PLoS ONE: lymfangiogenese i regionale lymfeknuder er en uafhængig Prognostisk Marker i endetarmskræft Patienter efter Neoadjuverende Behandling

Abstrakte

En af de vigtigste prognostiske faktorer i endetarmskræft er lymfeknude metastaser. Dannelsen af ​​lymfeknudemetastaser er afhængig af eksistensen af ​​en premetastatic niche. En vigtig faktor foregående metastase er lymfekar som er placeret i lymfeknuden. Følgelig er forekomsten af ​​intranodalt lymfangiogenese menes at indikere fjernmetastaser og dårligere prognose. For at vurdere betydningen af ​​lymfeknude lymfangiogenese, vi studerede formalin, paraffinindstøbte indlejret adenokarcinomer og regionale lymfeknuder på 203 rektal kræftpatienter, som blev behandlet med neoadjuverende radiochemotherapy og fortløbende helbredende operation med kræft gratis kirurgiske margener (R0). Regionale lymfeknude lymfekar blev påvist ved immunhistokemi for podoplanin (D2-40). Vores resultater viser, at tilstedeværelsen af ​​lymfekar i regionale lymfeknuder væsentligt påvirker sygdomsfri overlevelse i univariate og multivariate analyser. I modsætning hertil var der ingen sammenhæng mellem peritumoral eller intratumoral lymfekar tæthed og prognose. Faktisk vores undersøgelse viser betydningen af ​​lymfangiogenese i regionale lymfeknuder efter neoadjuverende radiochemotherapy og fortløbende kirurgi som en selvstændig prognostisk markør. Farvning for intranodalt lymphangiogenese og metoder til intravital billeddannelse af lymphangiogenese og lymfe flow kan være en nyttig strategi til at forudsige langsigtede resultat i rektal kræftpatienter. Desuden tilsætning af VEGF-blokerende midler til standardiserede neoadjuverende behandling ordninger kan angives i fremskreden endetarmskræft

Henvisning:. Jakob C, Aust DE, Liebscher B, Baretton GB, Datta K, Muders MH (2011) lymfangiogenese i regionale lymfeknuder er en uafhængig Prognostisk Marker i endetarmskræft Patienter efter Neoadjuverende Treatment. PLoS ONE 6 (11): e27402. doi: 10,1371 /journal.pone.0027402

Redaktør: Soumitro Pal, Børnehospital Boston Harvard Medical School, USA

Modtaget: September 20, 2011; Accepteret: 17 okt 2011; Udgivet: November 7, 2011

Copyright: © 2011 Jakob et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Ingen strøm eksterne kilder finansierer denne specifikke undersøgelse. Generelt blev arbejdet af forskerne støttet af tilskud til MHM (Wilhelm Sander Stiftung fur Krebsforschung) og KD (R01-NIH, CA140432)

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Præoperativ (neoadjuverende) radiochemotherapy efterfulgt af helbredende operation er blevet standard behandling i lokalt fremskreden endetarmskræft [1]. Den histopatologiske tumorregression som korrelat til lokal behandling effekt varierer fra ingen til minimal regressive forandringer til at fuldføre svar [2], [3]. Den lymfeknude status efter neoadjuverende radiochemotherapy er imidlertid fortsat den vigtigste uafhængige prognostiske faktor for sygdomsfri overlevelse, som patienter med post-terapeutiske positive lymfeknuder (YPN +) har en ugunstig prognose uanset regression af den primære tumor [2], [3], [4], [5], [6]. Således kan inhibering af regionale lymfeknudemetastaser være en effektiv fremtidig avenue til behandling rektale cancerpatienter. Derfor er der gjort en indsats for at afdække mekanismerne i lymfeknudemetastaser. Det er blevet foreslået, at fremkaldelsen af ​​lymfangiogenese i den primære tumor og i lymfeknuder bidrager væsentligt til tumormetastaser [7], [8]. I denne undersøgelse har vi valideret lymfangiogenese i regionale lymfeknuder som en indikator for dårlig prognose og facilitator for fjernmetastaser i en kohorte af neoadjuverende behandlede avancerede rektal kræftpatienter. Det er en bedre indikator end peri- og intratumorale lymfeknuder fartøj tætheder eller standardiserede tumor regression klassificering systemer til denne gruppe af rektal kræftpatienter.

Resultater

klinisk-patologisk karakterisering af den evaluerede kohorte

Alle patienter undergik rektum resektion med total mesorectal excision efter neoadjuverende radiochemotherapy. I alle patienter en lokalt helbredende resektion blev opnået (R0-situation). Patologisk mellemstation er rapporteret i tabel 1. Fuldstændig tumorregression [9] blev observeret i 10 tilfælde (5%). 57 patienter oplevede tumor regression grad 3 (28%). 85 patienter udviste tumorregression grad 2 (42%) og 48 patienter havde tumorregression grad 1 (23%). Ingen tumorregression blev observeret i 3 patienter (1,5%). Ved median opfølgning på 223 uger (95% konfidensinterval 216,9 til 247,3 uger) havde 38 patienter recidiv, 32 udviklede fjernmetastaser og 6 lokale gentagelser. blev påvist fjernmetastaser i følgende organer: lever 15 (HEP), pulmonal 6 (PUL), fjern ikke-regionale lymfeknuder 3 (LYM), lungehinden 1 (PLE), hud en (HUD), bughinden 1 (PER), knogle 2 (OSS), lever- og pulmonal 2 (HEP og PUL), og andre 1 (OTH). I disse tilfælde recidiv og fjernmetastaser blev bekræftet ved patologisk evaluering og eksamen. I otte tilfælde blev brugt kliniske oplysninger (adgang til ved en dokumentation assistent) til at opdage sygdommen tilbagefald.

For at opdage metastatiske tumorceller i lymfeknuder vi brugte standard HE farvning samt Pan-Cytokeratin farvning hjælp af en kommercielt tilgængeligt monoklonalt antistof (Dako Inc.) i mindst tre serielle sektioner af lymfeknude. En median på 14 regionale lymfeknuder per sag blev undersøgt. Tilstedeværelsen af ​​Pancytokeratin positive tumorceller angivet lymfeknudemetastaser (fig. 1A).

A. Immunhistokemi for Pancytokeratin at detektere lymfeknude mikrometastaser. B. Podoplanin farvning med D2-40 i en lymfeknude med metastaser. Den røde til brune farvningsresultater varemærker lymfekar. C. Podoplanin farvning med D2-40 i en lymfeknude uden metastaser.

Foreningen af ​​regression af primær tumor og lymfeknude metastaser med klinisk-patologiske parametre og prognostiske parametre

En signifikant korrelation fundet mellem kvaliteter af tumor regression (fig. 2) og progressionsfri overlevelse, når dikotomiseret for høj og lav tumorregression (p = 0,0033 Log-Rank) (fig. 3A) i Kaplan Meier-analyse. Multivariat analyse viste en statistisk signifikant forskel, når man sammenligner TRG 1 og TRG 3 (tabel 2). Som i tidligere offentliggjorte rapporter [2], [3], [4], [5], [6], vi også påvist, at lymfeknudemetastaser er en vigtig uafhængig prognostisk faktor i vores kohorte (p = 0,0017 Log-Rank) ( fig. 3B).

A. HE farvede rektal adenocarcinom med tumorregression grad 1 (40x). B. HE farvede endetarmskræft væv med tumorregression grad 1 (100x) C. Rektal karcinom med tumorregression grad 2 (40x) D. Rektal adenocarcinom med tumorregression grad 2 (100x). E. Tumor regression grad 3 (100x) i endetarmskræft med ekstracellulær mucin ophobning. F. lymfeknudemetastase regression grad 2 (40x). G. lymfeknudemetastase regression grad 3 (40x). H. Regional lymfeknude metastaser (400x) i standard HE farvning.

A. Tid til progression i ugen i forhold til sandsynligheden for progressionsfri overlevelse stratificeret for en dikotomiseret tumorregression grading (TRG 0/1/2 = ingen regression eller dominerende tumor masse med indlysende fibrose eller mucin eller overvejende fibrotisk eller mucinøse ændringer, med tumorceller eller grupper TRG 3/4 = meget få tumorceller i fibrotisk eller mucinøs væv eller ingen tumorceller, kun fibrotisk eller mucinøs masse /total regression,. i henhold til Dworak et al 1997). B. Tid til progression i ugen i forhold til sandsynligheden for progressionsfri overlevelse stratificeret for lymfeknude metastaser (ypN0 og YPN +).

Foreningen af ​​peritumoral og intratumoral lymfeknuder fartøj tæthed med lymfeknude metastase, UICC fase, og prognostiske parametre

i et næste skridt vi vurderet den peritumoral og intratumoral lymfangiogenese (pLVD og ilvD) og dens forhold til metastaser i vores kohorte. Lymphangiogenese blev vurderet ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt antistof, der detekterer podoplanin (D2-40, Dako) (fig. 1B og 1C). Farvningen er specifik for lymfatisk endotel og ikke pletter nogen blodkar med påviselige intraluminale erythrocytter. pLVD var ikke signifikant korreleret med lymfeknudemetastaser (p = 0,08 χ

2). Der var ingen signifikant korrelation af pLVD og ypUICC stadium eller sygdomsfri overlevelse. Derudover havde ilvD ikke korrelerer med prognose, lymfeknude metastaser, eller ypUICC scenen.

Foreningen af ​​intranodalt lymphangiogensis i regionale lymfeknuder med UICC stadium, progressionsfri overlevelse, og typen af ​​tilbagefald

bord -1-captionIn parallel, vurderede vi intranodalt lymfangiogenese ved farvning regionale mesorectal lymfeknuder med D2-40 som tidligere beskrevet. En lymfeknude er klassificeret som positive for intranodalt lymfangiogenese når mindst en lymfekar kan påvises i den follikulære eller /og interfollicular region af mindst et mesorectal lymfeknude (betegnet NLV +). I det væsentlige, i 102 patienter alle lymfeknuder var negative for lymfeknude lymfangiogenese, mens der i 43 patienter i én lymfeknude påviselig lymfangiogenese kunne ses. Hos 58 patienter mere end én regional lymfeknude har detekterbar lymfangiogenese.

Vi fandt en statistisk signifikant korrelation mellem NLV + (lymfangiogenese i mindst én mesorectal /regionale lymfeknuder) og tumor tilbagefald samt ypUICC fase (tabel 1 ). Kaplan Meier analyse viste en signifikant korrelation af NLV + med progressionsfri overlevelse tid (p = 0,0071 logrank) i hele kohorten (fig. 4A). Desuden NLV + var en uafhængig prognostisk faktor undersøgt af Cox proportionel risiko regressions model med kovariater ypUICC-trins, alder, køn, tumor regression, intratumoral lymfeknuder fartøj tæthed, peritumoral lymfeknuder fartøj tæthed, og lymfeknude lymfeknuder fartøj tæthed (tabel 2 ). Derfor undergruppe analyse af node-negative patienter præsenteret en signifikant sammenhæng mellem NLV + og sygdomsfri overlevelse (fig. 4B) ved hjælp af Kaplan-Meier analyse. Når man sammenligner hyppigheden af ​​hepatisk metastaser hos patienter med og uden mesorectal intranodalt lymfangiogenese (NLV +), fandt vi mere hepatisk metastaser hos patienter med nodal lymfangiogenese (13 hepatisk metastaser hos patienter med intranodalt lymfangiogenese versus 2 hepatisk metastaser hos patienter uden intranodalt lymfangiogenese). Vi evaluerede også antallet af lymfeknuder fartøjer (lymfe fartøj tæthed, nLVD) påvist i de regionale lymfeknuder. Her, det maksimale antal lymfekar detekteret i en lymfeknude med lymfangiogenese korrelerer signifikant med knudepunktet status (ypN0 eller YPN +; p = 0,01 χ

2) (Fig 5B.). I modsætning hertil var der ingen korrelation af det maksimale antal lymfekar med fjerne metastaser. Når dichotomizing ifølge medianen af ​​den maksimale lymfeknude lymfeknuder fartøj tæthed, kunne vi ikke finde nogen signifikant sammenhæng med tid til progression. Også, at antallet af lymfeknuder med lymfangiogenese ikke korrelere med ypUICC scene eller tumor tilbagefald i undergruppen af ​​patienter med NLV +. Sammenfattende tilstedeværelsen af ​​regionale lymfeknude lymfekar udgør en uafhængig prognostisk parameter, mens nodal lymfekar tæthed samt antallet af lymfeknuder med påviselig nodal lymfangiogenese kunne være af mindre betydning for den samlede prognose.

“med lymfeknude lymfangiogenese” er defineret som mindst en regional /mesorectal lymfeknude med påviselig lymfangiogenese i follikulære eller interfollicular område. A. Tid til progression i uger i forhold til sandsynligheden for sygdomsfri overlevelse stratificeret for tilstedeværelsen af ​​lymfeknude lymfangiogenese hos alle patienter. B. Tid til progression i ugen i forhold til sandsynligheden for sygdomsfri overlevelse stratificeret for tilstedeværelsen af ​​lymfeknude lymfangiogenese i node-negative patienter.

A. Box plots sammenligne antallet af lymfekar i peritumoral region med tilstedeværelsen eller fraværet af lymfeknudemetastase. B. Box plots sammenligne antallet af regionale lymfeknude lymfekar i forhold til nærvær eller fravær af lymfeknudemetastase hos patienter med påviselige lymfekar i de regionale lymfeknuder.

Association of lymfeknudemetastase regression sortering og prognose

i vores kohorte, var der ingen statistisk signifikant sammenhæng mellem lymfeknude metastaser regression sortering og tumor tilbagefald /sygdomsfri overlevelse i Kaplan Meier-modellen i alle patienter og i undergruppe analyser. I multivariate analyser nogen statistisk relevant sammenhæng kunne findes.

Diskussion

Uanset tumorstørrelse og omfanget af invasion, regional lymfeknude metastaser (YPN +) er en vigtig prognostisk faktor hos patienter behandlet med neoadjuverende radiochemotherapy [2], [3], [4], [5], [6]. Derfor er det vigtigt at belyse mekanismerne i lymfeknudemetastaser samt hvordan lymfeknudemetastase kunne påvirke den gennemsnitlige patientoverlevelse. Selvom kontroversielle, peritumorale lymfevejene indberettes af nogle til at spille en rolle i at fremme lymfeknude metastaser i kolorektal cancer [10], [11], [12], [13] [12], [14], [15]. Vi brugte D2-40 antistof (Podoplanin, celleoverfladen sialylerede glycoprotein) [16], [17] at farve lymfekar i ubearbejdet adenokarcinomer og mesorectal lymfeknuder på 203 rektal kræftpatienter. Disse patienter blev behandlet med præoperativ radiochemotherapy efterfulgt af fuldstændig kirurgisk fjernelse af tumoren (R0). Vores resultater indikerer ingen signifikant sammenhæng mellem peritumoral og intratumoral lymfangiogenese og patient prognose. Interessant, observerede vi lymfeknude lymfangiogenese var en vigtig prognostisk parameter i denne patient kohorte. Som tidligere rapporteret, kan lymfangiogene vækstfaktorer, såsom VEGF-C og VEGF-A migrerer til de regionale lymfeknuder fra primære tumorer og fremme lymfangiogenese [7], [18]. Vi kan forudsige et lignende fænomen i kolorektal cancer som niveauet af VEGF-C viste sig at være forhøjet i blodserum patienter med colorectal cancer [19]. Det er blevet antaget, at lymfeknude lymfekar kan fungere som en metastatisk niche for cancerceller [7], [8], [20], [21] og lette yderligere metastatisk transformation af tumorcellerne. Dette kan føre til terapi-resistent metastatisk kræft og er derfor ansvarlig for dårlig patient prognose. Undersøgelser i andre kræftformer også indikere en tilsvarende prognostisk betydning af lymfeknude lymfangiogenese. I en B16 melanom musemodel blev det påvist, at lymfeknude lymfangiogenese er en tidlig reaktion på tumorvækst og går forud tumormetastase [22]. Betydningen af ​​skildvagtslymfekirtel lymfangiogenese i metastatisk spredning af brystkræft til ikke-skildvagtslymfekirtel er blevet vist i humane patienter. [23]. Lignende resultater indikerer vigtigheden af ​​lymfeknude lymfangiogenese blev rapporteret i bugspytkirtelkræft [8] pladecellekræft hoved- og halscancer [21], og extramammary Pagets sygdom [20].

Multimodal forbehandling af lokalt avanceret endetarmskræft har vist terapeutiske fordele for patienterne [24]. Tidligere er det blevet vist, at lymfangiogene vækstfaktorer fx VEGF-C blev opreguleret af tumorceller under stress og fremmet deres stress-modstand evne, [25] ,, [26]. Derfor er det muligt, at terapeutisk stress under neoadjuverende behandling af rektal cancer øger niveauet af syntese af lymfangiogene vækstfaktorer og øger dannelsen af ​​lymfekar i regionale lymfeknuder. Dette fører i sidste ende til tumor tilbagefald og metastaser. Blokering af lymfangiogene akse under neoadjuverende behandling bør derfor forbedre resultatet af de nuværende retningslinjer for fremskredent stadium rektal kræftbehandling. Associeringen af ​​lymfeknude lymfangiogenese og værre prognose foreslår endvidere den rutinemæssige påvisning af lymfeknude lymfangiogenese som et vigtigt parameter til forudsigelse af cancer tilbagefald og som indikator for en mere aggressiv adjuvans behandling.

Som konklusion vores undersøgelse viser, at tilstedeværelsen af ​​intranodalt lymfangiogenese repræsenterer en uafhængig prognostisk markør forbundet med kortere progressionsfri overlevelse hos patienter med lokalt fremskreden endetarmskræft, som behandles med neoadjuverende radiochemotherapy. Derfor strategier til at opdage lymfeknude lymfangiogenese i kliniske omgivelser kan bidrage til at identificere de patienter, som vil have gavn af mere aggressive behandlingsmuligheder. Også inddragelse af en terapeutisk tilgang til at blokere lymfangiogenese ville være gavnligt at neoadjuvantly behandlet avancerede rektal kræftpatienter.

Materialer og metoder

Patient materiale

Materiale anvendt i denne undersøgelse er omfattet af godkendelsen af ​​etik s udvalg i Universitetshospital “Carl Gustav Carus”, TUD-medicinske fakultet, til brug i forskning (EK59032007 “Feingewebliche und molekularpathologische Untersuchung i langzeit-archiviertem Gewebsmaterial des Instituts fuer Pathologie des Universitaetsklinikum Dresden /Medizinische Fakultaet Carl Gustav Carus, TU Dresden “formand for udvalget: W. Kirch, MD). Beslutningen af ​​etik er udvalget specifikt godkendt brugen af ​​væv materiale til dette minimalt invasiv og retrospektiv undersøgelse, der bruger patientens materiale, der har været opbevaret i mere end tre år. Alle patienter samtykke til brugen af ​​væv materiale til forskning (som nævnt i filerne af patienterne). Ifølge Etik s udvalg mundtligt samtykke er tilstrækkeligt i denne sag (denne godkendelsesproceduren er godkendt af Etik er udvalget), fordi den bruges her materiale ikke er forbundet med navnet på patienten og er kodet. To hundrede og tre patienter (mandlige: n = 152, kvindelige: n = 51, median alder = 70 år) med lokalt fremskreden rektal adenocarcinom (UICC stadium II /III) mellem 2001 og 2008 indgik i denne undersøgelse (figur 1). Alle patienter undergik præoperativ (neoadjuverende) 5-fluorouracil (5-FU) baseret radiochemotherapy og helbredende R0 kirurgi i analogi med den randomiserede fase III tyske endetarmskræft Trials CAO /ARO /AIO-94 [1]. Dataene for sygdom tilbagefald (fjernmetastaser eller lokale gentagelser) samt andre relevante data blev hentet fra databasen af ​​Patologisk Institut, University Hospital “Carl Gustav Carus”, Medicinske Fakultet ved universitetet i Dresden, Tyskland.

Patologisk undersøgelse af kræft prøven efter neoadjuverende terapi

mindst fire prøver blev taget og vurderet fra den primære endetarmskræft. I tilfælde af okkult resterende kræft i løbet grov undersøgelse blev den komplette tidligere kræftområdet indlejret og undersøgt ved histologi. I tilfælde af fravær af resterende cancerceller i HE farvende vitale epiteliale cancerceller blev påvist ved cytokeratin farvning. Denne procedure sikrer, at terapi-induceret væv fibrose samt ekstracellulære mucin ophobninger ikke blev betragtet som residual kræftvæv og incuded i tumorregression grading. Mesorectal regionale lymfeknuder blev dissekeret i henhold til “Union Internationale contre kræft” (UICC). Ved undersøgelse af mindre end tolv regionale mesorectal lymfeknuder perirectal fedtvæv (mindst ti paraffinblokke) blev indlejret og undersøgt for tilstedeværelsen af ​​yderligere lymfeknuder, som ikke var detekterbar ved grov undersøgelse. For at detektere resterende kræftceller Pancytokeratin farvning blev udført som beskrevet.

Tumor og lymfeknude metastaser regression klassificering

Histopatologisk tumor regression (TRG) inden den primære tumor blev gradueret efter den semikvantitative indført ved Dworak et al. [9]: TRG 0 = ingen regression; TRG 1 = dominerende tumormasse med indlysende fibrose eller mucin; TRG 2 = overvejende fibrøs eller mucinøse ændringer, med få tumorceller eller grupper; TRG 3 = meget få tumorceller i fibrotisk eller mucinøs væv; TRG 4 = ingen tumorceller, kun fibrøs eller mucinøs masse /total regression [2] (fig. 2).

tegn på tumor respons på præoperativ radiochemotherapy inden for de perirectal lymfeknuder blev defineret som tilstedeværelse af nodal fibrose eller mucin puljer (med eller uden tilbageværende tumorceller), som beskrevet tidligere [27], [28]. Lymfeknudemetastase regression (LRG) blev evalueret med de samme parametre som den primære tumor regression overvejer de metastatisk lymfeknude: LRG 0 = ingen regression; LRG 1 = dominerende tumormasse med indlysende fibrose eller mucin; LRG 2 = overvejende fibrøs eller mucinøse ændringer, med få tumorceller eller grupper; LRG 3 = meget få tumorceller i fibrotisk eller mucinøs væv; LRG 4 = ingen tumorceller, kun fibrøs eller mucinøs masse /total regression. Ikke-metastatiske lymfeknuder blev skelnes fra dem med total metastatisk regression (LRG 4) ved fravær af fibrose eller mucin (fig. 2). Når forskellige LRGs blev fundet hos én patient blev kun lymfeknude med den værste regression overvejes.

Immunhistokemi

Immunhistokemi blev udført på 2 um snit af paraffinindlejrede blokke fra den primære tumor og regionale lymfeknuder. Deparaffination, rehydrering, og antigen-genvinding blev udført ved dampning (98 ° C, 45 min) i PT Modul puffer (pH 8,0) (Thermo Scientific, Medac, Hamburg, Tyskland). Vævene blev vasket i Tris-bufret saltvand (TBS) (Thermo Scientific, Medac, Hamborg, Tyskland) og inkuberet med monoklonalt muse-anti human podoplanin påvisning D2-40-antistof (DAKO, Hamburg, Tyskland, 1:400 fortynding) i 30 min ved stuetemperatur. Derefter blev endogen peroxidaseaktivitet inhiberes ved at inkubere objektglassene i 3% H

2O

2 i 10 minutter. Efter vask i TBS, Ultravision LP stort påvisning volumen systemet HRP Polymer (Thermo Scientific, Medac, Hamborg, Tyskland) blev anvendt ifølge producentens anbefaling. Sektionerne blev farvet med 0,5 mg /ml diaminobenzidin tetrahydrochlorid (DAB) og counter-farvet med hematoxylin. I alle eksperimenter blev positive og negative kontroller inkluderet.

Evaluering af immunhistokemi

lymfekar densitet blev vurderet ved metoden “hot-spot” som tidligere beskrevet og blev også benævnt Chalkley punkt stregglasset metode [29]. Kort beskrevet blev alle dias scannet ved lav forstørrelse (x40) og områder med den højeste tæthed af D2-40 positive kar blev identificeret. Derefter blev antallet af D2-40 positive skibe tælles i de områder i fem high-power felter (HPF, x400) af to uafhængige patologer (CJ og MHM) uden kendskab til de klinisk-patologiske fund, og middelværdien af ​​fartøjet tæller var beregnet. Intratumoral (lymfekar i tumormassen) og peritumoral (lymfekar uden for tumoren, men inden for 2 mm fra tumorinvasion front) LVD blev bestemt særskilt. Fartøjer tæt på sår områder blev ikke talt. LVD blev vurderet på alle dissekerede mesorectal lymfeknuder herunder nodal metastaser, residual lymfoide væv af metastatiske lymfeknuder (hvis eksisterende), og alle ikke-metastatiske lymfeknuder. Allerede eksisterende intranodalt fartøjer (mellemliggende samt marginale sinus) blev ikke talt. Som led i evalueringen blev bekræftet høj interobserver aftale ved hjælp af Cohens Kappa koefficient (κ = 0,8; p 0,001). I tilfælde af interobserver forskelle blev sagen revurderes ved samtidig revurdering af prøven.

Statistisk analyse

Alle tests udføres ved hjælp af SAS JMP Version 9. Foreninger mellem forskellige kategoriske variabler blev vurderet ved hjælp af χ

2 test. Kontinuerlige variabler blev sammenlignet under anvendelse Mann-Whitneys U-test eller ANOVA. Tid til progression satser blev sammenlignet ved hjælp af den univariate analyse af Kaplan-Meier, multivariat analyse blev udført ved hjælp af Cox proportionel risiko regressions model med kovariater ypUICC-stadie, alder, køn, tumor regression, intratumoral lymfeknuder fartøj tæthed, peritumoral lymfeknuder fartøj tæthed, lymfeknude lymfekar tæthed. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Tak

Forfatterne takker Marissa J Stanton, University of Nebraska Medical Center, til kritisk gennemgang af manuskriptet.