PLoS ONE: Jern (III) -Salophene: en organometallisk forbindelse med Selective cytotoksisk og antiproliferativt Properties i platinresistent ovariecancerceller

Abstrakt

Baggrund

I denne pioner studie til den biologiske aktivitet af metalorganisk forbindelse Jern (III) -salophene (Fe-SP) de specifikke virkninger af Fe-SP på levedygtighed, morfologi , proliferation og celle-cyklus progression på platin-resistente æggestokkene cancer cellelinjer blev undersøgt.

Metodologi /vigtigste resultater

Fe-SP viste selektiv cytotoksicitet mod SKOV-3 og OVCAR-3 ( ovarieepitelceller adenocarcinom) cellelinier ved koncentrationer mellem 100 nm og 1 uM, mens levedygtigheden af ​​HeLa-celler (epithelial livmoderhalsen adenocarcinom) eller primære lunge eller hudfibroblaster ikke blev påvirket. SKOV-3 celler i modsætning til fibroblaster efter behandling med Fe-SP afslørede tilsyneladende kendetegnende for apoptose, herunder tæt farvede nukleare granulerede organer inden fragmenterede kerner, meget kondenseret kromatin og kromatin fragmentering. Fe-SP behandling førte til aktivering af markører for

extrinsic

(Caspase-8) og

iboende

(Caspase-9) pathway af apoptose samt bøddel Caspase-3, mens PARP -1 blev deaktiveret. Fe-SP udøvet virkninger som en antiproliferativ middel med en IC

50 værdi på 300 nM og forårsagede forsinket progression af celler gennem S-fasen fasen af ​​cellecyklussen resulterer i en komplet S-fasen. Når-peritonealt intra anvendt på rotter Fe-SP viste ikke nogen systemisk toksicitet ved koncentrationer, som i indledende forsøg blev bestemt til at være kemoterapeutiske relevante doser i en rotte i æggestokkene kræftcelle model.

Konklusion /Betydning

denne rapport viser, at Fe-SP er en potent vækst-undertrykke middel

in vitro

for cellelinjer afledt af kræft i æggestokkene og en potentiel terapeutisk lægemiddel til behandling af sådanne tumorer

in vivo

.

Henvisning: Lange TS, Kim KK, Singh RK, Strongin RM, McCourt CK, Brard L (2008) Jern (III) -Salophene: en organometallisk forbindelse med Selective cytotoksisk og antiproliferativt Properties i Platinum-Resistant æggestokkene cancerceller. PLoS ONE 3 (5): e2303. doi: 10,1371 /journal.pone.0002303

Redaktør: Anja-Katrin Bielinsky, University of Minnesota, USA

Modtaget: Februar 25, 2008; Accepteret 11. april 2008; Udgivet: 28. maj 2008

Copyright: © 2008 Lange et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en Brown University Seed Grant og en NICHD, K12 HD043447 BIRCWH Scholar Grant til Dr. Brard

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mineraler og metaller er blevet anvendt i forskellige former for medicinsk behandling i flere tusinde år. I det gamle Egypten og Grækenland i ayurvedisk medicin, asiatiske medicin, eller af aztekerne metaller i elementær form som salte eller som farmaceutisk aktive forbindelser fra planter blev brugt primært på grund af anti-inflammatoriske virkninger, der er forbundet med ansøgningen [1], [2 ]. Metaller fundet deres vækkelse i farmakologiske indsats under renæssancen [2], dog ofte med giftige bivirkninger på grund af heavy metal brug. Den tidligste beretning om den terapeutiske anvendelse af metaller eller metal forbindelser, ikke kun som før i ulcerøs forhold, men i kræft og leukæmi dato tilbage til det sekstende århundrede [3], [4]. Adskillige seneste anmeldelser har beskrevet de særlige kendetegn ved forskellige metalforbindelser og deres anvendelse og /eller formodede virkningsmekanisme i moderne kræftbehandling i præklinisk og kliniske undersøgelser [4], [5], [6].

den nuværende behandling af en række tumorer, herunder ovariecancer, afhængig af organometalliske platinforbindelser. I USA, epitelial ovariecancer (EOC) er den førende årsag til død fra gynækologiske maligniteter og den fjerde mest almindelige dødsårsag på grund af cancer blandt kvinder [7]. Det anslås toogtyve tusind nye tilfælde og en anslået femten tusinde dødsfald sekundært til kræft i æggestokkene fandt sted i 2007 [8]. Selv om de fleste patienter i begyndelsen reagere på cytoreduktive kirurgi og adjuverende paclitaxel og platinbaseret kemoterapi, vil de fleste opleve recidiv. Mens re-behandling med en platinbaseret lægemiddel er mulig svarprocenten på nuværende anden linje kemoterapi for nogle kvinder er 15-30% som følge af den stigende resistens over for sådanne lægemidler, der kræver udvikling af nye lægemidler til behandling af sådanne tumorer [6] [9].

design af nye metal-baserede lægemidler er ofte udfordret af fysisk-kemiske egenskaber såsom utilstrækkelig opløselighed eller hydrolytisk ustabilitet gør det problematisk at kontrollere deres levering, stabilitet og i sidste ende deres specifikke effekter

in vivo

. En metode til at kontrollere de cytotoksiske responser af nye metal-baserede forbindelser er at engagere biologisk essentielle overgangsmetaller, såsom jern (Fe), mangan (Mn), zink (Zn), kobber (Cu), eller cobalt (Co) af forskellig oxidative stater og deres reaktive mellemprodukter [4], [5]. Den aktuelle rapport beskriver selektive cytotoksiske virkninger af en roman organometallisk kompleks (Jern (III) -salophene;. Figur 1A). På platin-resistente ovariecancerceller

(A) Syntese af salophene ligand (SP; fra 1,2-phenylendiamin og o-vanillin) og jern (III) -salophene kompleks (Fe-SP) (se materialer og metoder). (B) Strukturel karakterisering af Fe-SP ved røntgenkrystallografi (se tabel 1)

Salophenes repræsenterer en klasse af organiske forbindelser defineret af to Schiffs baser forbinder tre aromatiske dele. De to yderste aromatiske dele typisk træk salisaldehydes og den centrale aromatiske del en

o

phenylen-diamin eller analog. Salophenes vise potent binding med overgangseffekter metalelementer og er tæt knyttet til Salens indeholder Schiffs baser, der udgøres af alifatiske diaminer. Metallosalens falder i en række ikke-platin metalforbindelser såsom thiosemicarbazon eller hydrazon farmakoforer med formodede anticancer aktiviteter [4], [10]. Metallosalophenes er ikke blevet undersøgt grundigt med hensyn til anvendelser i biologiske systemer: tidligere salophene-lanthanidkomplekser blev beskrevet til selektivt at binde til neutrale sukkere og lipider, herunder lysophosphatidsyre, der tjener som en markør for flere patologiske tilstande, herunder ovariecancer [11] og Mn -salophene (EUK178) samt forskellige Mn-Salens display cyto-beskyttende funktioner i fibroblastkulturer via hydrogenperoxid latrintømning [12]. En beslægtet forbindelse (cobalt-3,4-diarylsalen) er blevet vist at reducere levedygtigheden af ​​forskellige cancercellelinier ved ret høje koncentrationer (≥20 um) og det blev foreslået, at den tilstand af aktivitet ikke var knyttet til oxidativ DNA-beskadigelse [ ,,,0],13]. Baseret på denne rapport og yderligere undersøgelser af de selektive cytotoksiske virkninger af salophenes når kompleksdannet med overgangsmetaller, blev et patent indgivet. Denne opfindelse omfatter af syntesen, biologiske vurderinger, ansøgninger, og farmaceutiske præparater for metal-salophenes (MSPS). Opfindelsen består af anvendelse af MSP’er som lægemidler med terapeutisk antineoplastisk, antiangiogene og anti-cancer aktiviteterne, og med andre egenskaber, såsom at binde frie radikaler. Herudover tilvejebringer opfindelsen metoder, der skal anvendes i kemoforebyggelse af kemisk carcinogenese og ændringer af lægemiddelmetabolisme involverer epoxider eller frie iltradikaler eller mellemprodukter.

Formålet med dette studie var at undersøge potentialet i Fe- SP som et biologisk aktivt lægemiddel i en æggestokkene kræftcelle model med hensyn til dosis-afhængige og specifikke virkninger på levedygtighed, morfologi, proliferation og celle-cyklus progression. Ud over at beskrive den selektive cytotoksicitet af Fe-SP på platin-resistente ovariecancer celler udført vi en undersøgelse af den systemiske toksicitet af Fe-SP, når de anvendes i rotter som modelsystem. Denne rapport viser, at denne roman metalorganisk forbindelse udviser egenskaber som en potentiel terapeutisk lægemiddel og et alternativ til platin reagenser i behandlingen af ​​kræft i æggestokkene.

Resultater

Specifik cytotoksiske effekt af Fe-SP på human platin-resistente ovariecancer cellelinjer

I en indledende tilgang til at analysere virkningerne af jern (III) -salophene (Fe-SP) på æggestokkene kræftceller vi udførte en levedygtighed assay ansætte SKOV-3 og OVCAR- 3 (menneskelige platin-resistente ovarieepitelceller adenocarcinom) cellelinier i sammenligning med HeLa (epithelial cervix adenocarcinom) eller primær lunge (LF) eller hudfibroblaster (BJ) (passager 10-13). Cellerne blev behandlet i 24 timer med forskellige koncentrationer (0,1-3 uM) af enten Fe-SP eller ikke-kompleksbundet salophene (SP) som en yderligere kontrol til ubehandlede celler. Behandling med SP ikke påvirker levedygtigheden af ​​enhver af disse cellelinier i området fra 100 nM til 3 uM (fig 2) eller ved koncentrationer så høje som 60 pM (upublicerede data). Fe-SP, ved koncentrationer ≥3 uM, der udøves stærkt cytotoksiske virkninger på alle cellelinier. Bemærkelsesværdigt, svaret af disse celler til Fe-SP var ikke kun dosisafhængig, men ved koncentrationer under 3 uM celletypespecifik (fig. 2). Mens Fe-SP ved koncentrationer mellem 300 nm og 1 uM viste sig at være meget cytotoksisk til SKOV-3 og OVCAR-3 celler, behandling af HeLa-celler eller primære fibroblaster med 1 pM Fe-SP resulterede ikke i nogen ændring af virksomhedens rentabilitet. Således Fe-SP afhængigt af cellelinjen behandles, viser selektiv cytotoksicitet, med en dosisafhængig respons vist her to platin-resistente æggestokkene cancercellelinjer.

Cytotoksiciteten af ​​Fe-SP på human ovariecancer celler (SKOV-3, OVCAR-3) blev sammenlignet med virkningen på HeLa-celler eller primære fibroblaster på passagerne 11 til 13 (LF1, human lunge, BJ, human forhud). Cellerne blev behandlet i alt 24 timer med forskellige koncentrationer (0,1-3 uM) af Fe-SP eller ikke-kompleksbundet SP (CTR). MTS levedygtighed assay blev udført som beskrevet (materialer og metoder). Eksperimenter blev udført i triplikater; Data er udtrykt som gennemsnittet af de tredobbelte bestemmelser (X ± SD) af et repræsentativt eksperiment i% cellelevedygtighed af ubehandlede celler [= 100%].

Selektive morfologiske ændringer og induktion af apoptose i SKOV -3 ovariecancerceller efter Fe-SP behandling

at analysere morfologiske ændringer af SKOV-3 ovariecancerceller og primære fibroblaster (BJ) ved Fe-SP behandling vi udført lys- og fluorescensmikroskopi efter fiksering af celler og farvning af den nukleare kromatin med DAPI. Populationen af ​​ubehandlet SKOV-3 eller celler behandlet med 2 pM af ikke-kompleksbundet SP i 24 timer viste en homogen morfologi med kerner let og ensartet farvet med DAPI (fig. 3A) og lejlighedsvis forekomster af delende celler i mitose (lys blå-farvning af kromosomer linet op langs metafaseplade; ikke vist her). I modsætning hertil efter behandling med 2 uM Fe-SP størstedelen af ​​SKOV-3-celler viste svind, stærkt kondenseret kromatin, og ofte tæt farvede nukleare granulære organer ( “apoptotiske legemer”) inden fragmenterede kerner, (fig. 3A). Primære fibroblaster behandlet med Fe-SP eller SP i samme koncentration afslørede ikke større ændringer i morfologi eller tilsyneladende kendetegnende for apoptose der viser den selektive reaktion af ovariecancer cellelinien undersøgt til Fe-SP. Salg

Æggestokkræftceller (SKOV-3) eller primære fibroblaster (BJ) blev behandlet i 24 timer med Fe-SP eller ikke-kompleksbundet SP (Ctr.) ved en koncentration på 2 uM før mikroskopisk analyse ved fasekontrast (PC) eller fluorescens analyse efter kromatin-farvning (DAPI), som beskrevet (materialer og metoder). Billeder opnået fra et repræsentativt forsøg er vist. Bar = 10 um. (B) Analyse af DNA fragmentation i en TUNEL analysen. SKOV-3-celler blev behandlet med Fe-SP (0, 0,7, 2 uM) i 24 timer. En TUNEL-assay blev udført ved co-farvning med fluorescein-12-dUTP (mærkning af DNA nicks i apoptotiske celler) og af kromatin med propidiumiodid (materialer og metoder). Co-farvning af ubehandlede SKOV-3-celler før fiksering og permeabilisering tjente som negativ kontrol (indsæt øverste panel). Under fluorescerende mikroskopi, repræsentative billeder blev taget, apoptotisk plet (grøn) og nuklear farvning (rød) overlejret. TUNEL-positive kerner som følge af DNA-fragmentering vises som gule områder. Bar = 10 uM. (C) Western blot analyse af caspaseaktivering. SKOV-3-celler blev behandlet med Fe-SP (0, 1,25 pM, 2,5 pM) i 24 timer. PAGE og Western blot-analyse af cellelysater blev udført. Aktiveret Caspase-3, -8, -9, og inaktiveret PARP-1 blev visualiseret ved immunoblotting under anvendelse af primære antistoffer udelukkende anerkende spaltede fragmenter, ikke fuld længde pro-former, af disse proteiner i kombination med et kemiluminescens påvisningssystem som beskrevet i (Materialer og fremgangsmåder). Et repræsentativt eksperiment er vist. Som en intern standard for lige belastning (50 ug totalt celleprotein /bane) blots blev probet med et anti-β-actin-antistof.

En almindelig fremgangsmåde til påvisning DNA fragmentation i lyset af cellulær apoptotisk begivenheder er en TUNEL-assay, som vi anvendte efter behandling af SKOV-3 med Fe-SP. Assayet bygger på tilstedeværelsen af ​​nicks i DNA’et af apoptotiske og nogle nekrotiske celler, der kan identificeres ved terminal transferase, der vil katalysere tilføjelsen af ​​mærket dUTP (her: fluorescein). SKOV-3-celler blev behandlet med enten 0,7 eller 2 uM Fe-SP i 24 timer. At identificere cellekerner, modfarvning med propidiumiodid (PI), der interkalerer i DNA’et, blev udført. TUNEL-positive cellekerner blev identificeret ved gule pletter skyldes en overlejring af billedet med apoptotisk plet (FL-dUTP) og nuklear farvning (Pi). Som vist (fig. 3B) ingen celler før behandling (øverste panel), 60% af populationen af ​​celler behandlet med 0,7 pM (midterste panel) og alle celler ved 2 uM Fe-SP (nederste panel) blev TUNEL-positive celler indikerer fragmenteret DNA.

for at definere den cellulære respons af SKOV-3-celler upon Fe-SP behandling vi analyseret aktiveringen af ​​caspaser karakteristiske for induktion af apoptose samt inaktivering af PARP-1 ved immunblotting. Behandling af SKOV-3-celler med 2,5 uM Fe-SP i 24 timer resulterede i stærk aktivering /kløvning af caspase-9, -8, og -3, mens PARP-1 blev inaktiveret /spaltes efter lægemiddelbehandling (fig. 3C). Behandling med 1,25 uM Fe-SP afslørede et lignende resultat, med nogle aktivering af caspase-9, og -3, og inaktivering af PARP-1, mens aktiveringen af ​​caspase-8 var så stærk som observeret for 2,5 uM Fe-SP. Tilsyneladende indtræden af ​​caspaseaktivering og PARP-1-inaktivering i SKOV-3 ovariecancerceller af Fe-SP resulterede i de morfologiske kendetegn for apoptose observeret (fig. 3A).

antiproliferativ virkning og cellecyklus anholdelse efter behandling af SKOV-3 ovariecancerceller med Fe-SP

som beskrevet i de foregående afsnit Fe-SP er en selektiv cytotoksisk lægemiddel (fig. 2), som aktiverer apoptotiske processer (fig. 3) i SKOV -3 ovariecancerceller. At undersøge om Fe-SP udøver anti-proliferative virkninger og forstyrrelser af cellecyklusprogression udførte vi en BrdU inkorporering assay. Fe-SP behandling i 24 timer dosisafhængigt reduceret celleproliferation (fig. 4) med en IC

50 værdi på 300 nM. I modsætning hertil ikke-kompleksbundet SP ikke reducere SKOV-3 proliferation væsentligt, selv ved koncentrationer på 3 pM. Ved sub-cytotoksiske medikamentkoncentration på 100 nM Fe-SP (se levedygtighed, figur 2) blev BrdU-inkorporering i DNA reduceret med 40% (fig. 4).

Æggestokkræftceller (SKOV-3) blev behandlet med forskellige koncentrationer (0,1-10 uM) af Fe-SP eller ikke-kompleksbundet SP (Ctr.) i 24 timer. En kolorimetrisk analyse (baseret på BrdU-inkorporering detekteres af en BrdU-antistof-peroxidasekonjugat) blev udført som beskrevet (materialer og metoder). Farveintensiteten ved 450 nM korrelerer direkte med mængden af ​​BrdU inkorporeret i DNA’et, som igen repræsenterer proliferation. Eksperimenter blev udført i triplikater; Data er udtrykt som gennemsnittet af de tredobbelte bestemmelser (X ± SD) i% af absorbans ved tredobbelte prøver af ubehandlede celler [= 100%].

Ud over celleproliferationsassay, celle- cyklus analyse af propidiumiodid farves SKOV-3-celler ved flowcytometri blev udført. Fe-SP, i modsætning til den ikke-kompleksbundne forbindelse, afslørede en stigning i optællingen af ​​sub-diploidal /2n celler (sub-G0 /G1, fig. 5A) på en tids- og dosisafhængig måde (tabel 1) . Med hensyn til cykling celler, Fe-SP forårsager en tids- og dosisafhængig standsning af SKOV-3 i S-fase og således et fald af celler i G0 /G1-fasen: Ubehandlede celler eller SKOV-3 behandles med ikke -complexed SP i denne ikke-synkron befolkning, mens kulturperler

in vitro

er ~71-75% i G0 /G1 og ~21-24% i S-fasen (fig. 5B, tabel 1). Behandling med Fe-SP ved stigende koncentrationer (0,4, 0,8, 1,6 uM) i 24 eller 48 timer forårsagede en stigning af celler i S-fasen toppede på 75% (1,6 uM /24 timer) og 87% (1,6 uM /48 h ) af den samlede befolkning (fig. 5B, tabel 1). Derfor er antallet af celler i G0 /G1 falder til 25% (1,6 uM /24 timer) og 13% (1,6 uM /48 h) af den samlede befolkning, mens på dette Fe-SP koncentration ikke flere celler i G2 /M kan detekteres. Ved en koncentration på 0,8 uM Fe-SP i 24 timer og 48 timer en stigning på celler i G2 /M (23% /24 timer; 16% /48 h) over basisniveauet (3% /24 timer, 9% /48 h) kan observeres som indikerer en forsinkelse af fasens sammen med en udvikling standsning af celler i S-fase.

Æggestokkræftceller (SKOV-3) blev behandlet med 0, 0,4, 0,8 og 1,6 uM Fe-SP eller SP (Ctr.) i 24 eller 48 timer. Cellecyklusanalyse ved FACS på basis af propidium-iodid interkalation i det cellulære kromatin blev udført som beskrevet (materialer og metoder). Data er præsenteret som (A) i forhold fluorescensintensitet i en 2-dimensional FACS profil (ModFit LT software, sorte streger = datalinie og model fit linje af hele befolkningen, skraverede områder = modelkomponenter /subpopulationer af G0 /G1, S, G2 /M, apoptotiske celler), viste eksempel i 48 h behandling med 0,8 pM forbindelse eller som (B) omfattende bar diagram af alle oplysninger. Standardiseret gating blev anvendt for alle prøver. Ti tusind hændelser blev analyseret for hver prøve.

Cytotoksicitet af Fe-SP i rotter som et modelsystem

For at undersøge om Fe-SP forårsager systemisk toksicitet

in vivo

vi valgte rotter som modelsystem. I indledende de kemoterapeutiske relevante doser af Fe-SP i et dyr ovariecancer celle model blev bestemt til at være ≤1 mg /kg legemsvægt (Lange et al. Under forberedelse). I disse forsøg undersøgelser rotte ovariecancerceller (Nuţu-19) var-peritonealt intra (IP) injiceret i rotter og 3 uger efter udvikling af tumorer (at efterligne situationen efter cytoreduktive kirurgi) dyr blev behandlet dagligt med Fe-SP via IP injektioner . Behandlingens varighed varede 12 dage og var baseret på tumorbelastning i kontroldyrene. Dyr blev overvåget for ubehag og smerter pr IACUC protokoller. Mens kontroldyr udviste en konsekvent forhøjet mængde blødende ascites, FE-SP (1 mg /ml) behandlede dyr viste signifikant mindre blødende ascites volumen, og mindre oment tumorvægt. Desuden er der i denne indledende behandling forsøg, vi observerede en komplet respons i 40% af behandlede dyr (10 rotter behandlet).

Derfor gennemførte vi 28-dages kronisk toksicitetsundersøgelser (OECD retningslinjer for testning af kemikalier (afsnit-4, nr-407)) i albinorotter med Fe-SP koncentrationer i området fra 0,25 mg /kg til 4 mg /kg legemsvægt. Denne undersøgelse blev designet til at undersøge de toksikologiske virkninger af gentagne IP administration af Fe-SP (i DMSO: destilleret vand i forholdet 1:04 om fem dage /uge i en periode på 28 dage). Dyr i en lav dosis gruppe (0,25 mg /kg legemsvægt), mellemliggende dosisgruppe (1,0 mg /kg legemsvægt), og gruppe høj dosis (4,0 mg /kg legemsvægt) har ikke afsløret patologiske ændringer i forhold til kontrollen gruppe af dyr. Ingen dødelighed eller toksiske symptomer blev observeret i test- og kontrolgrupper af dyr, undtagen pjusket pels i højdosisgruppen. Der blev ikke observeret nogen signifikante forskelle i kropsvægt gevinst /tab mønster, orgel vægt, hæmatologiske eller biokemiske parametre (se Materialer og Metoder) af alle de testgrupper i sammenligning med kontrolgruppen. Alle parametre faldt inden for de accepterede grænser for normale variationer for albino rotter. Mikroskopisk undersøgelse af histopatologiske slides fra de lave, intermediære og høje grupper doser ikke udviste væsentlige ændringer bortset mild degeneration af hepatocytter i tre dyr (ved den høje dosis) og pulmonal mononukleære celle infiltrater i to dyr (høj dosis).

diskussion

En lav 5-års samlet overlevelse på kun 53% for kvinde, der lider af kræft i æggestokkene er relateret til udviklingen af ​​resistens af tumorceller til standard kemoterapeutiske stoffer, især platin-analoger og derfor nye anti-cancer medicin skal udvikles [6], [7], [8]. For nærværende rapport valgte vi at undersøge mulighederne for en ny metalorganisk kompleks, Jern (III) -salophene (Fe-SP) som kandidat middel til behandling af kræft i æggestokkene. Med henblik på afklaring, nævnes det, at udtrykket salophene, mere end et århundrede siden, er blevet anvendt på 4-acetamidophenyl salicylat, en smertestillende, og antipyretisk lægemiddel fremstillet siden begyndelsen af ​​1900 af Bayer Pharmaceutical Products (Leverkusen, Tyskland) [14 ], og er ikke relateret til “Salophen” opdaget som et superoxid skyllevæske i E. coli, når kompleks med mangan (III) [15], der ligner den organometalliske forbindelse undersøgt i denne rapport.

til dato ingen forskning på de specifikke virkninger af salophenes på levedygtigheden af ​​kræftceller er blevet offentliggjort. I en tidligere undersøgelse af de cytotoksiske virkninger af bicykliske aryl- thiazoliner på forskellige humane cancercellelinier, bestemmes vi rækkevidde af den kolorimetriske celle-levedygtighed assay anvendes ved anvendelse Jern (III) -salophene (ikke relateret til thiazoliner) ved 60 uM som en negativ kontrol [16]. Efterfølgende sammenlignende undersøgelser af effekten af ​​overgang-metal salophenes (Zn (II) -, Mn (II) -, Cu (II) -, Co (III), Fe (III) -SP) og ikke-kompleks salophene (SP) ved lavere koncentrationer afslørede, at under en koncentration på 10 uM kun Fe (III) -SP viste signifikante cytotoksiske virkninger i forskellige cancercellelinier (Lange et al., under udarbejdelse). For at teste den selektive cytotoksiske potentiale af Fe-SP på ovariecancerceller, valgte vi to cellelinier, der er multiresistent sammen med primær lunge eller hudfibroblaster cellelinier. OVCAR-3 celler (ovarie epitelial adenocarcinom) er resistente over for klinisk relevante koncentrationer af adriamycin, melphalan og cisplatin. SKOV-3-celler (ovarie adenocarcinom) er resistente over for flere cytotoksiske lægemidler, herunder cisplatin og adriamycin (se ATCC, Manassas, VA; www.atcc.org). Svarende til disse to ovarian cancer cellelinjer, kontrol- celler, der anvendes i den foreliggende rapport, primær fibroblast- på tidlige passager og HeLa-celler, besidder et højt stofskifte og væksthastighed. Vi viser her, at Fe-SP viste selektiv og dosisafhængig cytotoksicitet mod SKOV-3 og OVCAR-3 celler ved koncentrationer mellem 100 nm og 1 uM, mens levedygtigheden af ​​HeLa-celler (epithelial cervix adenocarcinom) eller primær lunge- eller hud- fibroblaster (ved passager 10-13) ved disse koncentrationer blev ikke påvirket. Den relative modstand tre kontrol cellelinjer til Fe-SP støttede tanken om at teste denne sammensatte en

in vivo

dyr ovariecancer model. Ikke-kompleksbundet salophene påvirkede ikke levedygtighed enten cellelinje selv ved koncentrationer op til 60 uM heller ikke 60 uM Fe (III) alene [ferrichlorid tilsat] eller ferrichlorid i kombination med ikke-kompleksdannet salophene tilsat til cellekulturen medier [Lange et al., som forberedelse] indirekte bekræftelse af stabiliteten af ​​komplekset og dermed specifik cytotoksisk indsats i henhold til celle dyrkningsbetingelser.

i betragtning af den nuværende tilstand af forskning inden for organometalliske forbindelser såsom salophenes eller Salens (relateret sammensatte, se indledning), kan vi kun spekulere fra begrænsede kilder om den mulige mekanisme (r) af cytotoksisk virkning af Fe-SP. Et bemærkelsesværdigt træk ved Salens, endnu ikke undersøgt for salophenes, er deres affinitet til en række af aromatiske neutrale molekyler, såsom pyridin, pyridin-N-oxid, isoquinolin og benzylamin [17], [18]. Salens når kompleks med overgangsmetaller fungere som kunstige nukleaser. Deres reaktivitet i plasmid DNA-spaltning assays kan styres ved konjugation eller ved typen og ladningen af ​​den centrale metalion kerne [18], [19], [20]. For eksempel, Ni (II) – eller Mn (II) -salens fandtes at effektivt inducerer DNA strengspaltning men ikke Cr (II) – eller Cu (II) – [18], [20] eller Fe (II) -salens medmindre yderligere hydroxylgrupper lette deres oxidation til Cu (III) eller Fe (III) arter [21]. Det er blevet postuleret, at Fe-salen i samarbejde med kinin systemet letter dannelsen af ​​jern (III)

.O

2

– arter til at producere frie hydroxy radikaler er ansvarlige for DNA spaltning [21]. Men den DNA-spaltning aktivitet af Fe (III) -salen er højere end af Fe (II) -salen antyder, at den forøgede vandopløselighed og ladningen af ​​Fe (III) ion dominerer spaltning potentiale af strukturen [22] som sandsynligvis gælder for jern (III) -salophene, samt. Desuden forfatterne knyttet DNA spaltning aktivitet ved Fe (III) -salen

in vitro

til observationen, at denne forbindelse forårsagede nuklear fragmentering og induktion af apoptose (via mitokondrie pathway /cytochrom c-frigivelse) i HEK293-celler ved en koncentration på 50 uM [22].

Mens mekanismen (r) virkningsmekanisme Salens eller Fe-SP på celler i kultur eller

in vivo

stadig at blive undersøgt, selektiv morfologiske ændringer af cancer cellelinjer og induktion af apoptose efter lægemiddelbehandling

in vitro

er en første indikator for potentielle selektive virkninger på tumor metastase og celle fysiologi

in vivo

. Nærværende undersøgelse viser, at Fe-SP ved koncentrationer på 2 uM i SKOV-3 ovariecancerceller men ikke i primære fibroblaster forårsaget nuklear fragmentering, kromatin kondensering, DNA-fragmentering, der alle er klassiske kendetegnende for apoptose [23]. Western blotting bekræftede aktiveringen af ​​effektor caspase-3 og inaktivering af PARP-1 (involveret i DNA-reparation) [24] under udførelsen af ​​apoptose i SKOV-3 celler efter Fe-SP behandling. Desuden var det tydeligt, at Fe-SP inducerede både store signalveje (

indre, ekstern

) beskrevet for programmeret celledød [25], [26]. Vi observerede en stærk spaltning /aktivering af initiator caspase-8, typisk for inddragelse af

extrinsic

apoptosecyklus [27], [28], når Fe-SP behandling af SKOV-3 celler.

iboende

vej medierer apoptotiske reaktioner på stress signaler såsom narkotika, DNA skader eller vækstfaktor afsavn og er initieret af skade på mitokondrier. Det resulterer i den mitokondrielle frigivelse af cytochrom C, som aktiverer initiator caspase-9 [28], [29] og blev vist at bidrage til celledød af HEK293 (human nyrecellelinie) ved Fe (III) -salen behandling [22] og også i den foreliggende undersøgelse for SKOV-3 celler efter Fe (III) -salophene behandling. Til dato er der ikke andre studier, der beskriver morfologi eller apoptotiske signalering af eventuelle cellelinier efter behandling med forbindelser, der tilhører klassen af ​​jern-Salens eller -salophenes blevet offentliggjort.

Ligeledes ingen publikationer undersøge ændringen i cellen cyklus progression efter behandling med enten et salen eller salophene metallocomplex eksisterer. Mens én publikation observeret en ændring i levedygtighed og morfologi af hudfibroblaster i kultur efter behandling med en Cr (III) -salen kompleks ved høje koncentrationer af 50 uM blev følgende cellecyklus undersøgelser kun udført med en ethylendiamin-Cr (III) – chlorid af højere cytotoksicitet [30]. Vi viser her, at Fe-SP dosisafhængigt reduceret proliferation af SKOV-3 ovariecancerceller (IC

50 ved 300 nM). Selv på de sub-cytotoksiske koncentrationer (100 nM Fe-SP) BrdU-inkorporering i DNA blev reduceret indikerer, at Fe-SP udøver virkninger som en antiproliferativ og dermed en potentiel anticancermiddel. Yderligere celle-cyklus analyse af SKOV-3 efter Fe-SP behandling, som allerede nævnt i TUNEL-analysen afslørede en stigning i sub-diploidal population som repræsenterer celler med betydelig DNA-skader, hvilket indikerer et sent apoptotisk stadie. Med hensyn til cykling celler, Fe-SP ved 1,6 uM forårsagede en fuldstændig standsning af SKOV-3 i S-fase sammen med nedgang af celler i G0 /G1 og et samlet tab af celler i G2 /M. Tilsyneladende, Fe-SP behandling påvirkede celle-cyklus checkpoints i S-fasen, så en dosis og tidsafhængig reduktion af cellecyklus-progression. Til dato, dette er den første rapport om regulering af den cyklus af enhver cellelinie ved behandling med enten metallosalen eller metallosalophene forbindelser. Desuden findes der kun få data om effekten af ​​overgangsmetalkomplekser generelt på cellecyklus, såsom anholdelsen af ​​en neuroblastomcellelinje i G1-fasen, når de behandles med en isatin-Schiff-base-kobber (II) kompleks [31].

selvom ikke formålet med denne rapport, kan yderligere undersøgelser analysere virkningerne af Fe-SP på celle-cyklus checkpoints i synkroniserede SKOV-3 kulturer og andre kræft og ikke-transformerede cellelinjer. Målretning sådanne checkpoints er blevet foreslået som en alternativ tilgang til anti-cancer behandlinger [32], [33]. Regulatorer af celle-cyklus maskiner hyppigt ændringer i human cancer og tilsyneladende transformerede celler kan være mere følsomme over for cyclin-afhængige kinaser (CDK) inhibering [34], [35]. Med hensyn til S-fase begivenheder både musemodeller og undersøgelser om kræft-afledte celler afslørede, at ophobning af cyclin D1 /CDK4 komplekser udløser DNA re-replikation [36] og dermed kunne målrettet i kræftceller. Som ét eksempel Guggulsteron, en planteafledt lægemiddel, forårsagede celle-cellecyklusstandsnings i S-fase ved undertrykkelse af cyclin D1 og cdc2 og øget cyclin-afhængig kinase inhibitor p21 og p27 ekspression i en lang række humane tumor celletyper [ ,,,0],37]. Baseret på den specifikke anholdelse af SKOV-3 celler ved Fe-SP i S-fase observeret i den foreliggende undersøgelse, i fremtidige studier vil vi analysere virkningerne af denne roman organometallisk forbindelse og potentiel kræft terapeutiske på specifik celle-cyklus regulatorer (CDK s, cycliner) og replikation-start og -progression signalerne fra S-fase [38], [39] i platin-resistente æggestokkene cancerceller.

for at sætte scenen for yderligere undersøgelse af Fe-SP som en potentiel