PLoS ONE: Øget ekspression af TGFβR2 er forbundet med det kliniske resultat af ikke-småcellet lungekræft Patienter behandlet med kemoterapi

Abstrakt

For at undersøge den prognostiske betydning af

TGFβR2

udtryk og kemoterapi i kinesisk ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patienter,

TGFβR2

udtryk NSCLC blev analyseret

i silico

bruge Oncomine database, og efterfølgende analyseret med kvantitativ RT-PCR i 308 NSCLC biopsier, 42 som blev parret med tilstødende ikke-neoplastiske væv. Vores resultater viser, at

TGFβR2

udtryk blev også øget i NSCLC biopsier forhold til normale vævsprøver og korreleret med dårlig prognose.

TGFβR2

udtryk var også signifikant korreleret med andre kliniske parametre såsom tumor differentiering, invasion af lunge-membran, og kemoterapi. Desuden blev samlet overlevelse (OS) og sygdomsfri overlevelse (DFS) øget hos patienter med lav

TGFβR2

udtrykke NSCLC og som havde gennemgået kemoterapi. Således høj ekspression af

TGFβR2

er en væsentlig risikofaktor for nedsat OS og DFS i NSCLC patienter. Således

TGFβR2

er en potentiel prognostisk tumor biomarkør for kemoterapi

Henvisning:. Han Y, Jia C, Cong X, Yu F, Cai H, Fang S, et al. (2015) Øget ekspression af

TGFβR2

er forbundet med det kliniske resultat af ikke-småcellet lungekræft patienter behandlet med kemoterapi. PLoS ONE 10 (8): e0134682. doi: 10,1371 /journal.pone.0134682

Redaktør: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: 13. maj 2015; Accepteret: Juni 24, 2015; Udgivet: 7 August, 2015

Copyright: © 2015 Han et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81371595, 81372175, 81301993, 81472501, 81201535, 81472202 og 81302065), Nature Science Foundation of Shanghai ( 12ZR1436000), Shanghai Municipal Videnskab og Teknologi Kommissionen (14441901300, 14DZ1940606), Shanghai Municipal Kommissionen for sundhed og familieplanlægning (XBR2013112, 2013SY036) og Ungdom Innovation Association Promotion, Chinese Academy of Sciences (Y219J11311).

Konkurrerende interesser : forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lunge karcinom er den førende årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, der tegner sig for 1,37 millioner dødsfald om året [1-3].. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er den mest almindelige form for primær lungecancer, der tegner sig for næsten 80% af lunge carcinom [4]. Skønt betydelige fremskridt har fundet sted i vores forståelse af sygdomsprocessen i de seneste årtier [5,6], den vigtigste behandling strategi er stadig kirurgisk resektion, kemoterapi og strålebehandling [7-9]. Men selv i tilfælde af fuldstændig resektion, helbredende virkning er ikke tilfredsstillende og NSCLC patienter stadig står risikoen for recidiv og metastaser [10,11].

håb for fuldstændig molekylær analyse af humane kræftformer er i sidste ende at forbedre forvaltningen af ​​patienterne. Fremskridt i genomik og proteomics har genereret mange kandidatlande markører med potentiel klinisk værdi [12]. Derfor, uanset om der findes biomarkører, der skulle fungere som prædiktive faktorer for lungekræft eller benyttes i beslutningsprocessen for den kliniske behandling af patienter er i øjeblikket under efterforskning muligheder for behandling forhånd. Endvidere forståelse af det molekylære karakteristika af lungekræft vil hjælpe til målrettet terapi udvikling.

Komponenter af den transformerende vækstfaktor-beta (TGF-β) -familien ofte ændres i udviklingen af ​​forskellige humane cancerformer. TGF-β er et pleiotropisk cytokin, der virker som en tumorsuppressor eller tumor promotor afhængigt af den cellulære mikromiljø [13]. TGF-beta receptor type 2 (TGFβR2) er den ligandbindende receptor for alle medlemmer af TGF-β familien [14-16]. TGFp signaler medieres af en aktiveret kompleks af TGFβR1 og TGFβR2 [17]. TGF-β ligand bindes primært til TGFβR2 på plasmamembranen, hvilket resulterer i dannelsen af ​​et kompleks mellem TGFβR1 og TGFβR2. TGFβR2 phosphorylerer TGFβR1, og aktiveret TGFβR1 phosphorylerer mål nedstrøms, Smad2 og Smad3. Phosphoryleret Smad2 og Smad3 danne et kompleks med Smad4, der translokerer til kernen og regulerer målgenekspression [18,19]. Derfor abnormaliteter i ethvert medlem af TGF-β eller Smad familien ofte dybt forstyrre TGF-beta signalvej [20,21].

Om et gen signatur kan forudsige klinisk resultat af NSCLC, herunder prognose og svar til kemoterapi, forbliver uklar. Her blev Oncomine database, der bruges til at afsløre forskellen udtryk specifikt for TGFβR2 i NSCLC. Udtrykket af TGFβR2 blev efterfølgende valideret af real-time PCR i NSCLC biopsier fra en kohorte af kinesiske patienter og prognostisk betydning blev vurderet.

Materialer og metoder

Etik erklæring

undersøgelsen blev revideret og godkendt af Etisk Komité Jilin Universitet (Jilin, Kina). Hver deltager, forudsat at deres skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse, og de etiske komitéer godkender godkendelsesproceduren.

Opsætning af server til online overlevelse beregning

TGFβR2

mRNA ekspression blev undersøgt i NSCLC vævsprøver (n = 187) i TCGA databasen gennem Oncomine Platform (https://www.oncomine.org). Data blev hentet ved hjælp af søgeord “

TGFβR2

” og “NSCLC” og “mRNA”.

Den prognostiske værdi af

TGFβR2

gen blev vurderet med Kaplan Meier kortplotter, en metaanalyse værktøj baseret i silico biomarkør vurdering, der vurderer effekten af ​​gener på overlevelse hos kræftpatienter (https://www.kmplot.com/lung) [22,23]. Hver median blev beregnet, og de bedste resultater tærsklen blev anvendt som den endelige cutoff i en univariate og Cox regressionsanalyse. Histologi, grad, stadium, køn og rygevaner blev anvendt i den multivariate analyse. En Kaplan-Meier overlevelse plot og hazard ratio med 95% konfidensintervaller og log rank

P Drømmeholdet værdi blev beregnet. Signifikans blev fastsat til

P

0.05.

Køb af kliniske prøver

Friske vævsprøver fra NSCLC patienter, som gennemgik kirurgisk resektion mellem 2008 og 2012 blev indhentet fra vævsbanken, Jilin Universitet (Jilin, Kina). Prøver omfattede parret tumor og tilstødende ikke-cancervæv (n = 42) samt en stor gruppe af individuelle NSCLC biopsier (n = 266). Alle tumorer blev iscenesat i henhold til den 7. udgave af AJCC TNM for NSCLC, og patientdata indsamlet frem til 30. april, 2014 blev inkluderet for alle patienter. Kliniske data optaget inkluderet patientkarakteristika (f.eks, køn, alder), tumor egenskaber (f.eks, diameter, lymfe-knude metastase, histologiske undertyper, vaskulær invasion, og tumor differentiering), samlet overlevelse (OS) og sygdomsfri overlevelse (DFS) ,

TGFβR2

udtryk status, og kemoterapi

til analyse blev patienterne stratificeret efter alder, ≥ 60 eller 60 år. Tumorstørrelse blev defineret som den gennemsnitlige tumor diameter (MTD, defineret som det geometriske gennemsnit af fire diametre på CT-scanning), og tumorer blev grupperet efter størrelse, ≥ 5 cm og 5 cm. Opfølgningen blev gennemført via telefon eller direkte korrespondance. Tiden til tumor tilbagefald eller død blev bekræftet af patienten eller pårørende, ved medicinsk optagelse, eller af den sociale sikring rekord. Samlet overlevelse (OS) blev beregnet i måneder fra tidspunktet for diagnosen til dødstidspunktet, uanset årsag. Sygdomsfri overlevelse (DFS) blev defineret som perioden fra den oprindelige dato for diagnose til tidspunktet for tumorprogression ved CT-scanning, eller til tidspunktet for død på grund af sygdommen.

RNA Extraction

Totalt RNA blev ekstraheret fra NSCLC og normalt væv med TRIzol reagens, ifølge producentens instruktioner. RNA-koncentrationen blev målt i et spektrofotometer, og kvaliteten af ​​alle RNA-prøver blev vurderet ved elektroforese på 1,5% denaturerende agarosegeler.

Kvantitativ RT-PCR

Til kvantitativ realtids-PCR (QRT -PCR), cDNA blev syntetiseret ud fra total RNA (10 ng), og kvantitative PCR reaktioner blev udført med Taqman Universal PCR-kittet. GAPDH blev anvendt som den interne kontrol. De 2

-δδCT metode blev anvendt til at kvantificere ekspressionsniveauerne af

TGFβR2

.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført med IBM SPSS statistik for Windows, Version 19,0. Ekspressionen af ​​

TGFβR2

blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. En uafhængig T-test blev anvendt til at undersøge forskelle mellem to grupper, og en chi-square test blev anvendt til at evaluere forskelle i satserne mellem grupper. Kaplan-Meier-kurver blev anvendt til at bestemme den generelle overlevelse for de forskellige grupper, og resultaterne blev sammenlignet med en log-rank test. Univariate og multivariate overlevelse analyser var baseret på en Cox regressionsmodel, og denne model blev brugt til at identificere, hvilke uafhængige faktorer i fællesskab havde væsentlig indvirkning på overlevelse.

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Angivelse af TGFβR2 hjælp af online overlevelsesanalyse platform

TGFβR2

mRNA-ekspression i kræft vs normale væv var undersøgt under anvendelse af Oncomine database (fig 1A). Denne analyse viste, at

TGFβR2

blev overudtrykt i tumorvæv sammenlignet med det tilsvarende normale væv (fold ændring = 1,99;

P

0,001).

A , Expression niveauer af

TGFβR2

i kræft vs normale væv stammer fra Oncomine database. B, Survival analyse udført med Kaplan-Meier plot baseret på

TGFβR2

udtryk.

Den prognostiske værdi af ekspressionen af ​​

TGFβR2

blev vurderet med Kaplan Meier plotter platform. Resultaterne viste, at prognosen var værre for patienter med lunge- adenocarcinom hvor

TGFβR2

udtryk var 1,99 gange højere end i normale væv (HR = 1,28 (95% CI, 1,01-1,63),

P

= 0,038). Disse resultater viste, at høj ekspression af

TGFβR2

( 1,99 gange) var forbundet med en dårlig prognose i lunge adenocarcinom (Fig 1B)

TGFβR2 ekspression i NSCLC og normal lungevæv

for at validere disse resultater,

TGFβR2

mRNA-niveauer blev undersøgt i tumor (n = 308) og tilstødende ikke-kræft væv (n = 42) fra en kohorte af kinesisk NSCLC patienter ved QRT-PCR. Resultaterne viste, at

TGFβR2

ekspressionsniveauer var signifikant højere i NSCLC tumor biopsier (2,46 ± 0,42) i forhold til hosliggende ikke neoplastiske væv (1,01 ± 0,06). Denne forskel mellem tumor og normalt væv var statistisk signifikant (

P

= 0,001, tabel 1).

Forholdet mellem TGFβR2 udtryk og kliniske karakteristika

Foreninger mellem

TGFβR2

udtryk og individuelle kliniske karakteristika blev undersøgt. Resultaterne viste, at i disse 308 tilfælde af NSCLC,

TGFβR2

ekspressionsniveauerne var positivt korreleret med tumor differentiering (

P

= 0,029) og invasion af lungen membran (

P

= 0,045) samt kemoterapi (

P

0,001; tabel 2) .Men, var der ingen sammenhæng mellem

TGFβR2

udtryk og tålmodig køn, alder, rygning historie, lymph- node metastase, histologi, vaskulær invasion, TNM stadie, eller tumor diameter (

P

0,05).

Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev afbildet for at vurdere den prognostiske værdi af disse kliniske /biologiske egenskaber for OS. Den mediane opfølgning var 34,3 måneder (interval fra 14,3 til 79,3 måneder). Resultaterne af univariate analyser er vist i tabel 2. Som forventet var der en signifikant sammenhæng mellem kortere OS og klassiske prognostiske faktorer, såsom lymfe-node metastase (

P

= 0,026), invasion af lunge membran (

P

= 0,034), og tumorstørrelse (≥ 5 cm;

P

= 0,033). Desuden patienter behandlet med kemoterapi viste en signifikant øget OS (

P

0,001). Således faldt betydeligt OS var forbundet med patienter, der ikke havde gennemgået kemoterapi eller havde lymfeknude metastaser, invasion af lunge-membran, eller øget tumorstørrelse (≥ 5 cm).

Høj udtryk for TGFβR2 var en prognostisk markør for NSCLC patient overlevelse

for at bestemme om andre kliniske faktorer kan påvirke prognosen for NSCLC, univariat overlevelse analyse, stratificeret efter hver af de kliniske faktorer (herunder køn, alder, vaskulær invasion, tumorstørrelse, invasion af lunge-membran, lymfe-knude metastase, TNM stadie, tumor differentiering, rygning historie, og

TGFβR2

udtryk), blev udført med Kaplan-Meier-estimater. Resultaterne af Kaplan-Meier overlevelse analyse viste, at prognosen var værre hos patienter med høj ekspression af

TGFβR2

. Angivelse af

TGFβR2

var signifikant forbundet med nedsat OS (

P

= 0,009, Fig 2A) og DFS (

P

= 0,003, Fig 2B) i NSCLC patienter. For at vurdere indflydelsen af ​​lymfe-knude metastaser og tumor størrelse på prognose NSCLC patienter blev Kaplan-Meier overlevelseskurver plottet og log rank analyse blev udført. Lymfeknuder-node metastase var signifikant associeret med kortere OS (

P

= 0,026, Fig 2C) og DFS (

P

= 0,002, Fig 2D) i NSCLC. Lignende resultater blev opnået for tumorstørrelse (OS,

P

0,001, Fig 2C og DFS,

P

0,001, figur 2D).

univariat overlevelsesanalyse af OS og DFS i lunge karcinom, som bestemt ved Kaplan-Meier plots skøn baseret på

TGFβR2

udtryk i (A) og (B); lymfe-knude metastaser i (C) og (D); og lungekræft tumor størrelse i (E) og (F) henholdsvis.

univariat analyse med en Cox proportionel risiko regressions model viste, at invasion af lunge-membran (

P

= 0,04 ), tumor størrelse (

P

0,001), og lymfeknude metastaser (

P

= 0,02) blev også positivt korreleret med dårlig prognose (tabel 3). Endnu vigtigere, kemoterapi viste sig at øge OS (

P

= 0,033, HR = 1,489 [1,032, 2,418], Fig 3A) og DFS tid (

P

= 0,048, HR = 1,444 [1,004, 2,078], fig 3B). Hertil kommer, lav udtryk for

TGFβR2

i NSCLC tumorer fra patienter behandlet med kemoterapi var en afgørende beskyttende faktor til OS (

P

= 0,003, HR = 2,24 [1. 32, 3,79], fig 3C) og DFS (

P

0,001, HR = 9,40 [4,92, 17,98], fig 3D). Ingen korrelationer blev observeret med køn, alder, vaskulær invasion, invasion af lunge membran, TNM stadie, tumor differentiering eller rygevaner. Tilsammen disse resultater viste, at ekspressionen af ​​

TGFβR2

kan spille en potentiel rolle i NSCLC progression og korrelerer med resultatet af NSCLC patienter.

univariat analyse af OS (A) og DFS (B ) med en Cox proportionel risiko model i lungekræft baseret på kemoterapi, som bestemt af Cox regression skøn. Multivariat analyse af OS (C) og DFS (D) med en Cox proportionel risiko model i lungekræft baseret på kemoterapi og

TGFβR2

udtryk, som bestemt af Cox regression skøn.

en multivariat Cox proportionel risiko regressions analyse blev udført for at fastslå, om udtryk for

TGFβR2

var en prognostisk markør i NSCLC patienter. Modellen oprindeligt omfattede alle de parametre, der var prædiktive for OS i univariate analyse af hele studiegruppe som vist i tabel 3 (alder, køn, rygevaner, lymfe-knude metastase, tumor differentiering, histologi, vaskulær invasion og diameter, og invasion af lunge-membran). En fremad trinvis procedure blev vedtaget for at opnå den endelige model af væsentlige prædiktorer til OS, der består af de faktorer, lymfe-knude metastase, diameter, invasion af lunge-membran, og udtryk for

TGFβR2

. Ifølge multivariable Cox regressionsmodellen analyse, høj ekspression af

TGFβR2

blev identificeret som en indikator for kortere OS i NSCLC patienter.

kemoterapi forbundet med lav udtryk for TGFβR2 stærkt forbedrer OS og DFS af NSCLC patienter

Kemoterapi tjener som primær behandling i de fleste NSCLC tilfælde. OS og DFS af patienter blev derfor analyseret på basis af behandlingen status. Kemoterapi viste sig at signifikant forlænge OS (33,5 ± 1,05 vs. 24,37 ± 1,22,

P

= 0,025) og DFS (32,47 ± 0,84 vs. 24,37 ± 1,22,

P

= 0,037) af patienterne i denne kohorte (tabel 4). Da dataene blev analyseret baseret på

TGFβR2

ekspression samt behandling status, OS og DFS tid viste sig at være væsentlig længere i behandlede NSCLC-patienter med lav ekspression af

TGFβR2

i modsætning til ubehandlet patienter med høj ekspression (40,70 ± 2,07 vs. 24,23 ± 1,25,

P

= 0,002 og 36,53 ± 2,97 vs. 21,33 ± 1,34,

P

0,001). (tabel 4)

resultaterne viste, at

TGFβR2

var stærkt udtrykt i patienter med en dårlig prognose, selv når de behandles med kemoterapi. Univariate og multivariate overlevelse analyse blev udført med Kaplan-Meier-estimater for yderligere at bestemme, om kemoterapi og /eller

TGFβR2

udtryk var forbundet med OS og DFS. Resultaterne af univariat analyse viste, at langvarig OS og DFS var forbundet med behandling (Fig 3A (HR = 1,489 [1,032, 2,418],

P

= 0,033) og Fig 3B (HR = 1,444 [1,004, 2,078] ,

P

= 0,048), henholdsvis). Når patientdata blev yderligere stratificeret baseret på

TGFβR2

udtryk samt behandling status, multivariat Cox proportionel risiko regressions analyse viste en øget OS (HR = 2,24 [1,32, 3,79],

P

= 0,003, fig 3C) og DFS (HR = 9,40 [4,92, 17,98],

P

. 0,001, figur 3D) i behandlede patienter med lav

TGFβR2

udtrykker tumorer

diskussion

de molekylære komponenter i TGF-β familien har været i fokus molekylære studier belyser somatiske mutationer i mange menneskelige kræftformer. Her blev NSCLC biopsier og tilstødende ikke-kræft væv undersøgt for ekspression af

TGFβR2

. Den samlede overlevelse hos patienter med høj ekspression ( 1,99 gange) af

TGFβR2

blev nedsat i forhold til patienter med lav udtryk for

TGFβR2

. Desuden blev kliniske parametre såsom lymfeknudemetastaser og tumorstørrelse associeret med en dårligere prognose i denne kohorte. Endelig en sammenhæng mellem

TGFβR2

udtryk og kemoterapi frem fra vores analyse, hvilket tyder på en mulig rolle for denne biomarkør i respons på kemoterapi.

Modstand mod kemoterapi er en stor udfordring i behandlingen af kræft [24]. Kræft gentagelse er et problem hos patienter, der ikke kun under behandling med traditionelle kemoterapi, men også med mere moderne molekylære målrettede behandlinger. Inhibering af TGF-β-signalvejen med forbindelser med små molekyler imidlertid har vist sig at være en måde at vende modstanden i NSCLC til målrettet terapi [25]. Adskillige undersøgelser viste, at anti-

TGFβR2

antistof som et terapeutisk inhibitor i kombination med kemoterapi blokerede bindingen af ​​

TGFp1

, 2, og 3. Inhibering af TGF-β forstyrret aktivering af Smad2, som har vist sig at styre metastase, tumorvækst og invasion af cancerceller [26]. Behandling med specifikke antistoffer i andre undersøgelser inhiberede også primær tumorvækst og metastase [27,28]. Behandling med det cytotoksiske middel cyclophosphamid i kombination med inhibering af TGF-β-vejen var særlig effektiv til at dæmpe primær tumorvækst og metastase [26]. Derfor er en terapeutisk tilgang, der hæmmer

TGF-β

signaltransduktion kan vise sig at være specielt effektiv for NSCLC patienter med påviselig udtryk for

TGFβR2

. Faktisk blokerer TGF-β signal med opløseligt TGF-β-receptor type II-protein inhiberede TGF-β-binding til endogene

TGF-β

receptorer og reduceret tumorcellemotilitet, intravasation, og fjern metastase i en musemodel [ ,,,0],29].

Klinikere har undersøgt anvendeligheden af ​​kemoterapi og strålebehandling i både præoperative og postoperative sammenhænge med henblik på at vurdere den samlede overlevelse og sygdomsfri overlevelse for patienter med resektabel NSCLC [30]. Men med en stadig mere detaljeret molekylær forståelse af udvikling af kræft, har individualiserede behandlingsstrategier blevet genstand for forbedring af kræftbehandling. Molekylære biomarkører derfor er begyndt at spille en fremtrædende rolle i den kliniske behandling af kræftpatienter, som de angiver sandsynligheden for en reaktion på kemoterapeutisk indgriben i den enkelte patient. Biomarkører øjeblikket er relevante for målrettet terapi i NSCLC er EGFR, HER2, og KRAS mutations status, ALK-gen omlejring, og c-Met protein udtryk [31]. Disse biomarkører har stimuleret den fælles udvikling af nye lægemidler med companion diagnostics [32].

Betydelig indsats for at identificere en molekylær signatur, ville forudsige respons på kræft adjuverende behandling er i gang med henblik på at gennemføre og forbedre den nuværende standard af klinisk pleje [33-35]. Men det reelle potentiale for biomarkører ligger i deres mulige udvikling, som en molekylær målrettet terapi i behandlingen af ​​specifikke undergrupper af NSCLC patienter [36]. Mange vigtige signalveje er involveret i udviklingen af ​​NSCLC, og kemoterapi følsomhed eller resistens over for forskellige antistof eller hæmmer agenter, der er målrettet disse veje kan specifikt administreret baseret på udseendet af specifikke biomarkører i individuelle patienter [26,37,38].

sammenfattende viste vores data, at med kemoterapeutiske behandling median OS og DFS af patienter blev forøget. Desuden patienter stratificeret efter kemoterapi sammen med lav udtryk for

TGFβR2

udstillet den længste OS og DFS i denne kohorte. I modsætning hertil ubehandlede patienter med høj ekspression af

TGFβR2

udstillet den korteste OS og DFS. Analyserne viste således, at i tilfælde af lav

TGFβR2

udtryk, kemoterapi forbedrer samlet overlevelse og sygdomsfri overlevelse hos patienter med NSCLC. Derfor

TGFβR2

er en potentiel tumor biomarkør for kemosensitivitet i NSCLC. Men yderligere undersøgelse med større kohorter er nødvendig for at bekræfte disse resultater.

Konklusion

TGFβR2

udtryk i NSCLC væv var betydeligt højere end i ikke-neoplastiske væv. Analyser viste, at høj ekspression af

TGFβR2

( 1,99) var en kritisk risikofaktor for nedsat OS og DFS i NSCLC patienter. Derfor er vores resultater viser, at

TGFβR2

transkriptniveauer kan have en vigtig rolle i NSCLC progression og kunne udvikle sig som en lovende prognostisk biomarkør for patienter med NSCLC kemoterapi.