PLoS ONE: Arsentrioxid Forbedrer Radiation følsomhed androgenafhængige og-Independent menneskelige prostata cancer celler

Abstrakt

Prostatakræft er den mest almindelige malignitet hos mænd. I den foreliggende undersøgelse blev LNCaP (androgen-sensitive humane prostatacancerceller) og PC-3-celler (androgen-uafhængige humane prostatacancerceller) anvendes til at undersøge anti-cancer virkninger af ioniserende stråling (IR) kombineret med arsentrioxid (ATO ) og til at bestemme de underliggende mekanismer

in vitro

in vivo

. Vi fandt, at IR kombineret med ATO forøger den terapeutiske effektivitet sammenlignet med individuelle behandlinger i LNCaP og PC-3 humane prostatacancerceller. Desuden viste kombineret behandling forbedret reaktive ilt arter (ROS) generation sammenlignet med behandling med ATO eller IR alene PC-3 celler. Kombineret behandling induceret autofagi og apoptose i LNCaP-celler, og hovedsagelig induceret autophagy i PC-3-celler. Det celledød, der er fremkaldt ved den kombinerede behandling var primært et resultat af hæmning af Akt /mTOR signalveje. Endvidere fandt vi, at den kombinerede behandling af celler forbehandlede med 3-MA resulterede i en signifikant ændring i AO-positive celler og cytotoksicitet. I en

in vivo

undersøgelse kombinationsbehandlingen havde anti-tumorvækst virkninger. Disse nye fund antyder, at kombineret behandling er en potentiel terapeutisk strategi ikke blot for androgen-afhængig prostatacancer, men også for androgen-uafhængig prostatacancer

Henvisning:. Chiu HW, Chen YA, Ho SY, Wang YJ (2012 ) arsentrioxid Forbedrer Radiation følsomhed androgenafhængige og-Independent menneskelige prostata cancer celler. PLoS ONE 7 (2): e31579. doi: 10,1371 /journal.pone.0031579

Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA

Modtaget: November 29, 2011; Accepteret: 9. januar 2012; Publiceret: 20 feb 2012

Copyright: © 2012 Chiu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Science Rådet, Taiwan (NSC 98-2314-B-006-034-MY2) og Sinlau Christian Hospital, Tainan, Taiwan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft udgør et stort problem for mænd sundhed på verdensplan. Tidligere undersøgelser har vist, at aktiveringen af ​​androgen receptorer (AR) af androgener er nødvendig for vækst og overlevelse af prostatacancerceller. Endvidere er de fleste prostatatumorer androgenafhængige i begyndelsen [1]. Men over tid, tumoren opstår igen, i en androgen-refraktære måde og til stede med en mere aggressiv og metastatisk fænotype, som er resistent over yderligere hormonal manipulation [2]. Fordi androgener spiller vigtige roller i vækst og overlevelse af prostatacancerceller, foreslår voksende tegn en væsentlig rolle for Akt i udviklingen af ​​hormon-uafhængig prostata sygdom [3], [4], [5]. Inhiberingen af ​​Akt i prostata celler ophæver HER-2 /neu-induceret AR signalering og celleoverlevelse /vækstvirkninger i fravær eller nærvær af androgen [4]. Desuden vellykket progression til en androgen-uafhængig stat kræver intakt PI3K signalering [6]. Således er hæmning af Akt-vejen fremstår som en attraktiv klinisk mål for forebyggelse af hormon-refraktær sygdom.

Der er nu rigeligt med beviser understøtter fordelene ved højdosis strålebehandling ved ekstern bestråling i patienter med klinisk lokaliseret prostatacancer [7]. Imidlertid højdosis strålebehandling forårsager betydelige indirekte skader til normale cellepopulationer på stedet behandling [8]. Således kan anvendelsen af ​​kemiske modificerende midler som radiosensibilisatorer i kombination med lavdosis bestråling forøge den samlede terapeutiske virkning. Arsen har længe været anvendt som anticancermiddel i traditionel kinesisk medicin [9]. Senest arsentrioxid (ATO) er blevet anvendt med held til behandling af resistent eller recidiverende akut promyelocytisk leukæmi (APL), og dens effektivitet er blevet bekræftet, selv hos patienter resistente over for konventionel kemoterapi [10]. Tidligere undersøgelser har også vist, at kombinationen af ​​ATO og ioniserende stråling (IR) sandsynligvis er den mest effektive strategi for leukæmi og faste tumorer [11], [12], [13]. ATO kunne tjene som en potent strålingssensibiliserende middel og kan øge hærdningshastigheden af ​​maligne celler. Men virkningerne og den præcise mekanisme af kombineret behandling af ATO og IR mod prostatakræft er fortsat uklare.

Autophagy er en af ​​de mekanismer af stress tolerance, der opretholder cellernes levedygtighed og kan føre til tumor vækstdvale, progression og terapeutiske modstand. Imidlertid kunne mange anticancerlægemidler også inducere overdreven eller langvarig autofagi der udløser tumor celledød. Undersøgelser er i gang for at definere optimale strategier til at modulere autophagy til forebyggelse og terapi af kræft og udnytte autophagy som mål for anticancer lægemiddelforskning [14]. Et antal forbindelser forekomme opstrøms for den apoptotiske og autophagic maskiner, hvor signalveje regulere begge processer. Aktivering af PI3 kinase /Akt pathway, en velkendt metode til at inhibere apoptose, hæmmer også autofagi [15]. Akt er en serin /threonin-proteinkinase, der spiller en kritisk rolle i at undertrykke apoptose ved at regulere dens downstream pathways [16]. Akt phosphorylerer også mammalian target of rapamycin (mTOR), som er blevet rapporteret at inhibere induktionen af ​​autofagi [17]. Både apoptose og autofagi kunne induceres i visse tumorceller under behandlingen af ​​anticancerlægemidler [18], [19].

Atorvastatin inducerer autophagy i androgenreceptoren negative prostatacancer PC-3-celler gennem aktivering af LC3 transskription [20]. Derudover har en nylig undersøgelse også vist, at en naturlig BH3 mimetisk ((-) – gossypol) inducerer autophagy i apoptose-resistent prostatacancer ved modulering Bcl-2-Beclin1 samspil på det endoplasmatiske reticulum [21]. Androgen-uafhængige prostatacancerceller med højere niveauer af Bcl-2 var mere resistente over for (-) – gossypol induceret apoptose. Dog (-) – gossypol inducerede tilsvarende niveauer af total celledød i begge androgenafhængige og -uafhængige celler; den dræbte androgen celler hovedsageligt gennem apoptose, men i androgen-uafhængige celler, blev tilstanden af ​​celledød ikke fuldt forstået [21]. For nylig blev det vist, at ATO eller IR kan også induceres autofagi men ikke apoptose i cancerceller [22], [23].

I den foreliggende undersøgelse, LNCaP (androgen-sensitive humane prostatacancerceller) og PC -3-celler (androgen-uafhængige humane prostatacancerceller) blev anvendt til at undersøge de anti-cancer virkninger af IR kombineret med ATO. De typer af celledød induceret af IR kombineret med ATO blev undersøgt. Vi undersøgte også de mulige mekanismer bag apoptose eller autofagi i LNCaP- og PC-3 celler induceret af IR og /eller ATO.

Materialer og metoder

Cell kultur og medicinsk behandling

de human prostatacancer-cellelinier LNCaP (ATCC CRL-1740) og PC-3 (ATCC CRL-1435) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Cellerne blev dyrket i RPMI 1640-medium (Gibco BRL, Grand Island, NY), der blev suppleret med antibiotika indeholdende 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin (Gibco BRL, Grand Island, NY), og 10% føtalt bovint serum (HyClone, South Logan, UT, USA) .Cells blev inkuberet i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C. Eksponentielt voksende celler blev løsnet med 0,05% trypsin-EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY) i RPMI 1640 medium. For eksponering for arsentrioxid (Sigma Chemical Co.), 1 mM friske stamopløsninger blev fremstillet før hvert eksperiment og filtersteriliseret ved anvendelse af et 0,2-um sprøjtefilter. Reagenset blev tilsat i en koncentreret form til dyrkningsmediet og blandet forsigtigt. Kulturerne blev efterfølgende inkuberet i de angivne tidspunkter i figurerne.

Behandling med bestråling og celleviabilitetstest

IR blev udført med 6 MV røntgenstråler anvendelse af en lineær accelerator (Digital M Mevatron Accelerator Siemens Medical Systems, CA, USA) i en dosis på 5 Gy /min. Yderligere 2 cm af væv-ækvivalent bolus blev placeret på toppen af ​​en plast vævskulturkolbe at sikre elektroniske ligevægt, og 10 cm af væv-ækvivalent materiale blev anbragt under kolben at opnå fuld back-scatter. De behandlede celler blev centrifugeret og resuspenderet i 0,1 ml PBS. Hver celle suspension (0,02 ml) blev blandet med 0,02 ml trypanblåt-opløsning (0,2% i PBS). Efter 1 eller 2 minutter blev hver opløsning anbringes på et hæmocytometer, og de blå farvede celler blev talt som ikke-intakte.

klongenicitetsassayet

Celler blev bestrålet med 2, 4 eller 6 Gy . ATO blev tilsat til celler ved koncentrationer på 2 eller 5 uM. Cellerne blev trypsiniseret og talt. Kendt antal celler blev efterfølgende genudpladet i 6-cm dyrkningsskåle og returneres til inkubatoren at muliggøre koloni udvikling. Efter syv dage blev kolonier (indeholdende ≥ 50 celler) farves med en 0,5% krystalviolet opløsning i 30 minutter. Udpladningseffektivitet (PE) er forholdet mellem antallet af kolonier til antallet af celler podet i ikke-bestrålet gruppe. Beregning af overlevelse fraktioner (SF) blev udført ved hjælp af ligningen:. SF = kolonier tælles /(celler podet × PE), under hensyntagen til den enkelte PE

Bestemmelse af tidlig apoptose

Apoptose var vurderes ved at observere translokationen af ​​phosphatidylserin til celleoverfladen, som påvises med et Annexin V apoptose afsløring kit (Calbiochem, San Diego, CA, USA), ifølge vores tidligere rapport [13].

Måling af ROS produktion

Reaktive oxygenarter (ROS) produktion blev overvåget ved flowcytometri under anvendelse 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-dA), som tidligere [24] beskrevne. Efter behandling med IR og /eller ATO, blev cellerne inkuberet med 20 pM af DCFH-DA i 30 min. Cellerne blev høstet, vasket en gang og resuspenderet i PBS. Fluorescens blev overvåget ved anvendelse af et flowcytometer.

supravital cellefarvning med acridinorange for autophagy detektion

Cell farvning med acridinorange (Sigma Chemical Co.) blev udført ifølge offentliggjorte fremgangsmåder [13]. Celler blev forbehandlet med Autophagy inhibitorer 3-methyladenin (3-MA) ​​(Sigma Chemical Co.) ved en slutkoncentration på 1 mM i 1 time før IR behandling.

Elektronmikroskopi

celler blev fikseret med en opløsning indeholdende 2,5% glutaraldehyd plus 2% paraformaldehyd i 0,1 M cacodylatbuffer, pH 7,3, i 1 time. Efter fiksering blev prøverne efterfikseret i 1% OSO

4 i den samme buffer i 30 minutter. Ultra-tynde sektioner blev efterfølgende observeret under et transmissionselektronmikroskop (JEOL JEM-1200EX, Japan) ved 100 kV.

Western blot-analyse Salg

Totalt cellulært proteinlysater fremstilledes ved at høste celler i protein ekstraktionsbuffer i 1 time ved 4 ° C som beskrevet tidligere [12]. De tætheder af båndene blev kvantificeret med en computer densitometer (AlphaImager ™ 2200 System Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA). Ekspressionen af ​​GAPDH blev anvendt som protein loading kontrol. Antistofferne til påvisning Akt, phospho-Akt, phospho-mTOR, phospho-p70S6K, ERK, phospho-ERK, phospho-PDK1, PDK1, JNK, p38, phospho-p38, Beclin 1, Bax og Bcl-2 blev opnået fra celle Signaling Technology (Ipswich, MA, USA); anti-GAPDH blev opnået fra Abcam (Cambridge, MA, USA); LC3, blev Atg5 og Atg5-12 opnået fra Abgent (San Diego, CA, USA); anti-P62 /SQSTM1 antistof blev opnået fra MBL (Nagoya, Japan); anti-poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) antistof blev opnået fra Millipore (Billerica, MA, USA); mTOR, p70S6K, phospho-JNK, caspase-3 og spaltes-caspase-3 blev opnået fra Epitomics (Burlingame, CA, USA).

In vivo Salg tumor vækst assays under anvendelse af PC- 3 tumor model i nøgne mus

Alle forsøg på mus blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i vores institut (vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, National Cheng Kung University). Nedenstående brug dyr protokol er blevet revideret og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) (Godkendelse nr: 99.138). Seks til otte uger gamle mandlige nøgne mus (BALB /cAnN.Cg-Foxn1

nu /CrlNarl) blev erhvervet fra National Laboratory Animal Center (Taiwan). Dyrene blev anbragt med fem i hvert bur ved 24 ± 2 ° C og 50% ± 10% relativ fugtighed og udsættes for en 12-timers lys /12-timers mørke-cyklus. Dyrene blev akklimatiseret i 1 uge før starten af ​​eksperimenterne og fodret med en Purina chow kost og vand ad libitum. Tumorer blev induceret ved subkutan (s.c.) injektion af PC-3-celler (2 x 10

6 celler i 0,1 ml PBS) i den ene side af den højre flanke. Tumorer (visualiseret som små knuder på stederne for injektion) syntes -7 dage efter injektion, og dyrene blev tilfældigt fordelt i hver gruppe. Mus blev behandlet med: (1) vehikel (PBS), (2) 6 mg /kg ATO tre gange om ugen i to uger (på dag 0, 2, 4, 7, 9 og 11), (3) en enkelt dosis af 6 Gy IR, eller (4) en kombinationsbehandling bestående af 6 mg /kg ATO tre gange om ugen i to uger begyndte lige efter en enkelt dosis på 6 Gy IR. Mus kropsvægte blev målt en gang om ugen og blev anvendt som indikator for systemisk toksicitet af behandlingen. Tumorvækst blev målt hver anden dag, og tumorvolumenet blev beregnet efter den nedenfor viste [25] formel: Data er udtrykt som den relative tumorvolumen i forhold til volumenet forbehandling målt på dag 0. tumorvolumen firedobling tid (TVQT, i dage) blev bestemt ved en best fit regressionsanalyse. Den tumorvækstforsinkelse (TGD) defineres som forskellen mellem TVQT på de behandlede tumorer sammenlignet med ubehandlede kontroldyr tumorer. Den TVQT og TGD tid blev beregnet for hver enkelt mus og gennemsnit for hver gruppe. Tumorvækstinhibering blev beregnet som følger:. Inhibition (%) = (gennemsnitlig tumorvolumen af ​​ubehandlet kontrolmus-tumorvolumen af ​​behandlede mus) /middelværdi tumorvolumen af ​​ubehandlede kontrolmus x 100

immunhistokemisk (IHC) farvning analyse

Paraffin-vævssnit (4 pm) blev tørret, deparaffineret, og rehydreret. Efter mikroovn forbehandling i citratpuffer (pH 6,0; for antigen hentning) blev objektglassene nedsænket i 3% hydrogenperoxid i 20 minutter for at blokere aktiviteten af ​​endogen peroxidase. Efter intensiv vask med PBS blev objektglassene inkuberet natten over ved 4 ° C med LC3 (MBL, Japan), PCNA (ProteinTec Group, Inc., Chicago, USA) og Atg5 (Abgent, San Diego, CA, USA) antistoffer. Snittene blev inkuberet med et sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur, og objektglassene blev udviklet med STARR TREK Universal HRP detektion kit (Biocare medicinsk, Concord, CA). Endelig blev objektglassene kontrastfarvet med hematoxylin. Hvert objektglas blev scannet ved lav effekt (× 200).

Statistisk analyse

Data udtrykkes som middelværdi ± SD. Statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse af Students t-test til sammenligning mellem midler eller envejs variansanalyse med post-hoc Dunnetts test [26]. Forskelle blev anset for at være væsentlig, når p. 0,05

Resultater

Optimal dosis og tid udvalg af IR og ATO til behandling af LNCaP og PC-3 celler

levedygtighed af LNCaP og PC-3-celler blev observeret ved forskellige doser af IR (fra 0 til 8 Gy) i 6, 12, 18, 24 og 48 timer (fig. 1A). Behandling med IR alene reducerede levedygtigheden af ​​LNCaP og PC-3-celler på en dosis-afhængig måde. Endvidere blev levedygtigheden af ​​cellerne observeret ved forskellige koncentrationer af ATO (0 til 15 uM) i 12, 24, 36 og 48 timer (fig. 1B). ATO alene reducerede levedygtigheden af ​​celler i en koncentrationsafhængig måde. Efter behandling med 5 uM ATO i 48 timer, levedygtighed LNCaP og PC-3-celler blev reduceret til 60% og 73%, hhv. Figur 1C viser levedygtigheden af ​​ATO og IR behandlet alene eller i kombination på LNCaP og PC-3-celler. Markant øget toksicitet blev fundet for kombinationsbehandlingen sammenlignet med ATO og IR behandling alene i LNCaP og PC-3 celler. Figurerne 1D viser stråling dosis-respons overlevelseskurver for LNCaP- og PC-3 celler med eller uden ATO behandling. Overlevelseskurverne dramatisk flyttet nedad. ATO (2 uM) steg IR-induceret klonogenisk celledød i LNCaP og PC-3-celler. ATO betydeligt reduceret overlevelse fraktionen i en dosisafhængig måde i forhold til IR alene.

(A) Time-kursus og dosis-afhængige effekter af IR på levedygtigheden af ​​LNCaP og PC-3 celler. Celler blev behandlet med 2, 4, 6 eller 8 Gy IR for 6, 12, 18, 24 og 48 timer. (B) Time-kursus og koncentration-afhængige effekter af ATO på levedygtighed LNCaP og PC-3 celler. Celler blev behandlet med 2, 5, 10 eller 15 uM ATO for 12, 24, 36 og 48 timer. (C) cytotoksiske virkninger af celler behandlet med IR (4 Gy) og ATO (5 uM). (D) De stråling dosis-respons-overlevelseskurverne for LNCaP- og PC-3 celler med eller uden ATO. Data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse fra tre uafhængige forsøg.

Måling af apoptose i LNCaP og PC-3-celler behandlet med ATO og IR alene eller i kombination

Induktionen af apoptotisk celledød er en væsentlig mekanisme af tumorceller under indflydelse af radio- /kemoterapi [27]. Som vist i figur 2A, tidlig apoptose i LNCaP og PC-3-celler blev målt ved flowcytometri med Annexin V apoptose afsløring kit. Kvantitative resultater viste, at kombinationen behandling inducerede mere apoptotisk celledød end behandling alene med ATO eller IR i LNCaP-celler. Derimod forekomsten af ​​tidlig apoptose i PC-3-celler behandlet med ATO og /eller IR var lav (under 10%). ROS-generering blev yderligere vurderet ved flowcytometri. Et ca. 3,5-fold stigning i intracellulære peroxidniveauer blev fundet, når PC-3 celler blev udsat for kombinationsbehandlingen i 1 time (fig. 2B, 2C). Figur 2D viser western blot analyse af poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), caspase-3, og Bcl-2. Spaltningen af ​​PARP af aktiverede caspase-3 resulterer i dannelsen af ​​en 85-kDa C-terminalt fragment. Vores resultater viste, at den specifikke spaltning af PARP og caspase-3 blev fundet i celler behandlet med IR, ATO alene eller i kombination i LNCaP-celler. Vi analyserede også ekspressionsniveauet for Bcl-2, som er en suppressor af programmeret celledød, og fandt, at Bcl-2-proteiner faldt ved behandling med IR alene og kombinationen behandling i begge celler.

(A ) påvisning Tidlig apoptose blev målt ved flowcytometri med et Annexin V apoptose afsløring kit. Celler blev behandlet med IR (4 Gy) og ATO (5 uM) i 48 timer. #,

s

0,05, IR versus kombineret behandling. *,

s

0,05, ATO versus kombineret behandling. (B) (C) ROS-generering i PC-3-celler behandlet med 5 pM ATO eller 4 Gy IR alene eller i kombination i 30, 60, 120 minutter og med DCFH-DA i yderligere 30 min. Fluorescensen i cellerne blev straks analyseret under anvendelse af flowcytometri. #,

s

0,05, IR versus kombineret behandling. *,

s

0,05, ATO versus kombineret behandling. (D) Western blotting af PARP, spaltes-PARP, pro-caspase 3, spaltes-caspase 3og Bcl-2. For det samlede GAPDH protein blev anvendt som indlæsning kontrol. Celler blev behandlet med IR (4 Gy) og ATO (5 uM) i 48 timer. Data er præsenteret som den gennemsnitlige ± standardafvigelse fra tre uafhængige forsøg.

Måling af autophagy i LNCaP og PC-3-celler behandlet med ATO og IR alene eller i kombination

Autophagy er karakteriseret ved dannelse af talrige sure vesikler, som kaldes sure vesikulære organeller (AVOS) [23]. Mikrofotografier af Avós blev observeret via grøn og rød fluorescens i acridinorange (AO) -stained celler med et fluorescensmikroskop (fig. 3A). Den kombinerede behandling viste en signifikant stigning i AVOS sammenlignet med kontrolgrupper i LNCaP og PC-3-celler. De ultrastructures af PC-3 celler for hver behandlingsgruppe blev observeret af EM fotomikrografi (fig. 3B). Den kombinerede behandling resulterede også i et stort antal autophagic vakuoler og autolysosomes i cytoplasmaet. Desuden var der ingen chromatinkondensering eller nuklear pyknosis, der er karakteristiske for apoptose, i nogen af ​​de behandlede celler. Endvidere blev AO-farvning kvantificeres ved hjælp af flowcytometri (fig. 3C, 3D). En betydelig stigning i AO-positive celler blev fundet for celler, der modtager kombineret behandling sammenlignet med dem behandlet med IR eller ATO alene i begge celler. For at detektere ekspressionen af ​​autofagi-relaterede proteiner, udførte vi western blotting med lysater fra LNCaP og PC-3-celler modtager hver af de forskellige behandlinger (fig. 3E, 3F). Ekspressionsniveauerne af LC3-II, P62, Atg5 og Atg5-12 proteiner steg med kombineret behandling i begge celler. Den kombinerede behandling induceret autophagy i LNCaP og PC-3 celler.

(A) mikrofotografiet af Avos i LNCaP og PC-3 celler. Påvisning af grøn og rød fluorescens i acridin orange (AO) -stained celler blev udført under anvendelse af et fluorescensmikroskop.

hvide pile

punkt til Avos. (B) EM mikrofotografier af PC-3-celler behandlet med IR (4 Gy) og ATO (5 uM) i 48 timer.

hvide pile

punkt at autophagic vakuoler og autolysosomes. (C) Udvikling af Avos i LNCaP og PC-3 celler. Påvisning af grøn og rød fluorescens i AO-farvede celler under anvendelse af flowcytometri. (D) Kvantificering af AVOS med AO-farvede celler behandlet med IR (4 Gy) eller ATO (5 uM) alene eller i kombination under anvendelse af flowcytometri. Data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse fra tre uafhængige forsøg. #,

s

0,05, IR versus kombineret behandling. *,

s

0,05, ATO versus kombineret behandling. (E) (F) Western blotting af LC3-I, LC3-II, P62 /SQSTM1, Atg5 og Atg5-12 udtryk i LNCaP og PC-3 celler. Celler blev behandlet med IR (4 Gy) og ATO (5 uM) i 48 timer.

PI3K /Akt-signalvejen er involveret i kombineret behandling celledød og celler undergår både apoptotiske og autophagic celle død, når de udsættes for IR og ATO i LNCaP og PC-3 celler

for at undersøge, om PI3K /Akt signalvejen var involveret i kombineret behandling celledød, udførte vi western blotting at påvise protein fosforylering tilstand ( fig. 4A, 4B). Phosphorylerede proteiner, der er relateret til PI3K /Akt signalveje blev også undersøgt. Resultaterne viser, at phosphorylering af Akt, mTOR, p70S6K og PDK1 faldt i celler behandlet med den kombinerede behandling sammenlignet med kontrollen. Dernæst undersøgte vi, om inhibering af autofagi kunne ændre procentdelen af ​​levedygtige celler, der var blevet behandlet med ATO og IR (fig. 5). Til dette formål anvendte vi 3-methyladenin (3-MA) ​​(en autofagi inhibitor). Annexin V og AO-farvning blev kvantificeret under anvendelse af flowcytometri. Den kombinerede behandling af LNCaP og PC-3-celler forbehandlet med 3-MA viste ingen effekt i apoptotiske celler (Fig. 5C, 5F), og et signifikant fald i AO-positive celler (fig. 5B, 5E) sammenlignet med kombineret behandling. Endvidere undersøgte vi, om inhibering af autofagi kunne ændre cytotoksiciteten af ​​den kombinerede behandling (fig. 5A, 5D). Vi fandt en signifikant fald i cytotoksicitet sammenlignet med cellerne, der modtager den kombinerede behandling uden forbehandling med 3-MA. Disse resultater antyder, at ATO kombineret med IR kan inducere autophagic celledød i LNCaP og PC-3-celler.

Celler blev behandlet med IR (4 Gy) og ATO (5 uM) i 48 timer.

(A) (D) Virkninger af 3-MA på cytotoksicitet induceret af kombineret behandling. (B) (E) Tidlig apoptose blev målt ved flowcytometri med Annexin V. (C) (F) Kvantificering af AVOS med AO anvendelse af flowcytometri. *,

s

. 0,05, ATO + IR versus ATO + IR + 3-MA

tumorvækst i nøgne mus blev undertrykt af IR og ATO

Næste, vi næste evalueret den anti-tumorvækst effekt af IR og ATO

in vivo

. Tumorer blev induceret ved s.c. injektion af PC-3-celler i nøgne mus. Vi målte kropsvægten af ​​mus hver uge og tumorvolumen hver to dage. Resultaterne af denne undersøgelse viste, at ingen af ​​behandlingsregimer produceret ethvert tab af kropsvægt, hvilket kan være et tegn på toksicitet (fig. 6A). Den kombinerede behandling undertrykt tumorvolumen og tumorvægt i nøgne mus sammenlignet med ATO eller IR-behandlinger alene (fig. 6B, 6C, 6D). Som vist i tabel 1 blev tumorvolumen firdobling tid (TVQT) for kontrolgruppen målt på dag 18 (17,9 ± 2,2). Den tumorvækst forsinkelse (TGD) tid for 18-dages behandling af ATO alene var 11 dage, hvilket ikke var signifikant anderledes end for kontrolgruppen (

s

= 0,11). IR alene gav en TGD på cirka 8,9 ± 5,1 dag (

s

= 0,17 sammenlignet med kontrolgruppen). Kombinationen behandling resulterede i en TGD tid på 39,5 ± 8,3 dage (

s

0,05, sammenlignet med IR alene eller ATO alene). Kombinationen terapi af IR og ATO resulterede i en tumorvækst inhibering af 74% på dag 18. Kombinationen behandling besidder anti-tumorvækst effekt

in vivo

. Dernæst blev den PCNA, LC3 og Atg5 udtryk mønster i PC-3 tumorer undersøgt ved IHC-farvning (fig. 6E). PCNA udtryk blev reduceret og LC3 og Atg5 blev forøget i den kombinerede behandling sammenlignet med ATO eller IR behandling alene.

(A) Måling af kropsvægt i nøgne mus en gang om ugen. (B) Måling af tumorvolumen hos nøgne mus hver anden dag. Data er præsenteret som den relative tumorvolumen (middel ± standardfejl) normaliseret til det oprindelige volumen tumor målt på dag 0. (C) Direkte observationer af mus med tumorer. Efter forsøgene blev musene aflivet, og tumorerne blev fjernet. (D) Måling af tumor vægt i nøgne mus efter aflivning. (E) Immunohistokemisk (IHC) farvning af PC-3 mus xenograft væv. IHC blev anvendt til at bestemme ekspressionsniveauerne af PCNA, LC3 og Atg5 (× 200 objektiv forstørrelse).

Diskussion

I øjeblikket er udviklingen af ​​prostatakræft til en stat af androgenuafhængighed fortsat den primære hindring for forbedret patientoverlevelse. Således nye behandlingsstrategier, der er nyttige for androgen-uafhængig sygdom skal identificeres [28]. I den foreliggende undersøgelse, en kombination af IR- og ATO viste potentiale som en terapeutisk strategi til behandling af prostatacancer (androgen-afhængig og uafhængig) (fig. 1). Lian et al. rapporterede, at den naturlige BH3-mimetisk (-) – gossypol fortrinsvis inducerer autophagy i androgen-uafhængige prostatacancerceller, der er resistente over for apoptose, hvorimod apoptose fortrinsvis induceres i androgenafhængige celler [29]. Den foreliggende undersøgelse viser, at IR kombineret med ATO har en forøget terapeutisk virkning ved LNCaP og PC-3 humane prostatacancerceller. Specifikt den kombinerede behandling inducerede autofagi og apoptose i LNCaP-celler, og hovedsagelig induceret autophagy i PC-3-celler (fig. 1, 2, 3). Ovenstående

in vitro

resultater underbygges af

in vivo

eksperimenter, ansat en musemodeller med xenotransplantattumorer fra PC-3 celler. Den kombinerede behandling undertrykt tumorvolumen og tumorvægt i nøgne mus sammenlignet med ATO eller IR-behandling alene (fig. 6B). Desuden kombinationsterapien og IR ATO resulterede i en tumorvækst inhibering af 74% (tabel 1). Desuden blev tumorvæv i LC3 og Atg5 udtryk steg i den kombinerede behandling sammenlignet med ATO eller IR behandling alene (fig. 6E).

Shen et al. indikerede, at ATO terapi er stort set sikker og få patienter kræver ophør af behandling på grund af bivirkninger [30]. Plasma niveau af arsen i den kliniske behandling af akut promyelocytleukæmi normalt når 5.5-7.3 pM [30]. Det er blevet rapporteret, at den maksimale koncentration af plasma arsen niveau var 10,6 pM efter intraperitoneal administration af 0,2 mg (10 mg /kg) af ATO i mus [31]. Doseringen anvendt i vores aktuelle undersøgelse var 6 mg /kg ATO hos mus en høj koncentration af plasma arsen niveau på 6,4 uM, hvilket er klinisk relevant. Endvidere vore resultater i xenotransplantat musemodel fandt, at der var ingen signifikant vægttab hos mus af kombineret behandling sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 6A), og proceduren derfor kombineret behandling (6 mg /kg ATO tre gange om ugen i to uger og en enkelt dosis på 6 Gy IR) var veltolereret.

er stadig kontroversiel rolle autophagy i kræftmedicin. Autophagy har vist sig at spille en rolle som en celle overlevelse mekanisme, der tillader celler at rydde beskadigede cytoplasmatiske proteiner og organeller gennem lysosomal nedbrydning og at overleve metabolisk stress [32]. På den anden side har autofagi vist sig at bidrage til type II programmeret celledød som respons på hypoxi, kemoterapeutiske midler, virusinfektion, og toksiner [33]. Vores resultater antyder, at den observerede signifikant stigning i autophagy kan forklare, i det mindste delvist, den cytotoksiske virkning af kombineret behandling, fordi forbehandling med 3-MA, en autophagy inhibitor, havde en beskyttende virkning på kombineret behandling-induceret celledød i LNCaP og PC-3-celler (fig. 3, 5). Nylige undersøgelser har vist, at Akt /mTOR pathway spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​både apoptose og autofagi [34]. Ser473 er ​​vigtig for anerkendelse og phosphorylering af Akt af PDK1 [35]. Derudover antitumorvirkninger af OSU-03012, en celecoxib-derivat, blev anset for at være primært medieres via inhibering af PDK1 [36]. Afbrydelse af PI3K /Akt pathway, der kulminerede i hæmning af Akt er fundet, at være forbundet med autofagi induceret af en række forskellige antineoplastiske midler i cancerceller [34]. En kombination af indol-3-carbinol og genistein synergistisk inducerer apoptose og autofagi i humane coloncancer HT-29-celler ved at hæmme Akt phosphorylering [37]. Friedrichs et al. angivet, at polyumættede fedtsyrer kan forhindre progression af prostatacancerceller at hormon uafhængighed ved at modificere signaltransduktionsveje såsom Akt /mTOR pathway [28]. Et intakt PI3K /Akt pathway er nødvendig for LNCaP-celler til at udvikle sig til hormonresistent tilstand, og AKT aktivitet stiger som cellerne omdanne fra hormonafhængig til hormon-uafhængig [6]. Den foreliggende undersøgelse viser, at ekspressionen af ​​p-Akt, p-mTOR, p-p70S6K og p-PDK1 proteiner faldt i celler behandlet med IR kombineret med ATO sammenlignet med behandling med ATO eller IR alene (fig. 4A).

under oxidative stress, ROS, herunder frie radikaler, der genereres i niveauer tilstrækkelige til at inducere oxidation og skader på DNA, lipider, proteiner og andre makromolekyler [38], [39].