PLoS ONE: Kronisk Lung Injury ved konstitutiv ekspression af Activation-induceret cytidindeaminase Fører til Focal Mucous Cell Metaplasi og Cancer

Abstrakt

Aktivering-induceret cytidindeaminase (AID) er et enzym, der kræves for antistof diversificering, og det forårsager DNA mutationer og strengbrud. Konstitutiv AID-ekspression i mus uvægerligt forårsaget lungelæsioner morfologisk svarende til human atypisk adenomatøs hyperplasi (AAH), som kan være et forstadium til bronchioloalveolar carcinom. Svarende til AAH, muse AAH-lignende læsion (Mall) udviste tegn på alveolær differentiering, at dømme efter ekspression af alveolære type II (AT2) cellemarkør overfladeaktivt protein C (SP-C). Men elektronmikroskopi angivet, at MALL, som besad visse funktioner i en slim celle, adskiller sig fra en AAH eller AT2 celle. Selv MALL udviklet i alle personer inden for 30 uger efter fødslen, forekom lungetumorer i kun 10%; dette tyder på, at det store flertal af indkøbscentre ikke vokser i synlige tumorer. MALL udtrykte adskillige nyligt beskrevne markører for lunge alveolært regenerering såsom P63, keratin 5, keratin 14, leucin-rige repeat indeholdende G-protein-koblet receptor 5 (Lgr5), og Lgr6. Øget celledød blev observeret i lungerne af AID transgene mus sammenlignet med vild-type mus. Baseret på disse observationer, vi spekulere i, at MALL er en regenererende væv kompensere for cellulær tab som følge af AID cytotoksicitet. AID udtryk i sådan regenererende væv bør prædisponere celler til malign transformation via sin mutagen aktivitet

Henvisning:. Kitamura J, Uemura M, Kurozumi M, Sonobe M, Manabe T, Hiai H, et al. (2015) Kronisk Lung Injury ved konstitutiv ekspression af Activation-induceret cytidindeaminase Fører til Focal Mucous Cell Metaplasi og kræft. PLoS ONE 10 (2): e0117986. doi: 10,1371 /journal.pone.0117986

Academic Redaktør: Jean-Pierre Vartanian, Institut Pasteur, FRANCE

Modtaget: 18 juni 2014 Accepteret: Jan 4, 2015; Publiceret: 6 feb 2015

Copyright: © 2015 Kitamura et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning af Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan (KAKENHI 23.390.097) . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft er den hyppigste årsag til kræftdødsfald verdensplan [1,2], og rygning udgør ca. 80% af tilfældene lungekræft [3]. På den anden side, lungesygdomme, såsom kronisk obstruktiv lungesygdom, infektiøs lungebetændelse, idiopatisk interstitiel lungebetændelse og tuberkulose-som alle forårsager betændelse i lungevæv-forøgelse af risikoen for lungekræft uafhængig af tobak bruge [4]. Med faldet i rygning, har forebyggelse af tobak-uafhængig lungekræft blevet forholdsvis vigtig [2,3]. Det største spørgsmål der skal besvares, er, hvordan onkogen mutationer forekommer i tobak-uafhængig lungekræft.

Nylige undersøgelser tyder på inddragelse af cytidin deaminaser i udviklingen af ​​kræft i mave-tarmkanalen, mælkekirtler, og prostata [5- 9]. Aktiverings-induceret cytidindeaminaseinhibitor (AID), et medlem af cytidindeaminase familien, er et essentielt enzym for somatisk hypermutation og klasse-skift rekombination af antistofgener. Vi har tidligere rapporteret, at AID blev udtrykt i flere typer af gastrointestinale og hepatobiliære kræftformer, der forekommer i baggrunden af ​​kronisk inflammation [5-7]. Transgene udtryk for AID i mus forårsager forskellige typer af tumorer, herunder lunger, lever og mave og leukæmi [10,11]. AID-ekspression blev også rapporteret i human lunge adenocarcinom [12]. Disse observationer tyder på mutagene rolle AID i inflammation-associeret cancer.

Ca. 10% af støtten transgene mus udvikler makroskopisk lunge tumor inden for 90 uger efter fødslen [11]. Men alle personer (herunder uden lunge tumorer) besidder mikroskopiske lungelæsioner morfologisk svarende til human atypisk adenomatøs hyperplasi (AAH), en forløber for bronchioloalveolar karcinom [10,13]. Vi oprindeligt spekuleret på, at denne mus AAH-lignende læsion (MALL) er en neoplastisk læsion, som til sidst udvikler sig til adenocarcinom i AID transgene mus. Vi begyndte at analysere MALL i håb om at få et indblik i den mekanisme af AID-induceret lunge tumor i mus og inflammation-associeret lungekræft hos mennesker. vores data foreslås imidlertid, at MALL er ikke en neoplastisk læsion, men en forbigående struktur udtrykker nylig beskrevet markører for lunge alveolær regenerering. I denne undersøgelse, vi udforske årsager og karakteristika MALL, beskrive, hvordan AID forårsager MALL og lunge tumor i mus, og løse dens implikationer vedrørende menneskelige lunge carcinogenese.

Materialer og metoder

Mus

anvendelsen af ​​betingede transgene C57BL /6-mus besidder en enkelt kopi af transgen indeholdende CAG promotor-drevet floxet grønt fluorescerende protein (GFP) kodende sekvens efterfulgt af muse AID-kodende sekvens (AID CTG) er tidligere blevet beskrevet [14] . Ved at krydse denne mus en gang med en Cre transgen mus drevet af væv ikke-specifik alkalisk phosphatase (TNAP) promotor (TNAP-Cre mus med blandet baggrund af C57BL /6 og 129 /Sv efter tre tilbagekrydsninger med C57BL /6 [15]), mus med kimcellelinje sletning af GFP segment-og dermed konstitutiv AID udtryk (Aidon) -were opnået. Aidon mus af C57BL /6 baggrund med mindre bidrag på 129 /Sv, fortyndet ved tilbagekrydsning mere end seks gange, blev anvendt. C57BL /6J-mus blev indkøbt fra Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japan). Alle mus blev fodret ad libitum og blev aflivet ved cervikal dislokation for censurere, eller observeret umiddelbart efter spontan død. Alle dyreforsøg blev godkendt af Etisk Komité for dyreforsøg og udføres som pr retningslinjerne for dyreforsøg i Shiga Medical Center.

Gene mutation analyse

Lunge væv blev dissekeret, indlejret i OCT-forbindelse (Sakura Fineteck Japan Co., Ltd., Tokyo, Japan), og nedfrosset straks løbet flydende nitrogen. Derefter blev 10-um-tykke snit farvet med hematoxylin og eosin (HE). Individuel MALL blev isoleret ved laser mikrodissektion hjælp LMD 6000 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Tyskland). Genomisk DNA blev isoleret fra hver Mall ved hjælp QIAamp DNA Micro (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland).

Trp53

exon 5-8,

Kras

exon 2, og

EGFr

exon 19-21 blev forstærket ved hjælp af en nested polymerasekædereaktion (PCR) med følgende primere :

Trp53

; frem 5 ‘GCG CCA TGG CCA TCT ACA A 3’, omvendt 5’TCT TCT GTA CGG CGG TCT CT 3 ‘, indlejret frem 5’TGG CCA TCT ACA AGA AGT CAC 3’, og indlejret omvendt 5’CAG GGC AGG CAC AAA CA 3 ‘.

Kras

; frem 5 ‘CGG GTG TGT CCA CAG GGT ATA GCG T 3’, omvendt 5 ‘AGT TGA GTT CTA GGC CGG TCA 3’, indlejret frem 5 ‘GTG TGT CCA CAG GGT ATA GCG TAC T 3’, og indlejret omvendt 5’GTT GAG TTC TAG GCC GGT CAG G, 3 ‘.

EGFr

exon 19; frem 5 ‘CCC TTT CTG FTT TAG CAT GTC 3’, omvendt 5’GGC ACA TCC CTC AGT CAC TTA ACA C 3 ‘, indlejret frem 5’ CTC TTG GAT TTG TAA TGT AGA GCC 3 ‘, og indlejret omvendt 5’ATT GGG TGT AAT TTA TTA GTG CAT C 3 ‘.

EGFr

exon 20; frem 5 ‘GAA GAT AGT GGC ATT TCC TAA ACT C 3’, omvendt 5’GCA TGA ACA CCA GGC TCG ATG 3 ‘, indlejret frem 5’ ACA TCC CAC AGT GTA TTA GCA TTT A 3 ‘, og indlejret omvendt 5’CTG CTT TTC TTA GTG CTC TTA CCA 3 ‘.

EGFr

exon 21; frem 5 ‘GCC CAA GGA ACG TGA CGA AAG 3’, 5 ‘AGG GTG CTA CTG AAT CCG TGG TCA T 3’, indlejret frem 5 ‘TTG TCA TTC ATG CCA GAT AAT TCC A 3’, og indlejret omvendt 5’TTA CTA CTC CCA CCG AAA TCC A 3 ‘. PCR-produkter blev oprenset med en exonuclease /phosphatase blanding (ExoSAP-IT, USB Corporation /Affymetrix, Inc., Cleveland, OH, USA) og sekventeret ved anvendelse af nestede PCR-primere og Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Sekventeringsprodukter blev behandlet med Big Dye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems) og analyseret under anvendelse af ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

histologi og immunhistokemi

Vævsprøver fra mus blev fikseret i 10% (vægt /volumen) formaldehyd, indlejret i paraffin og farvet med HE til histologisk undersøgelse. For immunohistokemi blev vævsprøver fikseret via HOPE Fixative (Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA). Prøverne blev indlejret i paraffin. Immunhistokemi blev udført under anvendelse af avidin-biotin-peroxidase-kompleks (ABC). Monoklonalt anti-AID-antistof (MAID-2) blev beskrevet [16]. Andre antistoffer blev købt: keratin 5 (sc-17090; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), AN P63 (sc-8609; Santa Cruz Biotechnology), Claracelle 10 kD protein (CC-10, SC- 9772; Santa Cruz Biotechnology), epitelial cadherin (E-cadherin, 24E10, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), leucin-rige repeat indeholdende G-protein-koblet receptor 5 (Lgr5, ab75732; Abcam, Cambridge, MA, USA) , overfladeaktivt protein C (SP-C, sc-13.976, Santa Cruz Biotechnology), Lgr6 (sc-99.123, Santa Cruz Biotechnology), keratin 14 (PRB-155P, Covance, Berkeley, Californien, USA), og podoplanin (53- 5381, eBioscience, San Diego, CA, USA). Hver sektion blev kontrastfarvet med hæmatoxylin

Estimering af antallet af indkøbscentre i hele lunge

Samlet antal indkøbscentre blev anslået som følger:. Massefylde MALL på afsnit (N pr cm

2) blev beregnet som en middelværdi for 11 sektioner af 4-um tykkelse (T = 0,0004 cm) indsamlet på 100 um intervaller. Antallet og område MALL og området med alveolære region i hver sektion blev målt på hele afsnittet billeder ved hjælp ScanScope scanner og ImageScope software (Aperio Technologies, Inc., Vista, Californien, USA). Middeldiameter på Mall (D, cm) blev estimeret som 0,005 cm. En hypotetisk kubisk vævsmasse med en side på 1 cm kan skåret i 1 /T-profiler. Derfor bør det samlede antal MALL tæller i alle 1 /T sektioner vil være N /T. En enkelt MALL er skåret ind i D /T stykker og tælles D /T gange. Opdeling total MALL count (N /T) med denne redundans faktor (D /T), kan tre-dimensionelle tæthed af MALL udtrykkes som N /D pr cm

3. Brug følgende værdier (N = 4,3, D = 0,005, bilateral lunge volumen på 1,0 cm

3) til en 37 uger gammel mus, det samlede antal MALL i lungerne er beregnet som N /D × lungevolumen = 4,3 /0,005 × 1,0 = 860.

elektronmikroskopi

i elektronmikroskopisk analyse blev Aidon mus perfunderet fra højre ventrikel med phosphatbufret saltvand (PBS) for at fjerne blod. Deres lunger blev derefter perfusion-fikseret med en blanding af 1,4% paraformaldehyd og 1% glutaraldehyd i PBS, og derefter skåret i 2 mm terninger til transmissionselektronmikroskopi og immersionsfikseret i samme middel anvendt til perfusion fiksering ved 4 ° C natten . Sektionerne blev derefter post-fikseret i 1% osmiumtetroxid i 0,1 M phosphatpuffer i 1,5 time. Prøver blev derefter dehydreret i en gradueret ethanol serie, ryddet med propylenoxid, og indlejret i Epon. Blokke var på første snit som semithin (1 um) snit og farvet med toluidinblåt at identificere MALL. Ultratynde (60-90 nm) sektioner blev farvet med uranylacetat og bly citrat og undersøges med transmissions elektron mikroskop, H7650 (Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan).

Apoptose assay

terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) -medieret dUTP nick endlabeling (TUNEL) blev udført for at detektere apoptotiske DNA-brud i lungen og levervæv ved brug af TAC 2 TdT-DAB In situ Apoptosis Detection Kit (Trevigen Inc., Gaithersburg, MD, USA ). Objektglassene blev modfarvet med 1% methylgrønt. Til måling celledød i lungen og leveren blev TUNEL-positive og -negative alveolevæggen celler og hepatocytter tælles indtil den når et totalt antal på 1.000 celler i 9-24 ikke-overlappende, tilfældigt valgt × 400 felter. Celler blev talt under anvendelse af billedanalysesoftware fra VH Analyzer (Keyence, Osaka, Japan). Data blev indsamlet fra tre individuelle mus.

spredning assay

Aidon mus fik en daglig intraperitoneal injektion af 1 mg 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EDU) i 0,4 ml PBS for 7 dage. Musene blev derefter undersøgt efter 1 og 20 dage efter den sidste injektion. Celleproliferation i de 10-um-tykke frosne snit af lunger blev opdaget ved hjælp af Click-iT Edu Alexa Fluor 488 Imaging Kit (Molecular Probes, Invitrogen, Eugene, OR, USA). Snittene blev fikseret i 3,7% (v /v) formaldehyd i 10 min. Næste vævene blev permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 i PBS ved stuetemperatur i 20 minutter. Click-iT edu reaktion cocktail herunder Alexa Fluor 488 azid blev fremstillet ifølge producentens instruktioner og tilsat til dækning objektglasset og inkuberes ved stuetemperatur i mørke i 30 min. Kerner blev visualiseret med Hoechst 33342-farve. Slides blev undersøgt under et DM 5000B fluorescens mikroskop (Leica Microsystems). blev påvist edu positive celler i lungen. Data blev indsamlet fra to mus på hvert tidspunkt.

Cell kultur og pro-inflammatorisk cytokin stimulation

Humane alveolære epitelceller (A549 cellelinie) blev købt fra Riken Cell Bank (Tsukuba, Japan ) og opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i 5% CO

2. En 2-ml cellesuspension (1 x 10

5 celler /ml) blev podet i 6-brønds kulturplader og inkuberes i 24 timer for at tillade cellevedhæftning. Cellerne blev behandlet med humant tumornekrosefaktor α (TNF PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA), interleukin-1β (IL1β PeproTech), og lymfotoksin-α2 /β1 (LTα2 /β1, R AID, aktivering-induceret cytidindeaminase; Tg, transgene; MALL, mus AAH-lignende læsion.

MALL optælling blev undersøgt ved at tage gennemsnittet af tætheden i 11 afsnit af højre lunge ved 100-um intervaller for mus mellem 12 og 75 ugers alderen (fig. 2A ). MALL var knap påviselig i 12- og 17 uger gamle mus, men blev påvist efter 26 uger. Antallet af indkøbscentre steg med alderen. På 37 uger, MALL tæthed på sektionering var 4,3 ± 0,8 /cm

2 (middelværdi ± standardafvigelse, n = 3), svarende til et skøn over 860 indkøbscentre i bilaterale lunger (se Metoder til beregning). Blandt de 64 Aidon mus undersøgte, kun 7 (11%) udviklede makroskopisk synlige lunge tumorer (3 adenomer og 4 adenocarcinomer), hvilket er sammenligneligt med lunge tumorincidensen i den oprindelige linje af AID transgene mus [11]. I betragtning af det store antal indkøbscentre i alderen mus lunge, vi spekulere, at de fleste indkøbscentre undlader at vokse som makroskopiske tumorer.

A, I venstre panel, betyder tætheden af ​​indkøbscentre i sektioner pr 1 cm

2 er plottet mod mus alder i uger. En solid linje med lukket symbol og en grå linje med åben symbol repræsenterer Aidon og vild-type mus, hhv. Fejl- søjler repræsenterer standardfejl for data fra tre mus, bortset fra en vildtype-mus og en 75 uger gammel Aidon mus hver blev analyseret enkeltvis. Et område med en stiplet rektangel blev udvidet i højre panel. B, Tværsnit med individuelle indkøbscentre plottet. Middelværdier er angivet med røde linjer. P-værdier beregnet ved t-test mellem grupperne er angivet med parentes.

Varierende størrelser (baseret på tværsnitsarealet) af individuelle indkøbscentre fra mus i forskellige aldre er afbildet i fig. 2B. Den gennemsnitlige størrelse af en MALL syntes at være relativt konstant over tid. Selv blev detekteret statistisk signifikante forskelle mellem 26 uger og 37 uger (p = 0,002) og mellem 37 uger og 75 uger (P 0,0001), middelværdien forskel var lille og ikke synes at have biologisk betydning. Lejlighedsvis udseende store indkøbscentre i 75 uger gamle mus kan indikere, at et begrænset antal indkøbscentre fortsætte med at vokse, i sidste ende bliver synlige tumorer på brutto inspektion.

Lungekræft-relaterede genmutation analyse i indkøbscentre

Menneskelig AAH sigende rummer væsentligt forhøjede frekvenser af mutationer i tre lungekræft gener:

Trp53

,

Kras

, og

EGFr

[17-23] . For at undersøge, om MALL har mutationer kan sammenlignes med AAH blev mutationer analyseret i hotspot regioner af de tre gener:

Trp53

exons 5-8,

Kras

exon 2, og

EGFr

exons 19-21. Vi mikrodissekeres 110 indkøbscentre, hvorfra DNA blev oprenset individuelt og underkastes gen-specifik PCR og direkte sekventering. Mens fire (10,5%) af 38 indkøbscentre viste fem missense mutationer i

Trp53

gen, ingen missense mutation af

Kras

eller

EGFr

genet blev fundet. Mutationen hyppigheden af ​​

Trp53

gen var sammenlignelig med tidligere offentliggjorte data på menneskers AAH i lungerne [17,18], men

Kras

EGFr

mutationer var meget færre end i human AAH [19-23] (tabel 1). Fire ud af de fem missense

Trp53

mutationer forventes at kompromittere proteinfunktion, men det er uklart, om disse skadelige mutationer spillede nogle roller i udviklingen af ​​indkøbscentre (S1A og B Fig.).

tal i parentes angiver antallet af indkøbscentre med den genmutation versus antallet af indkøbscentre undersøgt.

Herunder intron mutationer, 14, 3 og 0 single-basesubstitutioner blev fundet i

Trp53

,

Kras

EGFr

gen hhv. De substitution mønstre af cytosin (C) -til-thymin (T) og guanin (G) -til-adenin (A) skifter typisk at cytidin deaminering var ikke fremherskende i

Trp53

gen (14% [2 /14], S1c fig.). I begge tilfælde muteret Cs var 5′-Forud G, hvilket var i overensstemmelse med AID signatur [24]. Som vist i S1D fig., 2 ud af 3 substitutioner set i

Kras

gen var C-til-T ændring i en dinukleotid sammenhæng med C-5′-forudgået af T, som er en præferentiel mål for APOBEC3 deaminering [25]. Men lille antal observerede mutationer i indkøbscentre udelukker inferens af mutations proces.

Immunhistokemi for luftvejsepitelceller cellemarkører

For at karakterisere differentiering status MALL, udførte vi immunhistokemi for tre markører specifikke for tre slags distale luftvejsepitelceller: podoplanin i alveolære type 1 (AT1) celler, SP-C i alveolære type 2 (AT2) celler og CC-10 i Clara-celler. Indkøbscentre var delvist positive for SP-C, men negativ for CC-10 og podoplanin (fig. 3A-C). Dette fund tyder på, at AT2 celler kan være til stede i Mall.

A, CC-10, clara cellemarkør og B, podoplanin, alveolær type I cellemarkør var negative. C, SP-C, alveolær type II cellemarkør var delvis positiv i MALL celler. D, AN P63; E, keratin 5; F, keratin14; G, E-cadherin; H, Lgr5; og jeg, Lgr6 var alle positive i indkøbscentre. Brown signal angiver positiv farvning af diaminobenzidin og blå signal angiver nuklear counter farvning med hæmatoxylin. MALL er angivet med en pilespids. CC-10, Claracelle 10 kD-protein; SP-C, overfladeaktivt protein C; E-cadherin, epithelial cadherin; LGR, leucin-rige repeat indeholdende G-protein-koblede receptorer.

sovende natur MALL og mangel på mutationer i lungekræft gener fik os til at spekulere, at MALL kunne være en regenerativ læsion snarere end en tidlig neoplasme. For nylig blev der rapporteret regenerative markører for distale luftvejsceller. I en musemodel viser lunge regenerering efter H1N1 influenza virus infektion, P63, keratin 5, og keratin 14 udtrykkes i regenererende alveolære celler [26]. I en anden undersøgelse ved anvendelse af humane lunge-afledte celler, celler, der udtrykker E-cadherin, Lgr5, og Lgr6 besad en stamcelle-lignende evne til selvfornyelse og bronchioalveolar differentiering [27]. Immunhistokemi viste også, at MALL udtrykte ΔNp63, keratin 5, keratin 14, E-cadherin, Lgr5, og Lgr6 (fig. 3D-I), hvilket indikerer, at MALL bevarer en underskrift alveolær regenerativ væv.

Elektronmikroskopisk fund

for yderligere at undersøge MALL egenskaber, vi vurderede lunger Aidon mus via transmission elektronmikroskopi. MALL bestod af et monolag af cellerne på et basalmembran. Cellerne blev søjleformet med aflange kerner (fig. 4A). Interessant alle celler indeholdt umodne sekretoriske vesikler i den apikale del af cytoplasmaet uden lamellære legemer (fig. 4B). Disse vesikler var positive for PAS-farvning, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​mucin (fig. 4C). Disse resultater viser, at MALL celler er, i virkeligheden, umodne mukøse celler. Som menneske AAH indeholder lamellære organer [28], MALL struktur adskiller sig fra AAH, indledende nomenklatur trods

Electron mikroskopiske fund af MALL:. A, Oversigt over MALL celler. B, Forstørret billede af den apikale del af MALL celler. Pile viser umodne sekretoriske vesikler i cytoplasmaet i MALL celler. En stjerne angiver en basal celle ved siden MALL celler. C, PAS-farvning viser, at positivt farvede materialer er i spidsen af ​​MALL celler (pilespidser). D, Electron mikrograf viser en fagocytisk epitelcelle inden MALL (stjerne). Indpresningsdybde, højere magt betragtning af den fagocytiske epitelcelle. Pile viser basalmembranen. Pilespidser angiver resterende organer i cellen. AS, alveolær rum; PAS, periodisk-syre Schiff.

Derudover har vi opdaget basale celle-lignende celler, som normalt ikke ses i den distale lunge af musen [29], på den basale side af MALL celler (fig. 4A). Stærk udtryk for keratiner 5 og 14 viser, at MALL stammer fra denne basale celle-lignende celle. Endvidere har vi lejlighedsvis fundet fagocytiske celler indenfor indkøbscentre (Fig. 4D). Disse celler havde direkte kontakt med basalmembranen og resterende organer i cytoplasmaet. Med denne observation, konkluderede vi, at disse celler var faktisk fagocytiske epitelceller. Disse celler udgør en fysiologisk reaktion på apoptose af deres epiteliale naboer [30,31]. Dette fund tyder derfor, at clearance af dødt væv ved epitelceller forekommer i den distale luftveje epitel i Aidon mus.

Forbedret celledød i vævet af Aidon mus

Tilstedeværelsen af ​​fagocyterende epitelceller i indkøbscentre fik os til at spekulere, at lunge celledød forekommer hyppigere i Aidon mus end WT mus. I TUNEL-analysen, vi lejlighedsvis fundet døde celler inden indkøbscentre (fig. 5A). Imidlertid blev døde celler anerkendt selv i området uden MALL. Forekomsten af ​​døde celler uden MALL i Aidon mus lungerne (0,43%) var signifikant højere end i WT mus (0,09%, P = 0,013;. Figur 5B, tabel 2). For at undersøge om AID cytotoksicitet er specifik til lungen, udførte vi TUNEL-farvning af levervæv. Antallet af TUNEL-positive hepatocytter steg i Aidon mus sammenlignet med WT-mus (6,0% versus 4,8%, P = 0,036;. Figur 5C, tabel 2). Dette fund viser klart, at AID-induceret celledød er ikke specifik til lungen

TUNEL farvning af A, MALL.; B, Lung af AID Tg mus; og C, Lever af AID Tg mus. Pilespidser angiver TUNEL-positive celler. Celleformeringsanalyse Edu mærkning i lungen af ​​støtte Tg mus og WT mus: D, Repræsentant figur af Edu-positive MALL på dag 1. En pilespids angiver Edu-positive MALL (regionen er omgivet af en stiplet linje). E, repræsentant figur af lungen af ​​AID Tg mus på dag 20. En pilespids angiver Edu-positive MALL og en pil angiver Edu-negative MALL. Regionen af ​​hver mall er omgivet af en stiplet linie. TUNEL, terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) -medieret dUTP nick endlabeling; Edu, 5-ethynyl-2′-deoxyuridin.

Tal i parentes angiver forholdet mellem TUNEL positive celler til Tunel negative celler.

Cell spredning i indkøbscentre

MALL består af flere umodne mukøse celler og et begrænset antal basale celler morfologisk lighed med dem i bronkier, der tjener som stamceller til bronkial epitel. Hvis umodne mukøse celler er afledt fra disse basale celler, kan det antages, at dannelsen af ​​MALL bør ledsage celledeling. For at verificere denne hypotese, gennemførte vi en spredning assay med 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EDU) inkorporeret i replikerende DNA. Først, vi indgivet en gang dagligt intraperitoneale injektioner af Edu til Aidon mus i 7 på hinanden følgende dage. Halvdelen af ​​musene blev aflivet for lunge inspektion en dag efter den sidste edu injektion (dag 1). Vi fandt et par edu-positive celler i indkøbscentre, hvilket indikerer, at disse læsioner har potentiale til at bære prolifererende celler. Efter kvantitativ analyse af erhvervede billeder, 91,1% (41/45) af indkøbscentre viste sig at indeholde Edu positive celler (fig. 5D).

Dernæst undersøgte vi lunger den resterende halvdel af Aidon mus på dag 20. Interessant kun 44,2% (19/43) af indkøbscentre havde edu positive celler (P 0,01 ved chi-square test, figur 5E.). Dette fald i edu positivitet i løbet af de første 19 dage kan fortolkes af et scenario, hvor etablerede indkøbscentre bliver til normal alveolær væv som nye, umærkede indkøbscentre genereres. Denne omdannelse menes at sænke edu positivitet. Et andet scenario er, at MALL celler undergår celledød og elimineres. Disse to muligheder udelukker ikke hinanden. Hvilket resultat er dominerende er uklart på nuværende tidspunkt.

At dømme ud fra den gradvise stigning i antallet af indkøbscentre (Fig. 2A), synes det sandsynligt, at antallet af MALL generation lidt over forsvinden sats.

MALL og lunge tumor

Vores data tyder på, at MALL ikke er en tumor, men en prolifererende slim celle metaplasi med begrænset levetid. At undersøge forholdet mellem Mall og lungetumor, der udvikler sig i omkring 10% af Aidon mus, vi først bekræftet AID-ekspression i MALL ved immunhistokemi (fig. 6A). Dette resultat var konsistent med en kvantitativ RT-PCR resultat, der viser 3 gange højere AID-ekspression i MALL end omgivende alveolær væv (S2 Fig.). Dernæst har vi undersøgt dele af adenom fra Aidon mus lunge. Interessant fandt vi, at indkøbscentre er lejlighedsvis indlejret i tumorvævet (fig. 6B og C). Endvidere er de fleste af tumorcellerne udtrykte lungen restitution markører P63, keratin 5/14, og Lgr 5/6 (fig. 6, D-H). Ekspression af disse restitution markører blev ofte begrænset til en subpopulation af tumorceller, hvilket sandsynligvis afspejler et tilfælde af intratumoral heterogenitet. Tilstedeværelsen af ​​MALL inden en kræftsvulst og dens proliferativ potentiale tyder på, at lunge tumor kan have sin oprindelse fra MALL i AID transgene mus.

A, Immunhistokemi for AID i indkøbscentre. MALL er angivet med en pilespids. B, HE farvning af lungen af ​​AID Tg mus med lunge adenom. En adenom er afgrænset af en stiplet linje. Region angivet med et rektangel er forstørret i C. C, Pilespidser indikerer indkøbscentre inden lunge adenom. Immunhistokemi for D, ΔNp63: E, keratin 5; F, keratin 14; G, Lgr 5; og H, Lgr 6 i lunge adenom.

Induktion af AID udtryk i humane alveolære epitelceller

Hvis AID udtryk induceres i alveolære epitelceller af pro-inflammatoriske cytokiner, som var vist for humane kræft i mave-tarmkanalen [5-7], ville muligheden for AID involvering i menneskelig lungekræft opstår. For at undersøge om inflammatoriske stimuli forbedre AID-ekspression i alveolære epitelceller blev processen analyseret ved kvantitativ RT-PCR i human lunge-adenocarcinom-afledte A549-celler. A549-celler blev stimuleret med TNFa, IL1β eller LT α2 /β1 til 12 og 24 timer. RNA blev derefter analyseret for AID mRNA-ekspression ved kvantitativ RT-PCR. AID udtryk lykkedes induceret 12 timer efter tilsætning af TNF eller IL1β, mens induktion af LTα2 /β1 var marginal (fig. 7).

Plottet viser resultatet af kvantitativ real-time revers transkription PCR for AID mRNA fra A549 human lunge-adenocarcinom-afledte celler stimuleret med tumornekrosefaktor (TNF) α, interleukin (IL) 1β eller lymfotoksin (LT) α2 /β1 til 12 og 24 timer. Dataene er gennemsnit ± SE; n = 3. SE, standardafvigelse.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, foreslog vi, at MALL er en slim celle metaplasi, der udvikler sig efter AID-induceret lunge alveolær skade og kunne være en præcancerøse læsion for lungekræft. Derudover har vi vist, at AID udtryk induceres i humane alveolære celler af pro-inflammatoriske cytokiner, tyder inddragelse af AID i human lunge carcinogenese.