

doi:. 10,1371 /journal.pone.0022021.s003

(TIF)

tabel S1.

Liste af gener, som blev identificeret til at vise vækst defekt i nærværelse af 100, 250 og 500 uM Bortezomib fra den primære screening.

doi: 10,1371 /journal.pone.0022021.s004

(XLS)

Tak

Vi er i stor gæld til Dr. Colin Gordon for at levere den

S. pombe

stammer og Dr. Keith Gull for forsyning antistoffer. Salg