PLoS ONE: Etablering af stærkt Tumorgenetisk human Kolorektal Cancer Cell Line (CR4) med Egenskaber af formodede Cancer Stem Cells

Abstrakt

Baggrund

Kolorektal cancer (CRC) har den tredje højeste dødelighed blandt den amerikanske befolkning. Ifølge den seneste begrebet carcinogenese, er humane tumorer organiseret hierarkisk, og toppen af ​​det er besat af maligne stamceller (cancer stamceller, CSCS eller cancer-initierende celler, CICS), som besidder ubegrænset selvfornyelse og tumor -initiating kapacitet og høj modstandsdygtighed over for konventionelle terapier. For at afspejle den kompleksitet og mangfoldighed af humane tumorer og give klinisk og fysiologisk relevant kræftmodeller, store banker på karakteriserede patient-afledte lav passage cellelinjer, og især CIC-beriget cellelinjer, er der et presserende behov for.

vigtigste resultater

Her rapporterer vi etableringen af ​​en ny CIC-beriget, meget tumorigen og klonogenisk coloncancercellelinie, CR4, stammer fra levermetastaser. Denne stabile cellelinie blev etableret ved at kombinere 3D-dyrkning og 2D dyrkning i stamceller medier, subkloning af celler med særlig morfologi, co-kultur med carcinom forbundet fibroblaster (CAF) og seriel transplantation at nikke /SCID-mus. Anvendelse af RNA-Seq komplet transkriptom profilering af tumorigene fraktion af CR4 celler i sammenligning med de bulk-tumorceller, har vi identificeret omkring 360 differentielt udtrykte transkripter, hvoraf mange repræsenterer stemness, pluripotens og resistens over for behandling. Flertal af de etablerede CR4 celler udtrykker fælles markører for stemness, herunder CD133, CD44, CD166, EpCAM, CD24 og Lgr5. Brug af immuncytokemiske, FACS og western blot-analyser, har vi vist, at en betydelig andel af de CR4 celler udtrykker centrale markører for pluripotens markører, herunder Sox-2, Oct3 /4 og c-myc. Konstitutiv overaktivering af ABC transportører og NF-kB og fravær af tumorsuppressorer p53 og p21 kan delvist forklare exceptionel resistens af CR4 celler.

Konklusioner

Den meget tumorigen og klonogene CIC-beriget CR4 cellelinie kan give et vigtigt nyt redskab til at støtte opdagelsen af ​​nye diagnostiske og /eller prognostiske biomarkører samt udviklingen af ​​mere effektive terapeutiske strategier

Henvisning:. Rowehl RA, Burke S, Bialkowska AB, Pettet DW III, Rowehl L, Li E, et al. (2014) Etablering af stærkt Tumorgenetisk human Kolorektal Cancer Cell Line (CR4) med Egenskaber af formodede Cancer Stem Cells. PLoS ONE 9 (6): e99091. doi: 10,1371 /journal.pone.0099091

Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA

Modtaget: 10. januar, 2014 Accepteret: 10 maj 2014; Udgivet: 12 Jun 2014

Copyright: © 2014 Rowehl et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Fusion TRO tilskud (PI Dr. Botchkina, 1104347-5-37298), SBU Cancer center, og SBU vicepræsident for forskning (RSR 1111963-3-63845). Ifølge Fusion TRO forhold, Patologisk Institut, Institut for Kemisk Biologi Drug Discovery (ICB DD) og Simons Foundation har også delvist bidraget til denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft har den tredje højeste forekomst og dødelighed blandt den amerikanske befolkning [1]. Den nuværende mangel på helbredende kemoterapi og den højeste frafaldsprocent af anticancer narkotika i forhold til andre sygdomme (kun 5% af stoffer, der har anticancer aktivitet i præklinisk udvikling er licenseret [2]) skaber et presserende behov for mere fysiologisk og klinisk relevante kilder kræftceller, såvel som for mere relevant

in vitro

og

in vivo

modeller. Traditionelle cancer forskning og præklinisk evaluering af kandidat anticancermidler er baseret på anvendelsen af ​​fravalgt langsigtede, high-passage etablerede cancercellelinier dyrket som et monolag kulturer. Men langsigtet

in vitro

vedligeholdelse uundgåeligt fører til akkumulering af yderligere genomiske og epigenomic ændringer, samt udvælgelse af dominerende cellesubpopulationer. Det blev faktisk for nylig demonstreret, at de mest almindeligt anvendte etablerede cancercellelinier har ingen sammenhæng med originale kliniske prøver [3]. Dette antyder, at anvendelsen af ​​etablerede cellelinjer til studiet af genomiske ændringer, opdagelsen af ​​klinisk relevante molekylære mål, og udvikling anticancerlægemiddel er tvivlsom, eftersom anvendelsen af ​​disse cellelinjer ikke tager hensyn til kompleksiteten og patofysiologien af ​​

i vivo

tumorer.

det er i vid udstrækning accepteret nu, at humane tumorer er organiseret hierarkisk, og toppen af ​​dette hierarki er besat af maligne stamceller, som besidder ubegrænset selvfornyelse og tumor-initierende kapacitet. Ifølge den seneste begreb carcinogenese, som har revolutioneret forståelsen af ​​tumorigenese og kræftbehandling, kun specifikke fænotypiske delpopulation (r) for kræft stamceller (CICS) eller kræft-initierende celler (CICS) er ansvarlige for tumor udvikling, produktion af hele spektret af den differentierede afkom, der komponere en tumormasse, metastase, og modstand mod anticancerterapier [4] – [6]. Sådanne celler blev for nylig isoleret fra alle de store menneskelige typer cancer, herunder kolorektal kræft [7] – [9]. Talrige undersøgelser har vist, at specifikke fænotyper af stamceller-lignende tumorfremkaldende cancerceller er stærkt lægemiddelresistent og er i stand til selvfornyelse efter standard terapeutiske interventioner [10] – [17]. Alle de ovennævnte overvejelser understreger den afgørende rolle, CIC i opdagelsen af ​​klinisk relevante molekylære mål og udvikling anticancer narkotika.

identifikation og karakterisering af patient-afledte CIC, udvikling af optimale

in vivo

og

in vitro

prækliniske modeller, og CIC-målrettede analyser af lægemiddelinducerede ændringer repræsenterer kritiske trin i vurderingen af ​​nye anti-behandlinger mod kræft. Det er også tydeligt, at for at opretholde en passende fidelity til de oprindelige tumorer, kræft-initierende celler (CICS), samt andre celletyper, der anvendes til genomisk og proteom profilering, skal isoleres fra et stort spektrum af primære og metastatiske tumorer , ikke i de oprettede cancercellelinier. Det er imidlertid notorisk vanskeligt at etablere primære cellelinier og især CIC linjer fra friske tumorprøver [18]. Først, der er objektive vanskeligheder i isolation af rene cellepopulationer fra heterogene tumorvæv. Tumor urenhed (forskellige niveauer af forurening ikke-tumor-celle) og multiclonality er veldokumenterede problemer [19], [20]. På molekylært niveau, er der i øjeblikket ingen definitive markører til at bevise den maligne eller ikke-malign karakter af celler, samt til præcist skelne mellem normale og cancer stamceller. Voksende beviser antyder også, at CIC’er kan udgøre en heterogen underpopulation af tumor-initierende celler [21] – [25]. Ikke desto mindre kan en kombination af flere tilgange og multiple celleoverflademarkører efterfulgt af en grundig funktionel karakterisering af de isolerede cellefænotyper muliggøre oprensningen af ​​den mest funktionelt signifikant, dvs. tumor-og metastase-initierende og de mest resistente celler. Adskillige kolorektale cellelinier af forskellige cellulære, biokemiske og molekylære karakteristika er blevet etableret i løbet af de sidste to årtier [26] – [30]. Her rapporterer vi etableringen af ​​et nyt CIC-beriget, meget tumorigen kolorektal cancer cellelinje isoleret fra levermetastaser af en CRC patient.

Resultater

Patient prøver og primære kulturer

Dissocierede cellesuspensioner fra 13 frisk resektion kolorektale karcinomer af forskellige histologiske kvaliteter og 3 levermetastaser blev testet for klonogene og tumorigent potentiale

in vivo

in vitro

som beskrevet i afsnittet Metoder. To prøver blev stærkt forurenet med bakterier, og trods gentagne behandlinger med antibiotika, blev de primære kolonier også forurenet og derfor kasseres. To primære kulturer udviklet fra primære og metastatiske tumor prøver af patienter, der tidligere er behandlet med kemoterapi undergik dybtgående celledød efter 1-2 dage i kultur og viste ingen levedygtige celler i den næste uges observation. De andre ni prøver indeholdt en subpopulation af hurtigt adhærerende celler (FA) til type I collagen, som oprindeligt spredt i serumfrit stamcellemedium og induceret flydende sfæroider, som er karakteristiske for CIC samt løse multicellulære aggregater i 3D kulturer. Men 6 af 9 primære kulturer mistede deres klonogene og kugle-dannende kapacitet efter flere passager, hvilket er i overensstemmelse med mange observationer, som primære kræftceller har et endeligt (omkring 5-6 passager) levetid [31]. I modsætning hertil tumorceller isoleret fra den levermetastaser af den mandlige patient med stadie 4 tyktarmskræft fortsætte langsigtet

in vivo

in vitro

vækst (15 passager, i øjeblikket) og udgør en etableret, CIC-beriget coloncancercellelinie, CR4. Tre andre primære kulturer er i øjeblikket under udvikling ligner den CR4 cellelinie. Disse celler er i færd med funktionelle, genomisk, cellulær og molekylær karakterisering.

Cellulær og klonal heterogenitet CR4 tumorceller

Efter indledende isolering af den hurtige klæbende til type I collagen primære tumorceller og deres formering

in vitro

i MSCB eller SPC medier, flere forskellige typer af celler form og klon morfologi var tydelige: (i) tætpakkede lange spindel-lignende celler, der repræsenterer carcinom forbundet fibroblaster (CAF) og normale fibroblaster, som var dominerende cellefænotype kort efter isolation og under flere tidlige passager dyrkning (figur 1A); (Ii) sparsomme store aflange celler med dychotomized processer (figur 1b); (Iii) sjældne små kloner indeholdende små runde celler omkring 7-10 um i diameter med en meget tynd rand af cytoplasma og store aflange kerner (figur 1C, D); og blandt dem, (iv) sjældne, meget store (≥100-200 um), ofte flerkernede celler (MNC, figur 1E). Vi observerer ofte sådanne celler i både etablerede og primære tyktarms- og prostatakræft-cellelinier dyrket under stemness-fremmende betingelser. Disse flerkernede kæmpeceller var i stand til både langsom spredning, der producerer enten yderligere multinationale selskaber (figur 1F) eller store mononukleære celler.

(A) Oprindeligt dominerende befolkning i de tætpakkede aflange fibroblast-lignende celler. (B) sparser langstrakte tumorceller med processer. (C) Udseende af små klynger af meget små celler (ca. 7 um) støder op til fibroblastlignende celler. (D) Typisk holoclone induceret af små CR4 celler. (E) Giant flercellede celle i CR4 holoclone af små celler. (F) Koloni af flerkernede celler.

Vi har fortsat kultur af de blandede cellepopulationer under definerede stemness-fremmende betingelser forventer, at denne tilgang i lighed med vores tidligere fastsatte primære prostata CIC-beriget cellelinie, PPT2 [32] vil føre til udbredelsen af ​​de sjældne CIC. I tråd med vores observationer, blev det vist tidligere, at co-kultur af tyktarmskræft celler med carcinoma-associerede fibroblaster førte til anincrease i antallet af CIC via aktivering af β-catenin vej [33]. Endelig begrænset passage af primære celler i en stamcelle medium førte til udseendet af talrige sparsomme, små celleholdige, tætpakkede kloner med glatte kanter (holoclones) omgivet af langstrakte celler (figur 2A). Dette mønster er karakteristisk for embryonale, induceret pluripotente og andre stamceller celletyper co-dyrket med fibroblaster [32], [34]. Sucloning af sådanne holoclones førte til oprettelsen af ​​det rensede coloncancercellelinie, CR4, med alle de grundlæggende funktioner i CIC, herunder høj tumor-initierende, 3D kugleformet-og holoclone-dannende kapacitet og udtryk for pluripotens og stamcelle-relevant markører (beskrevet nedenfor). Sammen med de formodede glatte kanter holoclones kan CR4 celler inducerer paraclones med diffuse kanter (Figur 2C), som er karakteristiske for stamceller. Under de tidligere passager, næsten alle CR4 holoclones indeholdt ensartet pakket små celler fra centrum til periferien af ​​klon (figur 2B). Men senere passager havde meget højere forhold af de store flerkernede celler placeret overvejende ved periferien af ​​klonen, hvorimod små celler besatte den mere centrale del af klonen (figur 2 E, F). I ultralav passager i de CR4 celler holdes i aliquoter i flydende nitrogen; øjeblikket, denne linje er til passage 14. På den beskrevne karakterisering blev de frosne aliquoter opformeres enten som NOD /SCID-mus tumorxenoplantater, flydende 3D sfæroider eller type I collagen-adhærerende kulturer.

(A) Klon af små CR4-celler omgivet af lange fibroblastlignende celler med dychotomized processer. (B) Efter subkloning, små CR4-celler podet ved lav densitet i serumfrit SPCM på type I kollagen fremstillet typiske tætpakkede holoclones karakteristiske for stamceller af forskellig oprindelse. (C) Paraclone af aflange større celler støder op til små CR4 celler. (D) Lavt antal af de oprensede små celler produceres overvejende runde kanter holoclones og sjældne paraclones vedhængende at skrive I collagen med høj effektivitet. (E) Højere forstørrelse af de holoclone celler med store kerner og tynd rand af cytoplasma. (F) Store multinationale selskaber (≥200 um; hæmatoxylin og eosin farvning). Er ofte placeret i periferien af ​​holoclones

Funktionel karakterisering af CR4 celler

For at bekræfte stemness tilstand af CR4 cellelinien blev flere funktionelle assays udført herunder vurdering af tumorfremkaldende potentiale (evne til at danne subkutane tumorer i immundefekte NOD /SCID-mus), sfære-dannende evne (evne til at danne tætte flydende sfæroider i adhærerende 3D kulturer) og clonogenicity (evne til at danne klæbende til type i kollagen holoclones). Vi har konstateret, at CR4 celler besidder høj effektivitet i induktion af tumorer hos NOD /SCID-mus (Figur 3A) efter serielle subkutane transplantationer af det relativt lave celleantal. Således 1 × 10

3 CR4 celler eller 2-3 flydende sfæroider inducerede store tumorer i alle mus (6 mus pr hver gruppe). At etablere klonogene og sfære-dannende kapacitet i de CR4 celler blev et kendt antal celler podet på type I collagen-coatede eller ultralave adhærente plader hhv. Efter en uges inkubation blev induceret adhærente kloner eller flydende sfæroider talt, og klonogene blev beregnet som forholdet mellem antallet af podede celler sammenlignet med antallet af inducerede kolonier eller sfæroider. Især vi konstateret, at efter podning usorterede CR4 celler passage 13 i seriel fortynding (250, 100, 50 og 25 celler /brønd på 96-brønds plader) omkring en celle i 10 (10%) inducerede perfekte holoclones (figur 2B, D). Sphere-dannende effektivitet CD133-positive fraktion af CR4 celler i 3D kultur med 5% type I-kollagen i SPCM var højere sammenlignet med de CD133-udtømte cellepopulationer (8,4 ± 2,6 versus 3,7 ± 0,6 sfæroider per 100 sederede celler /brønd , henholdsvis). Både holoclones og sfæroider blev pakket med meget små celler, der udtrykker høje niveauer af fælles stemness markører, herunder EpCAM, CD133, CD44, CD166 og Lgr5 (beskrevet nedenfor). Selvom CD133 (klon 293C3), samt eventuelle andre almindelige markører, ikke er ideel til kolon CIC, ikke desto mindre det giver mulighed for yderligere berigelse af tumorfremkaldende og kugle-dannende fraktion af CR4 celler.

(A) Stor subkutan tumor induceret ved transplantation af CR4 celler (1 x 10

3) i NOD /SCID mus (passage 2). (B) Tætte flydende sfæroider induceret af seriepassage af CR4 celler i 3D kultur på de ultra-low-adhærente plader. (C) Tredimensionel sfæroide induceret på overfladen af ​​det klæbende CR4 holoclone. (D) dannelse af et stort 3D organoide på overfladen af ​​det klæbende CR4 holoclone. (E) Udseende af lange processer i kugleformede celler induceret af CR4 celler i 3D kultur indeholdende 15% af kollagengel, hvilket indikerer deres høje invasive potentiale [35]. (F) Lang dychotomized processer udviklet af vedhængende små CR4 celler. (G) Lange processer adhærente MNC’er.

Den aggressive natur og exceptionel sfære-dannende /klonogen kapacitet CR4 celler blev påvist ved deres evne til at producere flydende sfæroider ikke blot i ikke-adhærente kulturer (figur 3B), men også ved knopskydning af det klæbende til type i collagen holoclones og deraf følgende frigørelse af de dannede sfæroider (figur 3C). De CR4 holoclones var også i stand til at producere de store klæbende flerlagede organoids direkte over holoclone overflade (figur 3D). Flydende CR4 sphæroider opførte forskelligt i 3D dyrkningssystemer med og uden type I collagen geler i stamcelle medier (MSCBM eller SPCM). Således sfæroider dyrket med ingen eller lav procent af kollagengel (op til 5%) sædvanligvis have glatte kanter (figur 3B), hvorimod højere gelkoncentration (op til 10-15%) førte til fremkomsten af ​​flere processer, som dannede asterisk -lignende strukturer, der omgiver sfæroider (figur 3E). Sådan fænotype af flydende sfæroider blev for nylig forbundet med høj metastatisk kapacitet af det pågældende cancerceller [35], hvilket er i overensstemmelse med det faktum, at CR4 cellelinje blev etableret fra levermetastaser af coloncancer patienten. I lighed med 3D dyrkning blev den invasive karakter af CR4 celler afspejles af deres evne til at udvikle lange, store, dikotomiseret processer på den ydre kant af de adhærerende kloner (figur 3F). De store flerkernede celler i periferien af ​​de kloner, der er beskrevet ovenfor, såvel som enkelte gigantiske flerkernede celler, også ofte viste lange og dychotomized processer (figur 3G).

Fænotypisk profilering af CR4 celler

Som vi har nævnt ovenfor, subkloning af de små-celle-holdige holoclones førte til dramatiske berigelse af celler, der udtrykker høje niveauer af stemness og pluripotens markører (tabel 1; figur 4 og 5). Generelt stamceller fænotype

in vitro

er dynamisk på grund af den dobbelte karakter af CIC (dvs. deres evne til at forny sig selv og skabe engagerede stamfædre). Således tidlige og mellemliggende passager af primære CR4 celler havde ustabil fænotype udtrykker meget varierende niveauer af CD133, CD44 og EpCAM (tabel 1 og figur 4A). De NOD /SCID-mus tumorxenotransplantater induceret af disse celler udtrykte tilsvarende niveauer af alle undersøgte markører (figur 4B). I modsætning hertil oprensede CR4 celler bevarer forholdsvis stabil fænotype i 3D og klæbende til type I collagen kulturer. Således tre uafhængige FACS analyser i løbet af de sidste 7 måneder (passager 6-14) har vist, at stort set hele befolkningen i CR4 celler forbliver udifferentieret (kun 3-5% udtrykt markør af differentiering, pan-keratin), og størstedelen af ​​celler udtrykke høje niveauer af CD133 (62-82%), CD44 (65-99%), CD166 (97-98%), EpCAM (98-99%) og Lgr5 (80-83%; repræsentative FACS data er vist på figur 4C). Især omkring 65% af celler co-udtrykt høje niveauer af CD133 og CD44. Vigtigere, omkring 20% ​​af CR4 celler er positive for markør for metastatisk aktivitet, CXCR4.

(A) repræsentative FACS analyser af forskellige celleoverflademarkører ekspression i begyndelsen primær kultur af den hurtigt adhærerende CR4-celler dyrket på type i-kollagen i MSCB medium. (B) FACS-analyse af den første passage af FA tumorceller isoleret fra NOD /SCID-mus tumorxenoplantater induceret af tidlig passage CR4 celler. (C) Dramatisk stigning i ekspressionen af ​​de fælles markører for stemness, herunder CD133, CD44, CD166, Lgr5 og EpCAM i de sene-passage (p13) CR4 celler. Bemærk, at 19% af cellerne udtrykte også markør for CIC med metastatisk aktivitet, CXCR4, der blev identificeret i flere humane cancere.

(A) Nuclear lokalisering af centrale pluripotens markører, c-Myc, Sox- 2 og Oct3 /4. (B) co-lokalisering af nukleart c-Myc med høj membran ekspression af CD133. (A, B: Immuncytokemisk analyse af CR4 celler dyrket på type I collagen-coatede kamre objektglas). (C) Western blot analyse bekræfter udtryk for c-myc og Oct-3/4 i nukleare fraktioner af CR4 celler. I modsætning hertil er de negative for p53 og p21. Nuklear fraktion gav også udtryk for højere niveauer af phosphorilated p65 (som indikerer konstitutiv aktivering af NF-kB), mens unphosphorilated p65 lå overvejende en cytoplasma. (D, E) Repræsentant FACS analyser viser højere udtryk for Sox-2 og c-myc i CD133-positive celler i forhold til usorterede celler. (F) Immunohistokemisk analyse viser høj nuklear ekspression af Sox-2 i CR4-inducerede NOD /SCID-mus tumor xenograft. (G) Negativ kontrol (vævssnit uden inkubation med primære anti-Sox-2 Abs).

Brug immuncytokemiske, FACS og western blot-analyser, har vi vist, at en betydelig andel af den CR4 celler udtrykker flere vigtige markører for pluripotens, herunder Sox-2, Oct3 /4 og c-myc. Kernelokalisering af disse markører er vist med ICC (figur 5A, B) blev bekræftet ved Western blotting (C), som har vist deres ekspression i den fraktion kerneprotein og deres fravær i den cytoplasmatiske en. Vi har fundet, at CD133

+ fraktion af CR4 celler udtrykker højere andele af adskillige markører for pluripotens sammenlignet med de usorterede CR4 celler. Således har FACS-analyse vist, at mere end en fjerdedel af CD133

+ population udtrykt Sox-2 og 10% af befolkningen var positive for c-Myc (figur 5D). I modsætning hertil usorterede CR4-celler og CD133-negative fraktion udtrykt lavere niveauer af disse pluripotens markører (6 og 4%, og 1,4 og 0,8%, henholdsvis, figur 5E, negativ fraktion er ikke vist). Colokalisering analyse har vist, at kun celler med det højeste udtryk for CD133 har normalt nukleare farvning for de pluripotancy markører (figur 5B, kun c-myc er vist). Høj andel af Sox-2positive celler og dets nukleare lokalisering blev også bekræftet ved IHC af NOD /SCID-mus tumorxenoplantater (figur 5F). [Af note, brug af anti-Oct3 /4 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) for FACS-analyse forudsat mistænkeligt høje forhold mellem positive celler (mere end 90%), og disse data blev ikke inkluderet.] Vigtigere er det, CR4 celler, i lighed med prostata PPT2 CIC-beriget cellelinje [32], ikke udtrykte de to store regulatorer af apoptose og tumorsuppressorgener, p53 og p21 (figur 5C). Derudover nukleare fraktion af CR4 celler dyrket på type I collagen i stamcellemedium som separate holoclones udtrykkes kraftigt phosphoryleret p65, hvilket betyder, at NFkB er konstitutivt overudtrykt i kolorektale CIC. I modsætning hertil var phosphoryleret p65 placeret overvejende cytoplasmatiske fraktion. Alle af ovenstående kan delvis forklare de høje tumorgene og klonogene kapacitet og exceptionel lægemiddelresistens af denne CIC-beriget cellelinie. Især CR4-celler er meget tolerante over for behandling med almindeligt anvendte cytotoksiske lægemidler, såsom paclitaxel eller Taxol (figur 6). Således, efter 72 timers behandling i koncentrationsområde fra 10 nM op til 10 uM (MTT-assay), har CR4-celler vist ringe eller ingen cytotoksicitet; desuden de ofte øget deres proliferation som respons til lavere doser af paclitaxel. Vi har fundet, at adskillige medlemmer af den nye generation taxoider, herunder SBT-1214, SBT-121.602 og SBT-12834 er mere effektive mod CR4 tumorfremkaldende celler. IC50-dødeligheden blev nået ved ≥10 uM af alt narkotika koncentration. Af note, kan den lovende effekt af lave koncentrationer af nye generation taxoider forbedres yderligere ved deres kombination med syntetisk derivat af curcumin, CMC2.24 (upublicerede data), der er overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse [32].

Almindeligt anvendte Paclitaxel (Taxol) i doser lavere end 10 uM ikke effektiv mod CR4-celler og ofte øger deres proliferation. I modsætning hertil adskillige nye generation taxoider inducerer dosisafhængig inhibering af proliferation af disse potente tumorfremkaldende celler. (MTT-assay efter lægemiddelbehandling i 48 timer). De opnåede

p

værdier for alle lægemidler og alle narkotika koncentrationer var meget mindre, at 0,05. Den største

s

værdi blev opnået for SBT-1214 ved 10 nM koncentration (

s

= 0,0131); især ved 10 uM koncentration af SBT-1214

s

= 0,00032.

histopatologisk og IHC analyser af NOD /SCID-mus tumorxenoplantater

Som vi nævnt ovenfor, subkutan transplantation af et relativt lavt antal CR4 celler (1 x 10

3 af de dissocierede CR4 celler eller 2-3 flydende sfæroider) inducerede store vaskulariserede tumorer i alle injicerede NOD /SCID-mus (figur 3A og 7A) . De hematoxylin–og eosin-farvede vævssnit af mus tumorxenografter viste klassiske histologiske træk ved human metastatisk tyktarmskræft (figur 7B, C). Stærkt atypiske epitelceller dannet villus-lignende strukturer med prominente aflange kerner og, i overensstemmelse med dårligt differentieret adenocarcinom, talrige atypiske mitotiske figurer. Central nekrose var sædvanligvis til stede. Talrige store flerkernede celler var tydelige ved højere forstørrelse (figur 7C, pile). Immunohistokemisk analyse afslørede, at hele tumoren område (men ikke tumor stroma) udtrykte høje niveauer af membran-lokaliserede EpCAM (figur 7D, E). Lignende mønstre og niveauer af ekspression var karakteristisk for CD166 (F). I modsætning hertil immunfarvning med polyklonale CD44 (klon F10-44-2; Invitrogen /Biosources, USA) afslørede tre forskellige mønstre af ekspression i forskellige områder af den samme tumor, dvs. klart membran (figur 7G) samt cytoplasmatisk og tydeligt nukleart i andre dele (figur 7H). Høj cytolasmic udtryk for den fælles markør for kolon stamceller og CIC, Lgr5, var tydelig i visse tumor dele (Figur 7J), mens det i andre dele, det var enten moderat eller svagt udtrykt (K), eller endda fraværende. Store områder af tumorxenoplantater udtrykte stærk nuklear farvning for pluripotens markør Sox-2 (figur 7L).

(A) Stor tumor induceret ved transplantation af 1 × 10

3 CR4 celler. (B) Hematoxylin og eosin-farvede vævssnit viser klassiske histologiske træk ved human metastatisk tyktarmskræft. (C) stor forstørring af regionen vist i (B); pile viser gigantiske flerkernede celler i den papillære strukturer. (D, E) Kraftig celleoverfladeekspression af epitel markering, EpCAM. (F) Kraftig celleoverfladeekspression af CD166. (G) Cytoplasmisk ekspression af CD44. (H) Mikroskopisk fokus med stærke kernekraft og svagere cytoplasmatisk udtryk for CD44. (I) Negativ kontrol (primær Abs blev udeladt). (J, K) Stærk og moderat ekspression, henholdsvis i tyktarmen stamcellemarkør, Lgr5 /GPR49. (L) Stærk nukleare udtryk for pluripotens markør, Sox-2 i store områder af tumoren.

RNA-Seq komplet transkriptom profilering af CR4 lille versus bulk-tumorceller

Brug RNA-Seq udførte vi en funktionel genomisk analyse i tumorfremkaldende fraktioner af CR4 (små) celler dyrkes adhærerende til type i-kollagen versus dyrket som 3D sfæroider, i sammenligning med de bulk-tumorceller (lange og dychotomized celler dyrket under standard dyrkningsbetingelser ). Ved hjælp af en HiSeq 2000 vi sekventeret mellem 40 og 50 millioner læser pr biologisk prøve, som tidligere beskrevet [35], [36], [37]. Kort fortalt blev biblioteker for NGS lavet af 100 nanogram af total RNA. Den RNA-prøver kvalitet blev vurderet med en Agilent Bioanalyzer. Alle RNA-prøver havde en RIN over 8. Sequencing biblioteker blev oprettet ved hjælp af Illumina TruSeq Strandede mRNA LT kit ifølge producentens anbefalinger. Kvaliteten af ​​hvert bibliotek blev evalueret med Agilent Bioanalyzer høj følsomhed assay og kvantificeres ved qPCR (Kappa Biosystem, CT). Bibliotekerne blev samlet sammen ved 10 nM baseret på qPCR resultater, og derefter puljen blev kvantificeret igen ved qPCR. Den poolede bibliotek blev sekventeret i en bane i en HiSeq2000 parret ende 100bp flowcelle. Dette tillod os at opdage hvilke udskrifter udtrykkes forskelligt blandt disse typer af CR4 celler, således at opbygge et samlet billede af de aktiverede eller undertrykt signalveje. Vi har fundet, at små CR4 celler dyrket enten som separate holoclones adhærente til type I-kollagen eller som 3D flydende sfæroider besidder et stort antal differentielt udtrykte gener i sammenligning med de bulk-tumorceller dyrket under standard dyrkningsbetingelser. Således i vedhængende lille CR4-celler og 3D sfæroider, 357 og 365 gener fik henholdsvis overudtrykt sammenlignet med CR4 lange (bulk) tumorceller. Blandt disse gener, blev 287 almindeligt opreguleres, hvilket betyder, at begge dyrkningsbetingelser tillader vedligeholdelse af CR4 små celler ved stemness tilstand. Især både små klæbende og 3D sphæroider udtryk op til flere størrelsesordener af opregulering i følgende: (i) flere fælles markører for stemness, herunder CD44, CD24, EpCAM, ESA, Lgr5, ALDH1A1 og andre; (Ii) vækstfaktorer, herunder epidermal (EGF), fibroblast (FGF) og transformerende vækstfaktor-beta (TGFp) familiemedlemmer; (Iii) transkriptionsfaktorer (TFS), herunder multipel homeobox (CDX1, CDX2, CEACAM6, MSX2) og pluripotens TF’er (POU5F1B, Oct4, Sox-2, Sox-9, (iv) inflammatoriske cytokiner og deres receptorer, herunder IL18, IL20 , IL2RG, IL20RA og andre, (v) ABC transportører, (vi) gener, der er ansvarlige for overførsel af høj energi fosfat fra mitokondrierne (CKMT1 og CKMT1B) og medlemmerne af cytochrom P450 familie, herunder CYP2B6, CYP2J2, CYP2S1 og andre af interesse. , tumor-initierende fraktion af CR4 celler overudtrykkes multiple gener, der kontrollerer celle-til-celle-adhæsion, herunder cadheriner (CDH 1, 3 og 17, og CDHR5); intergins (ITGB4); gener kodende stram-junction proteiner (CLDN3, 4 og 6, COL17A1 og andre),. og keratiner (KRT19, 20, 23 og KRTAP3-1) Dette fund understøtter vores traditionelt anvendes tilgang til indledende berigelse af prostata og kolon tumor-initierende celler baseret på deres evne til at holde sig til type i collagen overflader inden for 15-20 minutters inkubation. de opnåede rå RNA-Seq data blev indsendt til National center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO), en offentlig funktionelle genomics datalager (ID-nummeret er <