PLoS ONE: opregulering af pVHL sammen med nedregulering af HIF-1α af NDRG2 Expression Dæmper spredning og invasion i Renal Cancer Cells

Abstrakt

De fleste nyrecellecarcinomer (RCCS) er karakteriseret ved tab af funktion af tumorsuppressorgen von Hippel Lindau (VHL), der virker som ubiquitinligase for hypoxi-inducerbar faktor-1α (HIF-1α). I mangel af VHL, bliver HIF-1α protein stabiliseret og bidrager til tumorigenese. De seneste data viser antitumorvirkningen af ​​VHL promotor i RCC celler. Denne undersøgelse viser, at N-Myc nedstrøms-reguleret gen 2 (NDRG2) er en potentiel regulator af VHL. NDRG2 er involveret i proliferation og invasion af kræftcelle, det er desuden ofte nedreguleret i renalcellecarcinom. Heri vi evaluerede effekten af ​​NDRG2 overekspression på spredning og invasion i humane nyre kræftceller. Den menneskelige renal cancer cellelinje 786-O og A498 blev inficeret med Ad-NDRG2 eller Ad-LacZ. Overekspression af NDRG2 inhiberede ikke alene væksten af ​​cellerne, men også undertrykt invasionen. Yderligere undersøgelse viste, at tumorsuppressorgenet VHL opreguleret, hvorimod transkriptionsfaktor HIF-1a og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) blev nedreguleret i 786-O-celler inficeret med Ad-NDRG2. Endelig i en nøgen musemodel, intratumorale injektioner af Ad-NDRG2 hver 3 dage for i alt syv gange inhiberede signifikant vækst og angiogenese af xenotransplanterede 786-O tumorer. Som konklusion indikerer disse data, at NDRG2 kan være involveret i proliferation og invasion ved at påvirke ekspressionen af ​​VHL og HIF-1α. NDRG2 kan være et attraktivt terapeutisk mål for renalcellekarcinom.

Henvisning: Gao L, Wu G-j, Liu B, Shen M-z, Pan T-j, Yu C-g, et al. (2013) opregulering af pVHL sammen med nedregulering af HIF-1α af NDRG2 Expression Dæmper spredning og invasion i Renal kræftceller. PLoS ONE 8 (12): e84127. doi: 10,1371 /journal.pone.0084127

Redaktør: Georgios Gakis, Eberhard-Karls Universitet, Tyskland

Modtaget: Juli 9, 2013; Accepteret: November 12, 2013; Udgivet: December 20, 2013 |

Copyright: © 2013 Gao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansiering forudsat af National Natural Science Foundation of China (nr 81.230.043 og nr 81.272.812) og kinesisk National Key Basic Research Development Program (2009CB521704). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Renalcellecarcinom (RCC) er blandt de 10 mest almindelige maligne sygdomme i både mænd og kvinder [1]. RCC omfatter en histologisk forskelligartet gruppe af faste tumorer, som opstår fra forskellige dele af [2] nyre. Langt størstedelen af ​​RCCS er klare cell renal cell carcinoma (CCRCCs), kendetegnet ved tab af funktion af tumorsuppressorgen von Hippel Lindau (VHL). Defekter i VHL-genet er den mest almindelige årsag til familiær CCRCC, og mere end 80% af patienter med sporadisk CCRCC har et inaktivt VHL-genet eller tab af VHL-genet [3].

VHL er en klassisk værge hæmme renal tumor initiering [4-6]. Proteinet VHL kodes af VHL-genet, er en bestanddel af en E3 ubiquitin ligaser kompleks, som omfatter elongin-B, elongin-C og Cullin-2 [7,8]. Blandt de veldokumenterede substrater af pVHL er hypoxi-inducerbare faktor (HIF-1α), som er en transkriptionsfaktor, der styrer ekspressionen af ​​hypoxi-inducerede faktorer såsom pyruvatdehydrogenase-kinase (PDK) -1, vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og så videre [9,10]. Disse mål gener har indflydelse på energiomsætningen, celledeling og metastase af CCRCC [11]. Under normal oxygen, HIF-1α binder pVHL gennem sine hydroxylerede prolin-rester og polyubiquitinated af pVHL, hvilket i sidste ende fører til nedbrydning af HIF-1α via proteasomet. Under hypoxi, HIF-1α er ikke hydroxyleret og undslipper fra pVHL-medieret nedbrydning. Den labile HIF-1α danner derefter funktionel transcription faktor ved at associere med konstitutivt udtrykte HIF-1β underenhed [12]. Tilsammen dette kompleks binder til DNA-motiver benævnt hypoxi responselementer at regulere ekspressionen af ​​flere gener involveret i celleproliferation, metastase og angiogenese. Derfor, ved at fremme nedbrydning af HIF-1α, kan pVHL undertrykke HIF-1α stimulerede transkription og fungere som en nøgle tumorsuppressor [13]. pVHL tab er en almindelig hændelse i CCRCC, hvilket fører til HIF-1α stabilisering og opreguleringen af ​​dets målgener. Det er blevet vist, at VEGF-ekspression ofte forhøjet sammen med HIF-1α opregulering i mange humane cancere [14]. En tidligere undersøgelse viste, at pVHL er i stand til at forbedre ekspressionen og aktiviteten af ​​et andet velkendt tumorsuppressor, p53 [14]. Men hvordan pVHL selv er reguleret har sjældent været rapporteret,. De seneste data har vist antitumor effekt af en pVHL promotor i RCCS [15].

N-myc Downstream Reguleret Gene 2 (NDRG2), er et medlem af NDRG familien, er et nyligt identificeret tumor suppressor. Det er blevet rapporteret, at NDRG2 ekspression nedreguleres i en række forskellige carcinomer, herunder leverkræft, pancreascancer, meningeom og prostatacancer. Undersøgelser fra vores laboratorium og andre har vist, at NDRG2 er involveret regulering af celleproliferation, apoptose, differentiering og stress respons [16-21]. Notatet vores tidligere undersøgelse indebar, at NDRG2 opreguleret udtrykkene for p53 og pVHL mens nedregulerer udtrykkene for VEGF og HIF-1α i brystcancercellelinier [22]. For nylig er det rapporteret, at NDRG2 nedreguleres i CCRCC væv sammenlignet med tilstødende ikke neoplastiske væv [23]. Desuden tvungen ekspression af NDRG2 hæmmer væksten af ​​clear cell RCC (CCRCC) cellelinier og inducerer celle apoptose [24]. Disse resultater tyder på, at NDRG2 spiller en vigtig rolle i carcinogenese af CCRCC. Men den nøjagtige rolle af NDRG2 i CCRCC ikke fuldt forstået.

I denne undersøgelse, vi har forsøgt at undersøge, om der er en regulatorisk sammenhæng mellem NDRG2 og pVHL. Vi først undersøgt udtryk korrelation mellem NDRG2 og pVHL i tumorvæv fra CCRCC patienter. Derefter udførte vi

in vitro

og

in vivo

eksperimenter for at undersøge effekten af ​​NDRG2 overekspression på celle adfærd, samt på ekspressionen af ​​pVHL og dens downstream effektorer, HIF-1α og VEGF .

Materialer og metoder

Etik Statement

Humane prøver blev indhentet fra alle patienter med skriftligt informeret samtykke. Både skriftligt informeret samtykke og undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board af Xijing Hospital, Fjerde Military Medical University. Musene anvendt i denne forskning blev opnået fra den fjerde Military Medical University og blev holdt ved patogenfrie betingelser. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af Institutional Review Board af Xijing Hospital, fjerde Military Medical University og var i overensstemmelse med de NIH retningslinjer for etisk brug af dyr.

Tissue indsamling og immunhistokemi

i alt 130 formalinfikserede paraffinindlejrede eksemplarer af primær klar celle renalcellecarcinom og deres tilstødende normale nyrevæv blev indsamlet i Patologisk Institut for Xijing Hospital, Xi’an, Kina. Alle prøver blev opnået fra patienter, som gav informeret samtykke til at bruge overskydende patologiske prøver til forskningsformål. Alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke. Brugen af ​​humane væv i denne undersøgelse blev godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelsen for fjerde Military Medical University og blev gennemført i overensstemmelse med de internationale retningslinjer for brug af humane væv. Anti-NDRG2 (1: 500 fortynding) antistoffer blev indkøbt fra BD Corporation (BD, NY, USA). Anti-HIF-1a (1: 500 fortynding) og anti-VEGF (1: 1000 fortynding) antistoffer var fra Santa Cruz Technology (Santa Cruz, CA, USA). Anti-VHL-antistof (1: 500 fortynding) var fra NeoMarkers Corporation (Taipei, Kina). Anti-β-actin-antistof (1: 2000 fortynding) var fra Sigma (Sigma, USA). Den immunhistokemi kit blev købt fra Boster Company (Wuhan, CHN).

immunhistokemi farvning blev udført ifølge producentens anvisninger. Både intensiteten og omfanget af immunologisk farvning blev analyseret semikvantitativt. blev bedømt sektioner uden mærkning eller med færre end 5% mærkede celler som 0. Snit blev scoret som en 1 hvis 5-25% af celler blev mærket, som en 2 hvis 25-50% af celler blev mærket, og som en 3 hvis 50-75% af celler blev mærket. Endelig mærkning af ≥75% af cellerne blev scoret som en 4. farvningsintensitet blev scoret på lignende måde med 0 anvendes til negativ farvning, 1 for svagt positiv, 2 for moderat positivt og 3 for stærkt positiv. Scorerne for procentdelen af ​​positive celler og til farvningsintensitet blev multipliceret at generere et immunoreaktivt score for hver prøve. Produktet af mængde og intensitet scoringer blev beregnet således, at en endelig score på 0 indikerede ingen udtryk, 1-4 angivne svag udtryk, 5-8 angivne moderat udtryk og 9-12 angivet stærkt udtryk. De billeder blev indsamlet gennem lysmikroskopi (Olympus, Japan).

cellelinjer og reagenser

Humane renal cancer cellelinjer 786-O og A498 blev indhentet fra American Type Culture Collection (ATCC, USA). Cellelinjerne blev opretholdt i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO

2. For hypoxi behandling blev celler dyrket under hypoxiske betingelser (1% O

2, 5% CO

2 og 94% N

2) og høstet ved 24 timer efter infektion.

Cell vækst-assay

celler blev podet (5 x 10

3 celler pr brønd) i tre eksemplarer i 96-brønds plader. Efter fjernelse af mediet, 40 MOI adenovirus, der udtrykker NDRG2 [24] eller den negative kontrol genet LacZ (Ad-LacZ) blev tilsat i serumfrit RPMI 1640, inkuberet i 2 timer, erstattet med frisk RPMI 1640 suppleret med 10% FBS. Pladerne blev derefter inkuberet i 0, 24, 48 og 72 timer. Antallet af levedygtige celler blev bestemt under anvendelse af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay og aflæsning af absorbansen ved 490 nm. Dataene er den gennemsnitlige ± standardafvigelse for tre uafhængige forsøg. Salg

Migration og invasion analyser

Cell migration og invasion analyser blev udført i det væsentlige som beskrevet tidligere [15]. Invasion assay med en Matrigel-coated membran og migration assay med en Matrigel-ubestrøget membran blev udført under anvendelse af en 24-brønds kammer-system (BD Biosciences, Bedford, MA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Cellerne blev trypsinbehandlet og podet i det øvre kammer ved 2,5 x 10

5 celler /brønd i serum-frit medium. Den vektor, der bærer LacZ eller NDRG2, ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 40, blev straks tilsat efter celleudpladning. Medium suppleret med 5% FBS (anvendt som kemo-tiltrækningsstof) blev anbragt i bunden godt. Inkubation blev udført i 24 timer ved 37 ° C i befugtet luft med en CO 5%

2 atmosfære. Cellerne fik lov til at migrere gennem et porøst, Matrigel-coated eller membran (BD Biosciences). Efter inkubationen blev kamrene fjernet, og invaderende celler på undersiden af ​​membranen blev fikseret med methanol og farvet med Gimsa. Antallet af invaderende celler eller migrerende celler blev bestemt ved at tælle fem high-power felter (× 400) på hver membran og beregnes som det gennemsnitlige antal celler pr. Dataene er gennemsnittet ± standardafvigelse for tre uafhængige forsøg.

Western blotting-analyse

Celler blev podet (5 x 10

5 celler pr brønd) i tre eksemplarer i plader med 24 brønde . Efter fjernelse af mediet, 40 MOI Ad-NDRG2 eller Ad-LacZ blev tilsat i serumfrit RPMI 1640, inkuberet i 2 timer, erstattet med frisk RPMI 1640 suppleret med 10% FBS. Efter dyrkning i 24 timer blev cellerne vasket med koldt PBS og straks lyseret i en lysebuffer [1% Triton X-100.150 mmol /l NaCl, 100 mmol /L KCI, 20 mmol /l HEPES, 10 mmol /l EDTA, 1 mmol /l natriumorthovanadat, 10 ug /ml aprotinin, 10 ug /ml leupeptin og 1 pmol /l phenylmethylsulfonylfluorid] på is. Western blotting-analyse blev udført ifølge standardprotokollen under anvendelse nitrocellulosemembraner (Bio-Rad). For immunoblotting blev membraner inkuberet med de primære antistoffer natten over ved 4 ° C, efterfulgt af 2 timers inkubering med en 1: 2.000 fortynding af peberrodsperoxidase (HRP) -bundet sekundært antistof. Endelig blev de immunreaktive proteiner detekteret af kemiluminescens påvisningssystem.

immunofluorescensbestemmelse Salg

786-O-celler blev podet på dækglas. Efter fjernelse af mediet, 40 MOI Ad-NDRG2 eller Ad-LacZ blev tilsat i serumfrit RPMI 1640, inkuberet i 2 timer, erstattet med frisk RPMI 1640 suppleret med 10% FBS. Pladerne blev derefter inkuberet som beskrevet ovenfor i 24 timer. Efter permeabilisering (0,5% Triton X-100), fiksering (4% formaldehyd), og blokering (10% normalt gedeserum og 0,5% Triton X-100), muse anti NDRG2, VHL, HIF-1α og VEGF monoklonalt antistof var tilsat til celler til natten over ved 4 ° C hhv. Celler blev derefter farvet med FITC-konjugeret eller Cy3-konjugeret gede-anti-muse-polyklonale antistof ved 37 ° C i 2 timer i mørke. Fluorescensen farvningsintensitet blev derefter undersøgt ved immunfluorescensmikroskopi.

ELISA

Celler blev podet (5 x 10

5 celler pr brønd) i tre eksemplarer i 24-brønds plader. Efter fjernelse af mediet, 40 MOI Ad-NDRG2 eller Ad-LacZ blev tilsat i serumfrit RPMI 1640, inkuberet i 2 timer, erstattet med frisk RPMI 1640 suppleret med 10% FBS. Konditionerede medier af 24T cellekulturer blev analyseret for VEGF ved anvendelse af kommercielle sandwich ELISA kits (Endogen, Woburn, MA, USA) ifølge producentens anvisninger. Hver prøve blev testet in duplo. Data blev udtrykt i VEGF (pg /ml).

væksthæmning analyser

in vivo

Seks uger gamle BALB /C athymiske (nu /nu) mus blev leveret af Experimental Animal center den fjerde Military Medical University (Xi’an, Kina). Alle protokoller blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg på den fjerde Military Medical University og blev udført i overensstemmelse med reglerne dyr pleje fastsat af universitetet (Permit nummer: 10001). blev gjort alt for at nedbringe antallet af dyr, der anvendes og for at minimere deres lidelser. 786-O-celler blev høstet og resuspenderet i sterilt PBS. 786-O-celler (5 x 10

6 celler) i 0,2 ml blev injiceret subkutant i den venstre flanker 6 uger gamle nøgne mus. Når gennemsnittet størrelse af tumorer nåede 200 mm

3, alle musene blev inddelt i tre grupper tilfældigt (Ad-NDRG2, Ad-LacZ og PBS kontrolgrupper, n = 10 per gruppe). Intratumorale injektioner af adenovirus (1 × 10

9 pfu i 100 ul PBS) blev foretaget hver 3 d for i alt syv gange. Tumorvolumener blev beregnet baseret på caliper målinger af længden (a) og bredde (b) af læsionerne ved anvendelse af følgende formel: V = ab

2/2. Vækstkurven blev derefter udledt fra disse data. Betingelserne for musene blev overvåget dagligt, og mus overlevelse blev registreret i forsøgsperioden. Musen blev aflivet ved cervikal dislokation, når det viste kakeksi, der blev karakteriseret som en samlet tilstand af dårligt helbred, ledsaget af et tab af mager kropsmasse og fedtmasse, svaghed, træthed, træghed, faldt voldsomt fødeindtagelse, ascites og anoreksi [25]. Alle ofre blev udført under bedøvelse (130 mg ketamin /8,8 mg xylazin /kg legemsvægt). Derefter tumorprøver blev fjernet for at forberede paraffinsnit til histologisk farvning. Ekspressionsniveauerne af NDRG2, pVHL, HIF-1α, VEGF-proteinet i de inokulerede tumorer blev påvist under anvendelse af histologi og immunhistokemi, som beskrevet ovenfor.

Statistisk analyse

De statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS softwareversion 19,0. Sammenligninger mellem grupper blev foretaget ved anvendelse af envejs ANOVA-analyse og Fishers eksakte test. Kaplan-Meier-kurver og log-rank tests blev anvendt for overlevelse analyse.

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Angivelse af NDRG2, pVHL og HIF-1α i normale nyre væv og CCRCC væv

For at bestemme, om reguleringen mellem NDRG2 og pVHL eksisterer i CCRCC første opdaget vi udtryk for NDRG2 og de af pVHL og HIF-1α i 130 CCRCC prøver og de parrede normale væv. Som vist i tabel 1 og figur 1, hastigheden af ​​NDRG2 positiv ekspression i CCRCC vævsprøver var 30,0% (figur 1A og 1B), hvilket var signifikant lavere end i normalt nyrevæv 60,0% (Figur 1G og 1H) (

P

= 4,40 × 10

-9). Og hastigheden af ​​pVHL positivt udtryk i CCRCC vævsprøver (figur 1C og 1D) var også signifikant lavere end i normalt nyrevæv (Figur 1I og 1J) (26,9% vs. 66,2%,

P

= 3,02 × 10

-10). Tværtimod, satsen for HIF-1α positivt udtryk i CCRCC vævsprøver (figur 1E og 1F) var signifikant højere end i normalt nyrevæv (figur 1K og 1L) (55,4% vs. 33,7%,

P

= 0,006). Som vist i figur 1 M og 1 N, ekspressionsniveauerne af NDRG2 var positivt korreleret med de pVHL i CCRCC vævsprøver (

r

= 0,749,

P

= 3.25 × 10

-5), mens ekspressionsniveauerne af NDRG2 negativt blev korreleret med de HIF-1α i CCRCC vævsprøver (

r

= -0,331,

P

= 1,85 × 10

-3).

Group

undergruppe

Negativ (%)

Positiv (%)

χ

2

P

værdi

NDRG2 CCRCC tissue91 (70,0) 39 (30,0) 23,64

P

= 4,40 × 10

-9normal renal tissue52 (40,0) 78 (60,0) pVHLCCRCC tissue95 (73,1) 35 (26,9) 40.21

P

= 3,02 × 10

-10normal renal tissue44 (33,8) 86 (66,2) HIF-1αCCRCC tissue58 (44,6) 72 (55,4) 8,18

P

= 0,006 normal renal tissue81 (62,3) 49 (37,7) tabel 1. Angivelse af NDRG2, pVHL og HIF-1α i normale nyre væv og CCRCC væv.

CSV Hent CSV

Repræsentative mikrofotografier af immunhistokemisk farvning for NDRG2, pVHL og HIF-1αin normal renal væv og CCRCC væv. (A og B) NDRG2 udtryk i CCRCC væv (200 × forstørrelse). (C og D) pVHL udtryk i CCRCC væv (200 × forstørrelse). (E og F) HIF-1α ekspression i CCRCC væv (200 ganges forstørrelse). (G og H) NDRG2 udtryk i normale nyretubuli (200 × forstørrelse). (I og J) pVHL udtryk i normale nyretubuli (200 × forstørrelse). (K og L) HIF-1αexpression i normale nyretubuli (200 × forstørrelse). (M) Ekspressionsniveauerne for NDRG2 er positivt korreleret med de pVHL. (N) Ekspressionsniveauerne for NDRG2 er negativt korreleret med de HIF-1α. Antallet af prøven blev vist som “skala”. Forskellene på tværs af grupper blev analyseret ved hjælp af Pearson korrelationskoefficient og grafen blev genereret af SPSS19.0 software.

NDRG2 overekspression hæmmer proliferation af humane renale cancerceller

in vitro

for at undersøge virkningerne af NDRG2 overekspression på væksten af ​​humane renale cancerceller, vi brugte Ad-LacZ eller Ad-NDRG2 at inficere 786-O-celler og A498 celler. Efter infektion i 24 timer, stærk ekspression af NDRG2 protein i 786-O-celler (figur 2A) og A498-celler (figur 2B) blev bekræftet ved Western blot-analyse under anvendelse af et monoklonalt antistof mod NDRG2. Inhibering i celleproliferation blev målt med MTT-assayet 12, 24, 36, 48, 60 og 72 timer efter infektion. Som vist i figur 2C og 2D, Ad-LacZ havde ingen signifikant virkning på celleproliferation i enten cellelinjer sammenlignet med kontrolgruppen (

P Drømmeholdet værdi på 24, 36, 48, 60 og 72 timer er 0,55, 0,61 , 0,96, 0,98 og 0,60 i henholdsvis 786-O-celler;

P Drømmeholdet værdi er 0,60, 0,68, 0,60, 0,15 og 0,60 i henholdsvis A498 celler). Imidlertid blev celledeling hæmmet betydeligt i Ad-NDRG2-inficerede 786-O-celler (

P

værdi på 24, 36, 48, 60 og 72 timer er 048, 1,54 x 10

-4, 2,01 × 10

-4, 2,15 × 10

-4 og 4,32 × 10

-6 henholdsvis 786-O celler) og Ad-NDRG2-inficerede A498 celler (

P

værdi 0,47, 0,43, 2,20 × 10

-4, 4,08 × 10

-4 og 1,70 × 10

-6 henholdsvis A498 celler), henholdsvis sammenligne med Ad-LacZ gruppe.

(A og B) Expression niveauer af NDRG2 protein i Ad-NDRG2-inficerede 786-O og Ad-NDRG2-inficerede A498 celler blev henholdsvis undersøgt ved Western blotting. (C og D) Væksten af ​​786-O og A498-celler blev inhiberet af overekspression af NDRG2 efter 72 timers inkubation. Statistisk signifikans blev vurderet ved hjælp af en-vejs ANOVA. *** Angiver

P

0,001, sammenlignet med Ad-LacZ gruppe.

NDRG2 overekspression hæmmer invasionen og migration af humane renale cancerceller

in vitro

For yderligere at vurdere effekten af ​​NDRG2 overekspression på metastatisk aktivitet, vi udførte

in vitro

Matrigel-coatede Transwell invasion analyser samt migration analyser med to forskellige human renal cancer cellelinjer, 786-O og A498. Repræsentative mikrografer blev udtaget fra den nedre overflade af Transwell filter, og celler, som invaderede eller migrerede blev farvet med Gimsa. Som vist i figur 3A og 3B, det invasive potentiale, som bestemmes af cellernes evne til at invadere en Matrigel barriere, blev signifikant undertrykt af Ad-NDRG2 infektion i 786-O-celler (

P

= 1,46 × 10

-5

vs

Ad- LacZ gruppe) og A498 celler (

P

= 2,23 × 10

-5

vs

Admin LacZ gruppe) . Men der var ingen signifikante forskelle mellem Ad- LacZ og kontrolgruppen i begge 786-O-celler (

P

= 0,79) og A498-celler (

P

= 0,58). Desuden overekspression af NDRG2 i disse cellelinjer betydeligt undertrykt deres vandring gennem transwell sammenlignet med Ad-LacZ infektion (

P

= 1,19 × 10

-5 til 786-O-celler og

P

= 1,09 × 10

-3 til A498 celler, henholdsvis) (Figur 3C og 3D). Men der var ingen signifikante forskelle mellem Ad- LacZ og kontrolgrupper i begge cellelinier (

P

= 0,73 for 786-O-celler og

P

= 0,94 for A498 celler)

(A og B) Den invasion evne blev anslået under anvendelse af Transwell coatet med Matrigel. Mængden af ​​besatte celler blev beregnet i fem tilfældige high-power felter (400 × forstørrelse). Histogrammet repræsenterer kvantificering af celler, der invaderede. (C og D) Migrationen evne blev anslået ved hjælp Transwell ubestrøget med Matrigel. Mængden af ​​migrerede celler blev beregnet i fem tilfældige high-power felter (400 × forstørrelse). Histogrammet repræsenterer kvantificeringen af ​​celler, som migrerede. Dataene er gennemsnittet ± standardafvigelse (SD) for tre uafhængige forsøg. Statistisk signifikans blev vurderet ved hjælp af en-vejs ANOVA. ** Eller *** angiver

P

0.01 eller

P

0,001 henholdsvis sammenlignet med Ad-LacZ gruppe.

Regulering af ekspressionen af ​​pVHL, HIF-1α og VEGF ved opregulering af NDRG2 i 786-O celler

for at forstå den molekylære mekanisme, gennem hvilken NDRG2 hæmmer 786-O celler spredning og invasion, vi analyserede effekten af ​​NDRG2 på ekspressionen af ​​pVHL, HIF-1α og sit mål VEGF, som spiller en vigtig rolle i celledeling og invasion i nyrekræft . Vi inficerede de 786-O-celler med Ad-NDGR2 og undersøgt pVHL, HIF-1α og VEGF-ekspression ved Western blot analyse. Som et resultat, der er beskrevet vi den forøgede pVHL ekspression og reduceret HIF-1α og VEGF sammenlignet med den for kontrolgruppen og Ad-LacZ gruppe 786-O-celler (figur 4A). I mellemtiden anvendte vi immunofluorescens assay til yderligere bekræfter reguleringen af ​​ekspressionen af ​​pVHL, HIF-1α og VEGF ved overekspression af NDRG2. Indirekte immunofluorescens mærkning viste svage signaler af NDRG2 og pVHL i kontrolgruppen og Ad-LacZ gruppe 786-O celler, mens der var stærkere farvning af NDRG2 og pVHL i Ad-NDRG2-inficerede 786-O celler. Desuden er de signaler af HIF-1α og VEGF i kontrol og Ad-LacZ gruppe var stærkere end i Ad-NDRG2 gruppe (figur 4B). Salg

(A) 786-O, Ad-LacZ-786-O og Ad-NDRG2-786-O-celler blev inkuberet under normoxi og hypoxi i 24 timer. Efter inkubation blev cellerne analyseret ved western blot-assay. p-actin proteinniveauer blev anvendt som en loading kontrol. (B) Efter infektion af 786-O-celler med 40 MOI Ad-NDRG2 under normoxi i 24 timer, proteinniveauer af NDRG2, pVHL, HIF-1α og VEGF i cellerne blev målt ved anvendelse af immunofluorescens-assay (400 ganges forstørrelse).

VEGF produktion hæmmes af NDRG2 overekspression

for at teste, om NDRG2 udtryk påvirker VEGF produktion i renale cancerceller, vi brugte Ad-NDRG2 at inficere 786-O og A498 celler og målte VEGF-niveauer i celledyrkningsmedium under normoxiske eller hypoxiske betingelser. Resultaterne af ELISA-assay viste, at Ad-NDRG2 gruppe på 786-O-celler, sammenlignet med Ad-LacZ udstillet faldt betydeligt VEGF-sekretion under enten normoxisk (figur 5A) (

P

= 7,32 × 10

-8) eller hypoxiske betingelser (figur 5B) (

P

= 9,95 × 10

-8). I mellemtiden, VEGF sekretion af A498 celler var også signifikant reduceret under NDRG2 overekspression tilstand uanset normoxi (figur 5C) (

P

= 6.12 × 10

-7) og hypoxi (figur 5D) (

P

= 0,005). Men Ad-LacZ-infektion har ingen effekt på VEGF produktion i forhold til kontrolgruppen, enten i normoxi (

P

= 0,55 for 786 O celler;

P

= 0,91 for A498 celler) eller i hypoxi (

P

= 0,94 for 786 O celler;

P

= 0,90 for A498 celler)

(A og B) 786-O, Ad-LacZ-786-O. og Ad-NDRG2-786-O-celler blev inkuberet under normoxi og hypoxi i 24 timer. Efter inkubation blev medier analyseret for VEGF-niveauer ved ELISA-assay. (C og D) A498 blev Ad-lacZ A498 og Ad-NDRG2- A498 celler inkuberet under normoxi og hypoxi i 24 timer. Efter inkubation blev medier analyseret for VEGF-niveauer ved ELISA-assay. Dataene var gennemsnittet ± standardafvigelse (SD) for tre uafhængige forsøg. Statistisk signifikans blev vurderet med én-vejs ANOVA. ** Eller *** angiver

P

0.01 eller

P

0,001 henholdsvis sammenlignet med Ad-LacZ gruppe.

Undertrykkelse af tumorvækst i en nøgen musemodel ved intratumoral injektion af Ad-NDRG2

For at undersøge effekten af ​​Ad -NDRG2 på tumorvækst

in vivo

, vi injicerede adenovirus (1 x 10

9 pfu i 100 ul PBS) Ad-NDRG2, Ad-LacZ eller PBS hver 3 dage i præ-etableret human 786- O renal cancertumorer (ca. 200 mm

3) dyrket i nøgne mus. Som vist i figur 6A, Ad-NDRG2 gruppe opnået en vedvarende og signifikant hæmning af tumorvækst sammenlignet med Ad-LacZ gruppe (

P

værdi 0,002, 1,54 × 10

-6, 1,77 × 10

-6, 9,7 × 10

-11, 8,69 × 10

-12 og 1,35 × 10

-9 på Day6, 9, 12, 15, 18 og dag 21 henholdsvis). Kaplan-Merier overlevelse analyse viste, at intratumoral injektion af Ad-NDRG2 signifikant forlænget mus overlevelsestid (

χ

2 = 11,75,

P

= 0,003) (figur 6B). blev ikke observeret nogen signifikante forskelle mellem kontrolgruppen og Ad-LacZ gruppe (

χ

2 = 4,67,

P

= 0,122), og resultaterne var i overensstemmelse med de af

in vitro

analyser. Efter musene blev aflivet, blev tumorerne fjernet til analyse af ekspressionen af ​​NDRG2, pVHL, HIF-1α og VEGF. Immunolabeling for VEGF og HIF-1a var lavere i tumorer udskåret fra mus i Ad-NDRG2 gruppe. Desuden blev de NDRG2 og pVHL ekspressionsniveauerne i Ad-NDRG2 gruppe dramatisk forøget, mens HIF-1a og VEGF niveauer faldt i forhold til Ad-LacZ gruppe (NDRG2,

P

= 6,47 × 10

-8 ; pVHL,

P

= 1,55 × 10

-8, HIF-1α,

P

= 0,0001, VEGF,

P

= 6,07 × 10

-7). Der var ingen signifikant forskel mellem kontrol- og Ad-LacZ grupper (NDRG2,

P

= 0,98, pVHL,

P

= 0,94; HIF-1α,

P

= 0,78, VEGF,

P

= 0,69) (Figur 7A og 7B).

(A) Tumor vækstkurve. Den tumorvækst blev vurderet hver 3. dag indtil dag 21 i behandlingen ved at måle to vinkelrette diametre og beregning af volumen i mm

3. Statistisk analyse blev vurderet med én-vejs ANOVA. ** Eller *** angiver P 0.01 eller P 0,001 sammenlignet med Ad-LacZ gruppe. (B) Kaplan-Meier-kurve blev vist i Control, Ad-LacZ og Ad-NDRG2 grupper, med hver gruppe bestående af ti mus. Der var en signifikant forskel mellem Ad-NDRG2 og Ad-LacZ behandlinger. Statistisk signifikans blev vurderet ved anvendelse log-rank test. ** Angiver

P

0.01 sammenlignet med Ad-LacZ gruppe.

(A) intratumorale udtryk for NDRG2, pVHL, HIF-1a og VEGF blev vurderet af Immunhistokemi (200 × forstørrelse) på paraffin-embedded 786-O celle tumor sektioner. Repræsentative billeder vises. (B) Integreret optisk densitet (IOD) værdier af NDRG2, pVHL, HIF-1α og VEGF proteinekspression af tumorerne blev evalueret. ImagePro Plus software blev anvendt til at analysere IOD værdier af de positive områder af immunhistokemisk farvning, og de resulterende histogrammer er vist. Statistisk analyse blev udført ved anvendelse af envejs ANOVA. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD. *** P 0,001.

Diskussion

Selvom kirurgisk resektion og adjuverende behandling er almindeligt anvendt til behandling af nyre kræftpatienter, den samlede overlevelse sats for nyrekræft kræver forbedring. Det er kendt, at RCC er resistent over for Radio-, hormono-, og kemoterapi [26]. Derfor er et presserende behov for udvikling af biologiske behandlinger for nyrekræft. Forekomst og udvikling af nyrekræft afhænger ekspressionen af ​​flere beslægtede gener, såsom HIF-1α, PDK1, VEGF og så videre [27].

Flere undersøgelser har nu vist, at HIF-1α opregulerer ekspressionen af ​​PDK1 og VEGF [28]. Desuden PDK1 og VEGF-ekspression er forøget i RCC [29,30]. PDK1 vides at phosphorylere og aktivere nogle proteinkinaser, som hører til AGC-familien af ​​proteinkinaser. En af proteinkinaser er proteinkinase B (PKB, også kendt som Akt). PDK1 aktiverer Akt ved phosphorylering en Ser /Thr rest i aktivering loop. Akt pathway er afvigende aktiveres i CCRCC og involveret i spredning og metastaser [31]. Og VEGF er grundpillen midt i alle angiogene faktorer og fremmer både tumorigenese og invasion af RCC [32]. HIF-1α er også ofte overudtrykkes i nyrekræft, der korrelerer med dårligt klinisk prognose [33]. Da forhøjet HIF-1α ekspression opregulerer ekspressionen af ​​PDK1 og VEGF, som fremmer tumorprogression.