PLoS ONE: Målretning Cadherin-17 inaktiverer Ras /Raf /MEK /ERK Signaling og Forhindrer Cell Proliferation i Gastric Cancer

Abstrakt

Cadherin-17 (CDH17), et medlem af 7D-cadherin superfamilien, blev overudtrykt i gastrisk cancer (GC) og var forbundet med dårlig overlevelse, tumor tilbagefald, metastaser, og avanceret tumor stadie. Hidtil den cellulære funktion og signalering mekanisme CDH17 i GC fortsat uklar. I denne undersøgelse viste vi, at over 66% af GC cellelinier (20/30) var CDH17 positive. Tissue microarray (TMA) assay viste, at 73,6% kinesiske GC væv (159/216) var CDH17 positive, mens 37% respektive tilstødende normale væv var CDH17 positive. Knockdown af CDH17 inhiberede celleproliferation, migration, adhæsion og kolonidannelse, og inducerede også en cellecyklus og apoptose i AGS human GC-celler. På den anden side, overekspression af CDH17 lettet MGC-803 GC tumorvækst i nøgne mus. Antistof array og Western blotting assay viste, at knockdown af CDH17 i AGS-celler nedreguleret integrin β serie proteiner, yderligere inaktiverede Ras /Raf /MEK /ERK pathway og førte til p53 og p21 akkumulering, hvilket resulterede i proliferation inhibering, celle-cyklus arrestere og apoptose induktion. Tilsammen vores data først demonstrere evne CDH17 at regulere aktiviteten af ​​Ras /Raf /MEK /ERK pathway for celleproliferation i GC, og antyder, at CDH17 kan tjene som et attraktivt terapeutisk mål for fremtidig forskning.

Henvisning: Lin Z, Zhang C, Zhang M, Xu D, Fang Y, Zhou Z, et al. (2014) Målretning Cadherin-17 inaktiverer Ras /Raf /MEK /ERK Signaling og Forhindrer Cell Proliferation i Gastric Cancer. PLoS ONE 9 (1): e85296. doi: 10,1371 /journal.pone.0085296

Redaktør: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Frankrig

Modtaget: 10 juni, 2013; Accepteret: November 26, 2013; Udgivet: 20 Jan 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser: Alle forfattere er medarbejdere eller tidligere medarbejdere i Roche R D center (Kina), undtagen Yanfen Fang, der er ansat i East China Normal University, Shanghai, Kina.. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

mavekræft (GC) er rangeret som den næststørste årsag til den globale dødelighed af kræft og den fjerde mest almindelige kræftform i verden [1], [2]. Den mediane overlevelsestid på GC patienter er 7~10 måneder. De fleste patienter med GC stede med sene sygdom med en samlet 5-års overlevelse på ca. 20% og objektive responsrater til konventionel kemoterapeutiske regimer rækkevidde kan forbedres fra 20% til 40% [1], [3]. I øjeblikket er cisplatin-baseret behandling stadig meget udbredt i kliniske indstillinger for avanceret og metastatisk GC. Hertil kommer, for HER2-neu overekspression gastriske adenokarcinomer, trastuzumab (Herceptin) i kombination med kemoterapi forlænger den mediane samlede overlevelse fra 11,1 måneder (kemoterapi alene) til 13,8 måneder [4]. I betragtning af den høje dødelighed af GC, er der stadig stor udækket medicinsk behov for at finde den følsomme og pålidelige biomarkører til tidlig diagnose af GC og potent terapeutisk mål for behandling af GC.

CDH17, et medlem af 7D-cadherin superfamilien, præsenterer i føtal lever og mave-tarmkanalen under embryogenese, således også navngivet som lever-tarm cadherin (LI cadherin). CDH17 er overudtrykt i hepatocellulært carcinom [5], [6], mavekræft [7], duktalt bugspytkirtelkræft [8] og kolorektal cancer [9] – [11]. Som rapporteret, CDH17 var hovedsageligt til stede på cellemembranen og fraværende i normale gastriske væv og den positive rate var næsten 78,4% [12]. Ekspressionsniveauet af CDH17 var karakteristisk for den avancerede gastrisk karcinom, der var forbundet med dårlig prognose [13]; og det blev også signifikant associeret med lymfeknudemetastaser i gastrisk cancer [14]. Knockdown CDH17 med lentivirus-medieret miRNA inhiberede proliferation, adhærens, tumorvækst, og metastase af BGC823 humane gastriske cancerceller både in vitro og in vivo [15] – [17]. CDH17 er blevet foreslået som et onkogen og en nyttig markør til diagnosticering af gastriske cancere [18]. Det er blevet påvist, at CDH17 medieret oncogen signalering i HCC er relateret med Wnt signalering pathway [5]. For nylig blev det rapporteret, at CDH17 tumordannelse og lymfe metastase i GC gennem aktivering af NFKB-signalvejen [19]. CDH17 reguleret α2β1 integrin signalering at inducere specifik fokal adhæsion kinase og Ras-aktivering, som førte til stigningen i celleadhæsion og spredning i colon cancerceller [11]. Men den væsentligste rolle og signaleringsmekanisme af CDH17 i GC fortsat uklar. I denne undersøgelse at validere CDH17 som et potentielt terapeutisk mål for GC og at undersøge signaleringsmekanisme af CDH17 i GC, kendetegnet vi ekspressionen af ​​CDH17 i humane GC cellelinjer og kinesiske GC væv, kontrolleres indflydelse af CDH17 knockdown eller over- udtryk på tumorigen og metastatisk effekt af GC-cellelinjer, og udforskede de mulige signal kaskader relateret til CDH17. Vi observerede en høj CDH17 ekspression i humane GC cellelinjer og kinesiske GC væv, og en klar inhibering i celleproliferation, migration, adhæsion, kolonidannelse, apoptose induktion, og cellecyklusstop efter silencing af CDH17 i humane GC cellelinier. Desuden er vores resultater først demonstrere evne CDH17 at regulere aktiviteten af ​​integrin-Ras /Raf /MEK /ERK pathway for celleproliferation i GC, og antyder, at CDH17 kan tjene som et attraktivt terapeutisk mål for fremtidig forskning.

Materialer og metoder

Etik erklæring

brug og vedligeholdelse af forsøgsdyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC), Roche R revers primer: 5′-CCTGTGTACTTCACAAAACACTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGTGTTTGGTGTGAAGTACAC-3′) af miRNA viste den højeste effektivitet og blev valgt til at pr formular BP rekombination til opnåelse pENTR-miRNA. Denne post vektor blev derefter anvendt i LR rekombination med pLenti4 /TO /V5 (Invitrogen, kat. Nr K4920-00) for at opnå pLenti4 /TO /V5-miRNA lentivirus hjælp Gateway® teknologi (Invitrogen, Cat.No.12535-019 ). Lentivirus blev anvendt til at transducere TR-AGS stabile celler og 200 ug /ml Zeocin (Invitrogen, katalog nr. R250-05) blev anvendt til at selektere for en stabil Tet-regulerede CDH17 shRNA ekspressionsceller navngivne TR-AGS-CDH17_KD stabil celle linje.

Stabil MGC-803 celler med Tet-regulerede overekspression af CDH17 gen

Kort fortalt blev CDH17 sekvens amplificeret fra PMD-18T-CDH17 plasmid (Sino Biological Inc.) og subklonet i IRES -EGFP vektor til opnåelse CDH17-IRES-EGFP ved anvendelse af primere: forward primer: 5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGATACTTCAGGCCCATCTTCAC-3 ‘; Reverse primer: 5’-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACCTTCTCAGAGGTTTGACTTCA-3 ‘). Denne konstruktion blev anvendt til at udføre BP rekombination til opnåelse pENTR-CDH17-IRES-EGFP. Så posten vektor og pLenti6.3 /TO /V5 (Invitrogen, kat. Nr V370-06) vektor blev brugt i LR rekombination at opnå pLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP. Så lentivirus blev produceret til at transducere TR-MGC-803 stabile celler og 4 pg /ml blasticidin blev brugt til at vælge for en stabil Tet-regulerede CDH17 genekspression celler navngivne TR-MGC-803-CDH17_Over stabil cellelinje.

Celleproliferationsassay

i siRNA transient transfektionsassays blev celler udsået i 10 cm skål med en tæthed på 5 x 10

6 celler /skål og transficeret med 20 nM siCDH17 eller scramble siRNA. Efter 48 timers inkubation blev cellerne adskilles og overført til 96-brønds plade med en densitet på 3000 celler /brønd, derefter inkuberet i yderligere 72 timer. Cellelevedygtigheden blev analyseret med CCK-8 kit (Donjindo, Japan). For TR-inducerbar AGS-CDH17_KD stabile celler blev celler podet i 60 mm x 15 mm skål og behandledes med eller uden Tet (0, 2,5 og 5,0 ug /ml) i forskellige tidsrum. Celler blev høstet efter 2, 3, 4, 5 og 6 dage, og celleantallet blev talt ved ScepterTM Håndholdt Automated Cell Counter (Millipore). For proliferation redning assay blev TR-inducerbare AGS-CDH17_KD stabile celler podet i 60 mm x 15 mm skål og dyrket i 10 dage med eller uden 5,0 pg /ml Tet. Til redning gruppe, blev dyrkningsmediet indeholdende Tet erstattet med frisk medium på dag 4, og cellerne blev fortsat dyrkes til dag 10. Cellerne i hver gruppe blev høstet på dag 2, 4, 6, 8 og 10 for celleantal tælling og Western blotting-analyse.

cellemigrationsassay

TR-AGS-CDH17_KD stabile celler blev podet i 10 cm skål og behandledes med eller uden Tet (5 ug /ml). Efter 120 timers dyrkning blev cellerne opsamlet og talt. 0,1 ml cellesuspension (1, 2, 3 × 10

4 celler /ml) blev tilsat til det øvre rum af kammeret. 0,6 ml 10% FBS-medium blev tilsat til det nedre rum som kemo tiltrækningsstof. Efter 24 timers inkubation ved 37 ° C blev cellerne fikseret med 90% EtOH ved 4 ° C i 30 minutter og derefter farvet med 0,1% krystalviolet i 15 minutter. De ikke-vandrende celler blev fjernet fra den øvre flade af transwell membran med en vatpind. De farvede celler blev efterfølgende fotograferet og talt under lysmikroskopi.

celleadhæsionsassay

TR-AGS-CDH17_KD stabile celler blev podet i 10 cm skål og behandledes med eller uden Tet (5 ug /ml). Pre-coating af plader med 96 brønde blev udført ved at inkubere brøndene med 25 ug /ml fibronectin ved 4 ° C natten over. For at reducere ikke-specifik binding blev 1% bovint serumalbumin (BSA) tilsat til hver brønd og inkuberet i 60 minutter ved 37 ° C blev BSA vasket to gange med sterilt PBS. 120 timer efter knockdown CDH17 med Tet, blev celler opsamlet og udsået i præcoatede plader med 96 brønde med 4 x 10

4 celler /brønd. 2 timer senere blev ikke-adhærente celler fjernet ved vask med sterilt PBS for to gange. De adhærente celler blev analyseret ved CCK-8 kit.

Kolonidannelse assay

Først blev 6-brønds plader fremstillet med bund agar lag (0,6% gel). Derefter, TR-AGS-CDH17_KD celler eller siCDH17 transficerede celler (som proliferation assay) blev suspenderet i komplet medium indeholdende 0,3% -0.4% Noble agar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og podet i forberedt 6-brønds plade og dyrket i 7 eller 14 dage. Celler blev farvet med thiazolyl blå tetrazolium (MTT) i 2 timer. Antallet af cellekolonier blev talt.

Cellecyklusanalyse

TR-AGS-CDH17_KD stabile celler blev podet i en plade med seks ved 1,0 × 10

5 celler /brønd og behandlet med 5 ug /ml Tet. 120 timer senere blev celler høstet med trypsin og fikseret med EtOH ved 4 ° C i 3 timer. Derefter blev cellerne centrifugeret ved 1.500 g i 5 minutter og vasket med PBS. Resuspenderede celler i RNase /PBS opløsninger (20 ug /ml), inkuberet ved 37 ° C i 15 minutter, derefter tilsat PI /PBS opløsninger (20 ug /ml) og inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter, inspicerede de farvede celler med BD FACS Calibur og analyseret data med BD CellQuest Pro-softwaren.

Apoptose analyse

TR-AGS-CDH17_KD stabile celler blev podet i en plade med seks ved 1,0 × 10

5 celler /brønd og behandlet med 5 ug /ml Tet. 120 timer senere blev celler høstet med trypsin og vasket med forafkølet PBS én gang. Celler blev resuspenderet i 500 pi 1 × bindingsbuffer og 5 pi PI og 5 pi AnnexinV (BD) blev tilsat. Efter inkubation i mørke (stuetemperatur) i 10 minutter blev de farvede celler undersøges med BD FACS Calibur. De indsamlede data blev analyseret med BD CellQuest Pro software.

Western blotting-analyse

Celler blev lyseret ved RIPA puffer [150 mM NaCl, 1% NP40, 0,25% deoxycholat og 10 mM Hepes (pH 7,4)] indeholdende en proteasehæmmer cocktail (Roche Molecular Biochemicals). Proteinkoncentrationer blev kvantificeret under anvendelse af bicinchoninsyre (BCA) -metoden (Pierce). Tredive mikrogram protein pr prøve blev kogt i ladningsbuffer og elektroforesebehandlet i 8-12% gradient SDS polyacrylamidgeler (Invitrogen) og overført til nitrocellulosemembraner. Membranerne blev probet med antistoffer (CDH17, Integrin p1, integrin β4, Integrin β5, p-p53, p53, p21 var fra R 0,05 blev anset for at være betydelige

Resultater

Expression profil CDH17 i mavekræft

Udtrykket niveau CDH17 proteiner i 30 cellelinjer blev kategoriseret. i 4 grupper baseret på data fra optisk tæthed analyse mod beta-actin. AGS cellelinje blev anvendt som intern standard for at undgå uoverensstemmelsen mellem geler. Over 66% af GC cellelinier (20/30) var CDH17 positive (figur 1A).

(A) Tredive gastriske cellelinier lyseres og underkastes Western blot-analyse (til venstre). Alle testede celler er kategoriseret i 4 ekspressionsniveau af CDH17, Høj, Median (Medi), lav, ikke påvist (ND), baseret på optisk densitet-analyse mod beta-actin (til højre); (B) Repræsentant IHC billeder fra patient 1 (veldifferentieret gastrisk kræft væv), patient 2 (dårligt differentieret gastrisk kræft væv) og patient 3 (tilstødende normale væv); CDH17 viste klar placering membran i tumor eller tilstødende væv; (C) Repræsentant IHC billeder af positiv CDH17 pletten med scoring fra + til +++.

udtryk og lokalisering af CDH17 i primært væv paraffin afsnit blev opdaget ved immunhistokemi på væv microarrays. Sammenlignet med kontrolobjektglas farvet af normal mus IgG, CDH17 mAb farvning blev demonstreret klart cellemembran lokalisering (figur 1B). Blandt 216 tilfælde med bekræftet patologi diagnose rapport, 73,6% ondartede væv (159/216) nærede positiv CDH17 pletten med scoring fra + til +++, mens 37% positive CDH17 plet i respektive tilstødende normale væv (tabel 1). I CDH17 positive tilfælde, ekspressionsniveauet af CDH17 har positiv korrelation med lymfeknudemetastaser. Imidlertid er ekspressionsniveauet omvendt forbundet med mavevæggen invasion, tumor fjernmetastaser, og tumor TNM stadier. Vores observation var i overensstemmelse med tidligere kliniske rapporter [20] – [22]. Blandt CDH17 positive tilfælde, cancervæv udviste stærkere farvning af CDH17 (32,1% som scoring +, 25,2% som scoring ++ og 42,8% som scoring +++) end de tilstødende normale væv (62,5% som scoring +, 21,3% som udføre ++ og 16,3% som scoring +++). Mens ikke blev observeret nogen signifikant sammenhæng mellem pletten scoring og klinisk fase. Tager alt dette dokumenterer sammen, kan CDH17 være en diagnostisk markør for tidligt mavekræft i kinesiske befolkningsgrupper.

RNAi-medieret vælte CDH17 på GC-cellelinjer viste undertrykkelse af celledeling og kolonidannelse in vitro

Baseret på resultaterne af CDH17 ekspressionsprofil i et panel af GC cellelinier (fig 1A) AGS (højere CDH17), BGC-823 (lavere CDH17) og HGC-27 (none CDH17) cellelinier blev udvalgt til yderligere in vitro cellulære funktionel vurdering med RNAi-medieret CDH17 lyddæmpning. Western blotting viste, at AGS celler havde højt CDH17 proteinniveau og udtryk for CDH17 blev slået ned næsten helt af siCDH17. BGC823 celler havde lavt CDH17 proteinniveauet og HGC-27 havde ingen CDH17 protein (figur 2A). Sammenlignet med scramble kontrolceller, CDH17 vælte havde lille indvirkning på den proliferative evne BGC823 og HGC27 celler, hvorimod haft dramatisk effekt på AGS (med 60% efter 72 timer, figur 2B). Blød agar-assay viste, at evnen til at danne koloni blev inhiberet i AGS celler hvis CDH17 var knock down (med 66% ved 14 d), men i BGC823 celler og HGC27 celler, CDH17 vælte havde ringe virkning på kolonidannelse evne (figur 2C). Der var ikke indlysende forskel mellem BGC823 celler (lav CDH17 niveau) og HGC-27cells (ikke-CDH17) i hæmning af spredning og kolonidannelse induceret af siRNA CDH17 knockdown.

(A) siRNA knock-down effektivitet blev bekræftet ved Western blotting 48 timer efter transfektion med 20 nM siCDH17 eller scramble siRNA; (B) Proliferation assay. Cellerne blev transficeret med 20 nM siCDH17 eller scramble siRNA i 10 cm skåle. 48 timer senere blev cellerne suspenderet, og podet i 96-brønds plader. Cellelevedygtigheden blev analyseret med CCK-8 celleproliferation kit 72 timer efter podning. Forsøget blev udført i tre eksemplarer, og dataene blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse; (C) Kolonidannelse assay. Cellerne blev transficeret med siCDH17 som proliferationsassay og podet i plader med 6 brønde. Kolonierne blev talt under mikroskop efter farvet med MTT 14 dage efter podning. Forsøget blev udført i tre eksemplarer og de typiske billeder blev vist. Dataene blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse.

Stabile cellelinjer der bærer TR inducerbare knockdown af CDH17 i AGS celler og overekspression af CDH17 i MGC-803 celler

Målet sekvens i exon13 (90-2) gav over 90% reduktion i mRNA-niveau (figur 3A). Derefter brugte vi pLenti4 /TO /V5-miRNA-90-2 CDH17 lentivirus at transducere TR-AGS stabile celler og fik en stabil Tet-regulerede udtryk shRNA af CDH17 gen celler (TR-AGS-CDH17_KD), som CDH17 proteinniveauet blev reduceret omkring 90% efter induceret med 5 ug /ml Tet (figur 3B). Den pLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP lentivirus blev anvendt til at transducere TR-MGC-803 stabile celler og udvalgt med blasticidin at få en stabil Tet-regulerede udtryk CDH17 gen celler (TR-MGC-803-CDH17_Over) . Den overekspression af CDH17 i denne stabile celle blev bekræftet på proteinniveau ved Western blotting (figur 4A).

Forskellige assay blev beskrevet i materialer og metoder. (A) Real-time PCR-analyse viste knock ned af CDH17 på mRNA niveau i AGS celler (C), AGS celler forbigående transficeret med pcDNA

TM6.2-GW /EmGFP-scramble miR plasmid (NC) og pcDNA

TM6.2-GW /EmGFP-CDH17 MIR plasmider (90-1, 90-2, 90-3, og 90-4); (B) Western blotting for virkningen af ​​CDH17 knockdown anvendelse af forskellige koncentrationer af Tet i 48 timer i TR-AGS-CDH17_KD celler; (C) Cell proliferation, migration (6 dage efter behandling), friktion (6 dage efter behandling **

P

. 0,01). Og kolonidannelse i blød agar (7 dage efter behandling **

P

0,01); (D) Proliferation redning assay. TR-inducerbare AGS-CDH17_KD stabile celler blev podet i 60 mm x 15 mm skål og dyrket i 10 dage med eller uden 5,0 pg /ml Tet. Til redning gruppe, blev dyrkningsmediet indeholdende Tet erstattet med frisk medium på dag 4, og cellerne blev fortsat dyrkes til dag 10. Cellerne i hver gruppe blev høstet på dag 2, 4, 6, 8 og 10 for celleantal tælling (venstre) og Western blotting-analyse (til højre); (E) Cellecyklusanalyse efter celler blev behandlet med 5,0 ug /ml Tet i 6 dage; og (F) Cell apoptose analyse efter celler blev behandlet med 5,0 ug /ml Tet i 6 dage ved flowcytometri

(A) Western blotting viste induktion effektivitet CDH17 overekspression.; (B) Tumorvækst i nøgne mus. Når tumorvolumen nåede -100 mm

3, drikkevandet blev erstattet med 2,5% sucrose indeholdende 0,2 mg /ml Tet eller ej. *

P

0,05, Tet-on gruppe vs Tet-fri gruppe; (C) Western blotting analyse af xenograft tumorvæv.

Knockdown af CDH17 induceret hæmning i celleproliferation, migration, adhæsion, kolonidannelse og induktion i celle-cyklus anholdelse og apoptose

TR-AGS celler (kontrol celler) og TR-AGS-CDH17_KD celler blev brugt til at vurdere de potentielle cellulære funktionelle virkninger af shRNA-medieret CDH17 knockdown i AGS celler. TR-AGS-CDH17_KD celler behandlet med 5 ug /ml Tet viste en reduktion i celleproliferation (med 75,8% ved 5 dage), cellemigration evne (med 68,1% ved 16 timer), celleadhæsion evne (med 46,8% ved 30 minutter ), og kolonidannende evne (med 92,7% efter 7 dage) sammenlignet med Tet fri (figur 3C). I spredning redning studie, kan CDH17 knockdown i TR-AGS-CDH17_KD celler induceret af Tet reddes ved at fjerne Tet. Efter at have fjernet Tet på dag 4, blev re-ekspressionen af ​​CDH17 observeret på dag 8 og 10 i kulturen i CDH17 shRNA Knockdown AGS celler. Re-ekspressionen af ​​CDH17 kunne redde spredning evne TR-AGS-CDH17_KD celler (Figur 3D). Sammenlignet med Tet free TR-AGS-CDH17_KD celler, Tet på celler viste signifikant større procentdel af celler i G0 /G1 og G2 /M-fasen og en dramatisk afdød procentdelen af ​​celler i S-fase (Figur 3E). I mellemtiden, vi bemærkede også, at antallet af apoptotiske celler (med 52,2% ved 5 dage) blev øget med nedregulering af CDH17 i TR-AGS-CDH17_KD celler (Figur 3F). Ingen signifikant forskel blev fundet i TR-AGS stabil cellelinje med eller uden Tet inkubation.

Overekspression af CDH17 fremmet væksten af ​​tumorxenoplantater i nøgne mus

TR-MGC-803-CDH17_Over celler blev injiceret subkutant i flankerne af nøgne Balb /c-mus til dannelse af faste tumor. Ekspressionen af ​​CDH17 var under kontrol af Tet i drikkevandet. Resultaterne viste, at efter 35 dages induktion, Tet-induceret gruppe (tumorvolumen = 1849,08 ± 423.46m3) udviste en 2,27 gange højere vækst fremskridt rate versus Tet-fri gruppe (tumorvolumen = 814,04 ± 234.69m3) (p 0,05) ( Figur 4B), og induceret CDH17 ekspression i tumorvæv kan analyseres ved Western blotting (figur 4C). Det viste, at CDH17 spiller en vigtig rolle i carcinogenese af mavekræft. Vi brugte også TR-AGS-CDH17_KD celler at observere, om tavshed af CDK17 kan påvirke tumorigenicitet i nøgne mus. Desværre tumoren tage på denne cellelinie var meget lav og ingen pålidelige in vivo resultater blev observeret med TR-AGS-CDH17_KD cellelinje.

Bestemmelse det beslægtede protein-niveauer efter knockdown CDH17 af antistof arrays assay

Ifølge de tumorgene virkninger (inhibering af celleproliferation, kolonidannelse, og tumorvækst in vivo) og metastatiske virkninger (inhibering af cellemigration og adhæsion) af CDH17 knockdown, vi vælger tre antistof-arrays (blandt R (B) Ændring forhold mellem beslægtede proteiner mellem Tet-on og Tet-frie celler; (C) Ændringer af relaterede proteiner, der findes i antistof-array assay blev bekræftet ved hjælp af Western blot analyse.

Knockdown af CDH17 i AGS nedreguleret Ø-integriner og Ras /Raf /MEK /ERK signalvej

protein ændres fra antistof-array-assay blev bekræftet ved Western blotting-analyse. Resultaterne indikerede en betydelig reduktion af integrin β1, β4, β5 og phospho-ERK i CDH17 knockdown AGS-celler, men ingen signifikant ændring i den samlede ERK (figur 5C). Derefter evaluerede vi inddragelse af andre Ras /Raf /MEK /ERK signalvej komponenter. Knockdown af CDH17 resulterede i nedregulering af Raf, phospho-MEK, og phospho-ERK proteiner (figur 5C). Fra TR-MGC-803-CDH17_Over in vivo-undersøgelse, observerede vi overekspression af CDH17 forbedret integrin β1, β4, β5 udtryk og ERK aktivering (figur 4C), og det er i overensstemmelse med ovennævnte resultater.