PLoS ONE: Genome Wide Screening af Gener Reguleret af DNA Methylering i Colon Cancer Development

Abstrakt

tumorigenese er ledsaget af ændringer i DNA-methylering mønster. Vores mål var at teste en ny tilgang til identifikation af transkripter på hele transkript niveau, som reguleres af DNA-methylering. Vores tilgang er baseret på sammenligning af data fra transkriptom profilering af primære humane prøver og in vitro cellekultur modeller. Epitelceller blev opsamlet ved LCM fra normal, adenom, og tumorform colon prøver. Brug af genekspression analyse identificerede vi nedreguleret gener i tumorerne sammenlignet med normale væv. Parallelt 3000 blev opregulerede gener bestemt i HT-29 colon-adenocarcinom cellekulturmodel efter DNA-demethylering behandling. Af de 2533 transkripter viser reduceret ekspression i de tumorform prøver, 154 havde forøget ekspression som følge af DNA demethylering behandling. Ca. 2/3 af disse gener havde reduceret ekspression allerede i adenom prøver. Angivelse af fem gener (

GCG

,

NMES-1

,

LRMP

,

FAM161B

og

PTGDR

) blev valideret anvendelse af RT-PCR.

PTGDR

viste tvetydige resultater, derfor blev det yderligere undersøgt for at kontrollere omfanget af DNA methylering og dens effekt på protein niveau. Resultaterne bekræftede, at vores fremgangsmåde er egnet til genom-dækkende screening af gener, der reguleres eller inaktiveres af DNA-methylering. Aktivitet af disse gener muligvis forstyrrer tumorprogression, derfor identificerede gener kan være nøglefaktorer i dannelse og i udviklingen af ​​sygdommen

Henvisning:. Spisak S, Kalmar A, Galamb O, Wichmann B, Sipos F , Péterfia B, et al. (2012) Genom-Bred Screening af Gener Reguleret af DNA Methylering i Colon Cancer Development. PLoS ONE 7 (10): e46215. doi: 10,1371 /journal.pone.0046215

Redaktør: Carmen J. Marsit, Dartmouth Medical School, USA

Modtaget: April 18, 2012; Accepteret: August 28, 2012; Udgivet: Oktober 1, 2012 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af det nationale kontor for forskning og teknologi, Ungarn (TECH_08-A1 /2-2008- 0114 tilskud), ved den ungarske National Innovation Office, og af dansk Grundforskningsfond. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ændringer i genekspression, herunder aktivering af onkogener og inaktivering af tumorsuppressorer, er ansvarlige for dannelsen og udviklingen af ​​colorectal cancer (CRC) [1], [2]. Udover de akkumulerende ændringer i DNA-sekvensen, kan det dysfunktion af epigenetisk regulering systemet også føre til afvigende dannelse af tyktarmen epitel langs fremadskridende proces af carcinogenese [3], [4]. Det er dog ikke klart, hvilke molekylære begivenheder påvirker individuelle gen aktiviteter, og om det er en direkte eller en indirekte effekt [5], [6], [7].

En af de epigenetiske processer påvirker genekspression er DNA-methylering, en post-replikativt DNA modifikation, forekommer overvejende i genomet områder med stor CG dinucleotider, såkaldte CpG-øer [8]. Modifikation af baser ved tilsætning af en methylgruppe fysisk kan inhibere binding af transkriptionsfaktorer, og tillader også rekruttering af methyl-CpG-bindende domæne proteiner (f.eks .: MDB1-3, MeCP2) til promotorområder, som kan undertrykke transkription initiering [ ,,,0],9]. Afvigende ændringer af vævsspecifik methyleringsmønster den ofte manifesteret på to måder: (i) global hypometylering, som forekommer i hele genomet med aldring, og (ii) lokal hypermethyleringsassocierede af 5 ‘regulatoriske regioner i tumorigenese, som normalt fører til nedsat eller ophørt transskriptionel aktivitet af de berørte gener [10], [11], [12]. Hypermethylering medierede ændringer i genregulering spiller en central rolle under udviklingen af ​​flere tumortyper, herunder colorectal cancer, og også viser et tumor-specifikt mønster [13].

Det er velkendt, at DNA-methylering påvirker genaktiviteter uden at ændre DNA-sekvensen selv, og kan altid nulstilles ved demethylering midler, der virker ved at hæmme DNA-methylering, såsom 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza). Det giver en teoretisk mulighed for at decelerere eller standse tumor udvikling i tilfælde af tidlig påvisning. Men for bedre forståelse af de DNA-methylering processer, og for muligheden for at anvende kolorektal cancer-specifik methylering biomarkører til screening patienter, eller endog at opnå gen-målrettede demethylering i fremtiden, de berørte gener skal identificeres,. Selvom flere methylering-regulerede gener er blevet rapporteret at være forbundet med cancer (herunder tyktarmskræft) udvikling, stadig en detaljeret proces uklar [14], [15], [16], [17], [18], [19] .

Selv om mange strategier er tilgængelige til vurdering DNA methylering på hele genomet niveau, herunder sekventering [20], [21] og array [22], [23], disse tilgange kan kun i tilfælde af være tilstrækkeligt væv eller cellekulturer hvorfra relativt stor mængde udgangsmateriale (genomisk DNA) kan opnås, som forskellige celletyper har distinkte mønstre for methylering [24], [25], [26]. Laser capture microdissection (LCM) kan tjene som en passende celle adskillende metode [27]. Men den begrænsede mængde af de indsamles eksemplar resulterer i en udfordrende ulempe i tilfælde af methylering undersøgelser, fordi de i øjeblikket tilgængelige in vitro amplifikationsteknikker kan ikke bevare methylering mønster. I modsætning hertil kan genekspression analyseres rutinemæssigt på laser mikrodissekeres celler, som kan kombineres med microarray analyse til at indsamle oplysninger selv fra en enkelt celle ved hele genomet niveau.

I denne afhandling præsenterer vi en genekspression baseret fremgangsmåde, som er egnet til effektiv, high-throughput, genom-dækkende screening for methylering-regulerede gener, hvis reducerede ekspression kan være relateret til cancer progression. Potentialet ved denne metode er tidligere demonstreret ved at identificere 17 udskrifter, der blev nedreguleret i kolorektal cancer progression, og viste øget aktivitet i HT-29 kolorektal cancer celler efter 5-Aza behandling [28]. Forlængelse af tidligere undersøgelse, her rapporterer vi 154 gener, der sandsynligvis inhiberes ved methylering under progression af colorektal cancer. Pålideligheden af ​​metoden understøttes af en bred vifte af eksperimentel og

i silico

metoder, der præsenteres i dette dokument. Ekspression af flere transkripter blev valideret ved RT-PCR. Vi har vist, at forholdet mellem genekspression og status for methylering i tilfælde af

PTGDR

gen ved RT-PCR-analyse, immunhistokemi, bisulfit sekventering, og HRM analyse. I PCA analyser normal, adenom, og CRC prøver kan med held adskilt baseret på ekspressionsmønstre for disse 154 udskrifter, både i vores eget prøvesæt og uafhængige prøvesæt opnået fra GEO-databasen.

Resultater

mikroopstillingerne LCM vævsprøver og HT-29-celler

Hypermethylering af flere genomiske regioner, der tidligere blev vist at være associeret med oncogen transformation. Fordi methylering af CpG øen (r) i et gens promotorregion kan reducere transkription af genet, vi søgte efter gener med aftagende ekspression i humane colon tumorprøver sammenlignet med normale colon-epitelvæv. Expression ændringer i tumorprøver kan skyldes forskellige molekylære begivenheder, herunder de direkte og indirekte virkninger af mutationer [29], [30], [31]. ændringer i ekspressionsmønsteret observeret i en demethylerede cellekultur model kan imidlertid forudsige, hvilke gener reguleres af DNA-methylering (figur 1). Genekspression i vævsprøver blev undersøgt ved HGU133 Plus2.0 mikroarrays, og de opnåede data blev analyseret af SAM (Betydning Analyse af microarrays) algoritmen. Omkring 2000 udskrifter, der hører til ca. 2500 probe sæt, blev identificeret som havde reduceret til udtryk i de tumor prøver (tabel S1).

Gener, der er inaktiveret ved hypermethylering kan reaktiveres ved fjernelse af methyl grupper fra CpG øer deres promotorområder, som kan opnås ved at dyrke cellerne i nærvær af DNA-methyltransferase inhibitor 5-aza-2′-deoxycytidin. Genekspressionsniveauer i 5-Aza-behandlede og ikke-behandlede HT-29 colon-adenocarcinom celler blev sammenlignet. Fordi 5-Aza behandling forårsager dosisafhængig inhibering af celleproliferation [32], [33], [34], MTT-assays blev anvendt til at optimere koncentrationen behandling. Baseret på resultaterne 10 pM 5-aza blev påført i demethylering behandling af HT-29-celler. Fordi 5-Aza behandling ikke kan genaktivere gener fuldstændigt, vi betragtede de øverste 3000 probesæt har den højeste log

2fc -værdier på signifikansniveau på p 0,025 til potentielt opreguleret. Blandt de omkring 2000 transkripter, der viste reduceret transkription i colontumorer, blev 154 gener fundet som viste forøget ekspression i de 5-aza-behandlede HT-29-celler ved anvendelse af ovennævnte kriterier. Baseret på microarray analyse er disse kandidatgener, der sandsynligvis stumme i kolorektale tumorer ved DNA hypermethylering enten direkte eller indirekte (tabel S2). Interessant, 108 af de 154 udskrifter havde signifikant reduceret niveauer allerede i adenom prøver (figur S1) (tabel S3). Promotorregion forudsigelse blev udført under anvendelse af EMBOSS CpG Plot værktøjer. Baseret på forudsigelsesresultater og analyser af uafhængig offentlig microarray data blev 6 transkripter udvalgt til yderligere analyse. Disse udskrifter tilhører den

GCG

(glucagon),

NMES-1 Hotel (normal slimhinde af spiserøret-specifik 1, også kaldet

C15orf48

),

LRMP

(lymfoide-begrænset membranprotein),

FAM161B

(familie med sekvens lighed 161, medlem B), og

PTGDR

(prostaglandin D2 receptor) gener, som også viste forskellen udtryk i vores tidligere pilotundersøgelse [35], men har ikke været forbundet med CRC før, og til

CDKN2B

, en kendt tumorsuppressorgen. Figur 2 repræsenterer udtrykket mønstre af dette sæt af 6 gener på vores LCM datasæt. Den Heatmap viser relativt høj ekspression af genet sat i normale væv, som falder under carcinogenese.

Ekspression af tumorsuppressorgen

CDKN2B

er vist til sammenligning. Probe sæt identifikationskoder og gen-navne er angivet til højre. De seks søjler indikerer microarray resultater fra seks individuelle prøver for hver type væv. Sorte firkanter indikerer, at genekspression var uændret i det eksperiment. Graden af ​​intensiteten af ​​rød eller grøn angiver niveauet af genekspression høj eller lav, henholdsvis.

RT-PCR Validation Assays Salg

I microarray analyserer transkription af alle disse gener blev inhiberet i tumorprøverne men viste forskellige grader af heterogenitet i adenom prøver (figur 2). Endvidere blev disse gener reaktiveres i forskelligt omfang som følge af 5-aza behandling i HT-29-celler. I microarray analyse GCG viste NMES-1, og LRMP udskrifter stærke reaktioner ( 2,5-dobling), mens FAM161B og PTGDR mRNA viste svagere reaktioner ( 1,5 gange stigning). Ekspression af

CDKN2B

, som en velkendt methylering reguleret tumorsuppressorgen, blev valideret af RT-PCR før [36]. Desuden udtryk for fem udvalgte gener,

GCG

,

NMES-1

,

LRMP

,

FAM161B

, og

PTGDR

blev også testet på uafhængige laser mikrodissekeres colon og også på demethylerede HT-29-celler ved real-time PCR. De anvendte PCR-primersekvenser er angivet i tabel S4.

5-Aza behandlet HT-29-celler.

For at undersøge virkningen af ​​demethylering blev HT-29-celler behandlet med 10 pM 5- aza og ekspressionsniveauet af det udvalgte gen gruppe blev undersøgt i sammenligning med de acetat-behandlede (opløsningsmiddel til 5-aza) kontrolprøver (figur 3). Efter demethylering,

GCG

,

NMES-1

, og

LRMP

gener viste stigende udtryk, mens transskription af

FAM161B

gen ikke ændre sig væsentligt . Lignende resultater blev opnået med en 20 pM 5-aza behandling (data ikke vist).

Dataanalyse blev udført med den sammenlignende Cp metode (se Materialer og fremgangsmåder). Gener blev anset for at være nedreguleret med værdier under 0,5 (50% fald, vandret stiplet linje), og opreguleret med værdier højere end 2 (fordobling). GAPDH blev anvendt som en kontrol housekeeping-gen. Lysegrå og mørkegrå søjler viser genekspressionsniveauer i adenom og i tumorprøver forhold til normale prøver, henholdsvis. Skraverede søjler angiver sammenligningen af ​​5-aza behandlede og kontrolceller. Standard afvigelserne af de målte transkriptniveauer blev beregnet og er angivet for hver udskrift. Rengøring gen intensiteter blev midlet for hver gruppe.

prøver LCM væv.

RT-PCR-resultater blev sammenlignet i den normale colon mucosa-adenom og normale kolon mucosa-tumor relationer i individuelle vævsprøver. Disse fem normal epitel, fem adenom og fire tumorprøver var uafhængige af dem, der bruges i microarray analyse. Resultaterne viste god overensstemmelse med microarray analyse,

GCG

,

NMES-1

, og

FAM161B

gener blev nedreguleret i både adenom og tumor prøver, mens

LRMP

viste reduceret ekspression kun i tumorprøver (figur 3).

PTGDR

ekspression viste tvetydige resultater i RT-PCR-forsøg. Det ikke viser en stærk reaktion til 10 pM 5-aza behandling, men havde omkring 1,7 gange forøget ekspression, når celler blev behandlet med 20 pM 5-aza. Samtidig udviste PTGDR RNA-niveauer heterogenitet i vævsprøver (figur 4A), derfor har vi udført yderligere analyser for at afsløre baggrunden af ​​disse observationer. Ekspressionssystemer værdier for 215894_at PTGDR probesæt blev testet på uafhængige GEO sæt (figur 4 B, C). I disse uafhængige prøvesæt, nedsat PTGDR mRNA niveauer blev fundet allerede i adenom prøver, hvilket yderligere faldet i CRC prøver.

Real-time PCR og dataanalyse blev udført som beskrevet i Materialer og metoder. Gener blev anset for at være nedreguleret med værdier under 0,5 (50% fald, vandret stiplet linje) (A) Ekspression værdi fordelingen af ​​215894_at probeset (for

PTGDR

genet) i GSE8671 (B) og GSE18105 ( C) GEO datasæt. P-værdier: Normal vs Adenom P = 0.000712; CRC vs. Normal P = 0.0003797; LCM CRC vs. Normal P = 0.0000004; LCM CRC vs. CRC P = 0,834.

Bisulfite-specifik PCR og HRM (High Resolution Melting) Analyse

For at verificere, at de lovgivningsmæssige område af

PTGDR

er faktisk hypermethyleret, udførte vi bisulfit-specifik PCR og høj opløsning smeltende analyse på genomisk DNA [37]. Den standardfortyndingsrækker blev anvendt til at teste følsomheden af ​​vore HRM assays. Ifølge de normaliserede smeltekurver, vores assay var i stand til at påvise 2% methyleret DNA i 98% methyleret baggrund. Den methylering procent af vævsprøver blev anslået i henhold til deres normaliserede smeltekurver i forhold til den standardfortyndingsrækker. Alle normale kolon mucosa prøver normaliseret smeltende kurve faldt mellem områderne afgrænset af de 0% -2% standard prøver. I tilfælde af tumorprøverne, 1 prøve var i -2% methylering interval på 0%, 2 mellem 2-25% og to prøver viste methylering forhold højere end 25% (figur 5). Analyse af den valgte

PTGDR

region fra HT29-cellelinien viste næsten 100% methylering. For validering, blev bisulfit sekventering udført for at bestemme status methylering af denne region. (Fig S2.)

punkterede linier repræsenterer den standardfortyndingsrækker fra kunstigt methyleret DNA (0%, 25%, 50%, 75% og 100%). Det faste sorte linie repræsenterer resultater opnået fra en normal prøve. Solid grå linjer repræsenterer resultater opnået fra 5 uafhængige tumorform vævsprøver. HRM analyse kan skelne methylering af normale og tumorform væv baseret på de forskellige G: C-indhold i den bisulfit omdannet promotorsekvens. Promotorregioner indeholdende mere methylerede cytosiner, som ikke kan omdannes til uracil ved bisulfitbehandling, har højere smeltetemperaturer. Smeltetemperaturen er proportional med forholdet mellem ikke-konverterede cytosiner.

Tissue Microarray Analysis, PTGDR Immunhistokemi

prostaglandin D2-receptoren blev yderligere undersøgt ved immunhistokemi under anvendelse af TMA glider til at bestemme virkning af DNA-methylering på proteinniveauet. Normale kolon mucosa prøver udviste stærk epitel cytoplasmatisk immunfarvning, hvilket successivt faldt i adenom stadium nær den luminale overflade. Den immunfarvning intensitet blev yderligere reduceret i løbet af progression og kun moderat udtryk kunne iagttages i tumor prøver (figur 6 venstre panel). Men i nogle adenom og tumorform prøver proteinekspressionen blev fundet at svare til, hvad der blev påvist i normalt epitel (figur S3). En tendentiøse PTGDR proteinekspression fald blev observeret i adenom-carcinom sekvens progression (figur 6 højre panel).

I de normale prøver (øverst), blev påvist overvejende stærk, diffus cytoplasmatisk farvning, som moderat faldt i adenom prøver (i midten), og kun svag cytoplasmatisk farvning blev observeret i de kolorektale cancer prøver (nederst). Højre panel viser foreningen plots, som repræsenterer tendentiøst faldende PTGDR proteinekspression langs adenom karcinom sekvensen. For at måle sammenslutning af to variabler (udtryk og sygdom etape) blev Chi-square test anvendes. Højden (og farvedybde) af boksene er proportional med forskellen mellem de observerede og forventede hyppighed af scores. De nedadgående røde farvede felter indikerer, at den observerede frekvens er lavere end forventet. De opadgående, blå elementer repræsenterer det modsatte. PTGDR Immunofarvning scores:

–

2 = ingen farvning; 0 = svag farvning; 1 = moderat farvning; 2 = stærk diffus epitelial cytoplasmatisk immunfarvning.

Test af Methylering regulerede gener på Uafhængige Sample /udtryk sæt ved PCA

For at teste den diskriminerende magt 154 udvalgte gener, som sandsynligvis reguleret af methylering under carcinogenese, har vi testet dem på to uafhængige prøvesæt fra Gene Expression Omnibus (GEO) offentlig microarray arkiv. En af prøvesæt, GSE8671 [38], indeholder normalt og adenom, og det andet, GSE18105 [39], normale og tumorprøver. Sidstnævnte prøve sæt er specielt velegnet til validering, da det indeholder både homogeniseret og LCM tumorprøver. Aktiviteter for alle de 154 gener i vores liste blev sammenlignet ved hjælp af en standard reduktion dimension metode, principal komponent analyse (PCA) [40], som forvandler den multivariate log

2-udtryk data i 2 dimensioner. PCA vælger retninger med den største varians derefter roterer og projekter dataene ind i dette rum. Vi beregnede transformation matrix ved hjælp af vores 6 normal og 6 LCM CRC prøver (adenom prøver blev ikke anvendt under beregningen af ​​omdannelsesprocessen matrix) og bruges resulterede transformation matrix til projekt alle prøverne ind i rummet udspændt af de første 2 hovedkomponenter . De første to komponenter indeholder 81% af den kumulative samlede varians; derfor kan man forvente, at de korrekt billede af den multivariate distribution. Figur 7A viser, at de normale og LCM CRC prøver er tydeligt adskilt, og når adenom prøverne projiceret ind i PCA rum, de er placeret i mellem de normale og CRC prøver, støtter hypotesen om, at adenom er en overgangsfase mellem den normale og CRC faser [2], [41]. Lignende resultater blev opnået under anvendelse af kun de seks gener er anført i figur 2 (data ikke vist). Den diskriminerende effekt af de udvalgte 154 gener blev yderligere valideret ved hjælp tidligere offentliggjorte datasæt. PCA fremskrivning, som blev beregnet ved hjælp udelukkende vores LCM CRC og normale prøver kunne også helt adskille normale og adenom undergrupper af den GSE8671 undersøgelsen (se figur 7C). For det andet GEO datasæt, GSE18105, adskillelsen er næsten perfekt til både den homogeniserede CRC og LCM CRC prøver, kun ét punkt, markeret med en pil i figur 7B er kategoriseret. For at finde årsagen til misklassifikation euklidiske afstand analyse blev udført, hvor netop denne prøve blev vist sig at være en outlier (Supplerende figur S4).

De vigtigste komponenter blev beregnet ud fra loggen

2-ekspression værdier de 154 udvalgte probe sæt til de normale-CRC prøver i vores LCM sæt, og derefter alle 3 sæt blev projiceret ind hovedbestanddelen koordinere plads. Bemærk, at der kan betragtes denne metode som en uovervåget klassifikation, da vi ikke brugte udtrykkeligt kategorierne i dataanalyse processen. Figur 7.A viser, at pc-transformation adskiller meget godt de normale og LCM CRC prøver og placerer adenom prøver mellem normale og CRC prøver. For at validere vores liste over potentielle markørgener, forvandlede vi data fra to andre uafhængige undersøgelser af samme pc koordinater. De to undersøgelser fra Gene Expression Omnibus microarray arkiv var GSE18105 med normale, CRC og LCM CRC prøver og GSE8671 med normale og adenom prøver. For både sætter adskillelse af kategorierne er godt bortset fra en outlier punkt i B markeret med en pil (se diskussionen i tekst).

Diskussion

I denne undersøgelse præsenterer vi en hidtil ukendte high-throughput screening til udvælgelse af et gen gruppe, hvis ændret genekspression på grund af det uregelmæssige DNA methylering mønster kan relateres til kræft. Aktivitet af disse gener kan hæmme udviklingen af ​​kræft, derfor deres identifikation kunne forbedre bestemmelsen af ​​prognosen.

I et tidligere arbejde, vi har udviklet en eksperimentel system til identifikation af methylering regulerede gener baseret på undersøgelsen af ​​genekspressionsniveauer i kliniske LCM prøver og i 5-aza behandlet HT-29-celler. 110 transkripter viste reduceret ekspression i tumorudvikling og 71 opreguleres transkripter blev identificeret og et resultat af den 5-aza behandling. 17 udskrifter tilhørte begge grupper, og disse udskrifter antages at være reguleret af DNA methylering [28].

I det nuværende arbejde et meget bredere analyse strategi blev brugt, hvilket resulterer i identifikation af 2533 nedreguleret udskrifter under tumor udvikling og 3000 opreguleret transkripter som følge af 5-aza behandling af HT-29-celler (figur 1). Methylering relaterede 154 transkripter var til stede i begge grupper, dvs. havde reduceret ekspression i tumorer sammenlignet med normale colon mucosa-celler og viste forøget aktivitet efter demethylering behandling af HT-29 coloncancer-celler. Derfor er disse transkripter sandsynligvis inhiberes ved methylering, direkte eller indirekte under progression af colorektal cancer. Gyldigheden af ​​denne liste er understøttet af (i) tilstedeværelsen af ​​mange gener, der tidligere blev anset for at være nedreguleret i kolorektal cancer (f.eks

CHGA

,

FCGBP

,

GSN

,

LPP

,

MYH11

,

PLCG2

,

SST

,

NBL1

) [42], [43], (ii) tilstedeværelsen af ​​flere kendte tumorsuppressorgener (fx

CDKN2B

,

MTUS1

,

RASSF6

,

PDCD4

,

KLF5

,

Cds1

), og (iii) af resultaterne af hovedkomponent analyser udført på tidligere offentliggjorte datasæt. Der er forskellige genetiske og epigenetiske faktorer, der kan bidrage til nedsat ekspression af gener i tumorceller. Vi var interesserede i gener, der kan afbrydes ved DNA methylering. Tidligere undersøgelser har vist, at mange gener er inaktiveret i kolorektale cancercellelinjer men der er store variationer mellem de forskellige cellelinier [16], [17], hvilket tyder på, at ikke alle de inaktiverede gener er relateret til tumorigenese. Ifølge vores hypotese, kan aktivitet af adskillige gener identificeret ved vores tilgang forstyrre tumorprogression. Denne hypotese understøttes af tilstedeværelsen af ​​cyclinafhængige kinaseinhibitor 2B (

CDKN2B

) og 2C (

CDKN2C

) tumorsuppressorgener i det identificerede gensæt.

CDKN2B

gen er placeret på kromosom 9p21, et sted, hvor sletninger forekommer hyppigt i mange primære humane tumorer, herunder esophageal carcinoma [44] og kolorektal cancer [45].

CDKN2B

, som blev nedreguleret i vores adenom og kolorektale tumor prøver også bragt til tavshed af DNA methylering i en række blodkræftsygdomme [46].

CDKN2C

er tidligere rapporteret at være inaktiveret ved promotor hypermethylering i Reed-Sternberg celler i Hodgkin lymfomer, og tabet af CDKN2C viste negativ korrelation med den overordnede overlevelse af patienterne [47]. Retinsyrereceptor responder 1 (

RARRES1

) er også et tumorsuppressorgen. Dets ekspression er ofte nedreguleres via DNA hypermethylering i flere typer af maligne væv. Nedregulering af

RARRES1

blev foreslået at være relateret til fase D progression af kolorektal cancer [48]. Underekspression af flere andre gener, identificeret ved vores tilgang, er tidligere beskrevet til at være forbundet til tyktarmskræft. For eksempel er methyl-CpG bindende domæne protein, MBD4, som er involveret i mismatch reparation på bindingssteder for CpG, påvirket af læserammeforskydningsmutationer i over 40% af mikrosatellit ustabil sporadiske coloncancerformer [49]. Den humane polimeric immunoglobulin receptor (PIGR) viste sig at blive underexpressed i tyktarmstumorer og også i colontumorcellelinier [50]. Svarende til vores resultater, at Ephrin-A5-genet (

EFNA5

) blev også rapporteret før som en nedreguleret gen i tyktarmskræft [51]. Ekspressionen af ​​POU-domænet klasse 2 transkriptionsfaktor 3 (POU2F3) blev reduceret i adenom og tumorøse colon epitel. CpG øer i

POU2F3

regulatoriske region er ofte afvigende methylerede i livmoderhalskræft [52].

For at vurdere nøjagtigheden af ​​vores tilgang, vi målte udtryk for fem gener ved RT-PCR i uafhængige vævsprøver. Disse gener blev også identificeret i vores tidligere pilotundersøgelse men de har ikke været forbundet med CRC før. I tilfælde af to gener,

GCG

NMES-1

, en bemærkelsesværdig nedgang blev fundet i genekspressionen allerede i adenom fase. Begge gener viste en stærk reaktivering som følge af en demethylering behandling af HT-29-celler, hvilket antyder, at disse gener inaktiveres ved promotor-hypermethylering.

NMES-1

genet (også navngivet som

C15orf48

) udtrykkes langs sund mave-tarmkanalen, og det er ofte nedreguleres i esophageal planocellulært karcinom [53]. Afvigende methylering af

NMES-1

promotor-regionen blev også påvist i invasiv livmoderhalskræft (ICC), men ikke i normale cervikale prøver [54]. Proteinet kodet af glucagon (GCG) gen er et præproprotein, som spaltes i fire forskellige modne peptider. Disse peptider er involveret i at opretholde homeostase næringsstof, og er regulatorer af celleproliferation, differentiering og apoptose [55].

FAM161B

er et forudsagt gen, hvis bidrag til carcinogenese er endnu ikke blevet rapporteret. Det blev underexpressed i begge trin i vores eksperimenter, men det ikke vise en bemærkelsesværdig aktivering som følge af 5-Aza behandling.

prostaglandin D2 receptor (

PTGDR

) genet er placeret i prostaglandin receptor klynge. I tidligere undersøgelser af status for methylering af

PTGDR

viste sig at være korreleret omvendt med dets ekspression i neuroblastomcellelinier [56]. Vores microarray resultater antydede, at PTGDR mRNA-niveauet aftager langs adenom-carcinom-sekvensen i gennemsnit. Imidlertid analyse af PTGDR mRNA-niveauet ved RT-PCR og PTGDR proteinniveauet ved immunhistokemi i individuelle vævsprøver viste heterogenitet. Lignende resultater blev opnået ved at analysere de tidligere offentliggjorte GSE8671 og GSE18105 genekspression datasæt (figur 4). HRM analyser opdaget forskellige niveauer af CpG methylering i PTGDR promotor-regionen i individuelle prøver tyktarmskræft. Disse observationer tyder på, at

PTGDR

gen bragt til tavshed af DNA hypermethylering under udviklingen af ​​visse kolorektale tumorer. Men den har brug for yderligere undersøgelser om PTGDR lyddæmpning viser en korrelation med prognosen for sygdommen.

microarray data sammen med validerings- resultater antyder, at DNA-methylering delvist inaktiverer visse gener allerede i den tidlige adenom scenen. Denne observation kan være vigtigt i fremtiden, fordi efter tidlig opdagelse af tyk- og endetarmskræft, gen-specifikke behandlinger eller målrettet gen aktivering metoder kan have relevant betydning. Interessant gener, som nedreguleret i adenom fase ikke altid udviser en gradvist faldende aktivitet langs adenom-carcinom-sekvensen, det vil sige de udtrykkes på et lavere niveau i adenom end i tumorprøverne. Også, observerede vi højere ensartethed af adenom prøver end tarmkræft prøver i PCA analyser af genekspression datasæt (Figur 7C vs 7B). Denne observation tyder på, at visse gener, som er nødvendige for at blive inaktiveret for adenom dannelse genaktiveres i tumoren. Det er lettere at opnå sådanne mønstre af genaktivitet ved reversibel epigenetisk regulering end ved mutationer. Methylering-medieret regulering kan påvirke omkring 60% af de menneskelige initiativtagere [11], og giver mulighed for finjustering af gen aktiviteter for at opnå en optimal kombination af udtryk. Denne optimale kombination kan afhænge af flere faktorer og kan ændre sig under tumorprogression. Men på grund af det begrænsede antal prøver i dette arbejde, er der behov for yderligere undersøgelser for at bekræfte denne konklusion.

nedregulering af mange gener identificeret ved vores tilgang er relateret til tumorigenese. Der er dog behov for yderligere undersøgelser for at besvare, om det sæt af underexpresed gener præsenteres i denne undersøgelse er specifik for kolorektal cancer. Anvendelse vores tilgang til andre tumormodeller ville tillade undersøgelse af tumor-specificitet hypermethyleringsassocierede medieret gen inaktivering mønstre.

Materialer og metoder

Prøvetagning

Vævsprøver opnået fra kirurgisk fjernet colonvæv var lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret på -80 ° C indtil anvendelse.