PLoS ONE: Short Hårnål RNA Library-Based Functional Screening Identificeret ribosomprotein L31 der modulerer prostatakræft cellevækst via p53 Pathway

Abstrakte

Androgen receptor er en primær transskription faktor involveret i spredning af prostata cancer celler. Således hormon behandling med antiandrogener, såsom bicalutamid, er et første-line behandling for sygdommen. Selvom hormonbehandling indledningsvis reducerer tumor byrde, mange patienter med tiden tilbagefald, udvikling tumorer med erhvervet endokrine resistens. Belysning af de molekylære mekanismer bag endokrine resistens er derfor et grundlæggende spørgsmål for forståelsen og udviklingen af ​​alternative lægemidler til avanceret prostatakræft. I den foreliggende undersøgelse, udførte vi kort hårnål RNA (shRNA) -medieret funktionel screening for at identificere gener, der er involveret i bicalutamid-medierede virkninger på LNCaP-prostatacancerceller. Blandt sådanne kandidatgener udvalgt ved screening under anvendelse vulkan plot analyse blev ribosomal protein L31 (RPL31) fundet at være essentielle for celleproliferation og cellecyklusfremadskriden i bicalutamid-resistent LNCaP (BicR) celler, baseret på små interfererende RNA (siRNA) – medierede knockdown eksperimenter. Notatet

RPL31

mRNA mere rigeligt udtrykt i BicR celler end i forældrenes LNCaP celler, og kliniske data fra ONCOMINE og The Cancer Genome Altas viste, at RPL31 er overudtrykt i prostata carcinomer sammenlignet med benign prostata væv. Interessant nok protein niveauer af tumor suppressor p53 og dens mål, p21 og MDM2, blev forøget i LNCaP og BicR celler behandlet med

RPL31

siRNA. Vi observerede formindsket nedbrydning af p53 protein efter

RPL31

knockdown. Desuden undertrykkelse af vækst og cellecyklus på

RPL31

knockdown blev delvist genvundet med

p53

siRNA behandling. Disse resultater antyder, RPL31 er involveret i bicalutamid-resistent vækst af prostatacancerceller. Den shRNA-medieret funktionel skærm i denne undersøgelse giver ny indsigt i de molekylære mekanismer og terapeutiske mål for fremskreden prostatacancer

Henvisning:. Maruyama Y, Miyazaki T, Ikeda K, Okumura T, Sato W, Horie-Inoue K, et al. (2014) Kort Hårnål RNA Library-Based Functional Screening Identificeret ribosomprotein L31 der modulerer prostatakræft cellevækst via p53 Pathway. PLoS ONE 9 (10): e108743. doi: 10,1371 /journal.pone.0108743

Redaktør: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan

Modtaget: Juni 4, 2014, Accepteret: August 25, 2014; Udgivet: 6 okt 2014

Copyright: © 2014 Maruyama et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. GEO tiltrædelse nummer for microarray data GSE60382

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Cell Innovation Program, Grants-in-Aid og Support Project of Strategic Research Center i private universiteter fra Undervisningsministeriet, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi, Japan; af tilskud fra Japan Society for fremme af videnskab, Japan; af Grants-in-Aid fra Ministeriet for sundhed, arbejde og velfærd, Japan; af Advanced Research for Medicinske apparater Mining Program af National Institute of Biomedical Innovation, Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

prostatakræft er den fjerde mest almindelige årsag til kræft-relaterede dødsfald, og forekomsten af ​​prostatakræft i Japan er stigende, med 11.000 dødsfald om året af sygdommen. Mens de fleste tidlige fase, kan lokaliseret sygdom behandles vellykket ved strålebehandling og /eller kirurgi, vil så mange som 50% af patienterne behandlet i lokaliseret sygdom har lokalt recidiv eller fjernmetastaser [1], [2]. De nuværende first-line behandlinger ved tilbagevendende eller metastatisk prostatacancer er hormonterapier, herunder dem, der er målrettet androgen receptor (AR) signalering såsom bicalutamid og lægemidler, såsom gonadotropin-frigivende hormon-agonister, der forhindrer androgen produktion i testiklerne og binyrerne. Selvom hormonterapier oprindeligt reducere tumorbelastning, mange patienter bliver resistente over for disse behandlinger og udvikle en terminal form af sygdommen, betegnet kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) [3]. Patienter med CPRC har en dårlig prognose og tegner sig for størstedelen af ​​dødsfald som følge af sygdommen.

I CRPC er reaktivering af AR signalering anerkendt som en grundlæggende begivenhed, der resulterer i fornyet tumorvækst under forhold med androgen deprivation. Nylige undersøgelser har vist, at CRPC almindeligvis er forbundet med forøget AR signalering grund AR-amplifikation, AR mutation, transskription cofaktor aktivering, ligand-uafhængig phosphorylering af AR, og andre processer [4] -. [7]

Faktisk , immunhistokemiske undersøgelser viser, at overekspression af AR protein findes i de fleste tilfælde af CRPC [6] – [8]. Disse resultater antyder, at AR spiller en central rolle i udviklingen /væksten af ​​både androgen-afhængige prostatacancer og CRPC [9] – [12]. AR reaktivering er klinisk vigtig, fordi AR selv og dens downstream signalvej kunne være terapeutiske mål i CRPC. De præcise molekylære mekanismer bag AR reaktivering i CRPC er imidlertid uklar, på grund af samspillet af AR signaltransduktionsvej med andre signalveje.

I den foreliggende undersøgelse, udførte vi kort hårnål RNA (shRNA) screening at identificere hidtil ukendte gener modulerer responset på antiandrogenet bicalutamid i prostatacancerceller. I en sammenlignende undersøgelse af bicalutamid-behandlede og vehikelbehandlede prostatacancerceller, vulkan-plot-analyse [13], [14] blev anvendt til at screene gener, der er involveret i bicalutamid respons. En celleviabilitetstest ved hjælp af små interfererende RNA (siRNA’er) specifikke for shRNA-målretning kandidatgener afslørede, at ribosomale protein L31 (

RPL31

), histon klynge 1 H2bd (

HIST1H2BD

), og ADAM metallopeptidase med thrombospondin type 1 motiv 1 (

ADAMTS1

) var involveret i udbredelsen af ​​bicalutamid-resistent prostatacancer celler. Især RPL31, et protein, som er en del af 60S store ribosomale underenhed [15] – [18], viste sig at modulere ekspressionen af ​​tumor suppressor p53 [19] – [21] og cellecyklus regulator p21 [20] . Denne undersøgelse afslører nye veje modulerer bicalutamid respons og terapeutiske mål i prostatakræft.

Materialer og metoder

Cell kultur og antiandrogener

LNCaP, VCAP, og 22Rv-1 prostata cancerceller blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). LNCaP-celler blev dyrket i RPMI suppleret med 10% føtalt bovint serum, penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 mg /ml) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. VCap og 22Rv-1-celler blev dyrket i DMEM med 10% føtalt bovint serum, penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 mg /ml) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. Bicalutamid-resistente prostatacancerceller (BicR) er blevet beskrevet tidligere [22] – [24], og disse celler blev dyrket i RPMI suppleret med 1 pM bicalutamid, 10% føtalt bovint serum, penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 mg /ml) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. For stabil transfektion blev LNCaP-celler transficeret med C-terminalt FLAG-mærket RPL31 plasmid eller tom vektor (pcDNA3, Invitrogen) og selekteret i dyrkningsmedium indeholdende 0,1 mg /ml G418 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). De stabile transformanter af LNCaP celler, der udtrykker RPL31-Flag (LNCaP-RPL31 # 39 og # 63) og tom vektor (LNCaP-vec # 19 og # 22) blev klonet. Bicalutamid og docetaxel blev købt fra Sigma-Aldrich Japan (Tokyo, Japan).

Screening af bicalutamid-respons-relaterede gener ved hjælp af en lentiviral shRNA bibliotek

Thermo Scientific Open Biosystems Decode RNAi Viral Screening bibliotek (RHS5339) blev indkøbt fra Thermo Scientific (Huntsville, AL, USA). Skærmen shRNA blev udført som beskrevet andetsteds [1], [13], [14], [25]. Kort fortalt blev transduktioner udført i 100-mm plader, således at hver shRNA var repræsenteret med et gennemsnit på 100 kopier således at infektionsmultiplicitet (M.O.I.) var lig med 0,3 for median enkelt kopi integration af hver shRNA. Infektion af målceller på M.O.I. ≤0.3 blev bekræftet ved fluorescensmikroskopi og fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) 48 timer efter infektion. LNCaP-celler blev dyrket i vækstmedium indeholdende 1 uM bicalutamid eller vehikel (0,1% ethanol) i 1 måned

Microarrays Salg

Genomisk DNA blev isoleret fra transducerede celler under anvendelse af DNeasy Purification Kit (QIAGEN.; Tokyo, Japan) ifølge fabrikantens protokol. De integrerede shRNAs fremstillet ud fra LNCaP genomiske DNA blev amplificeret under anvendelse af primere (Decode RNAi-GIPZ, annoterede gener screening bibliotek-negativ udvælgelse kit fra Thermo Scientific) specifikt for stregkoderne for biblioteket plasmid-DNA [13], [14], [25] . PCR-produkterne blev geloprenset under anvendelse af QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). Oprenset DNA-fragmenter (1,5 ug) fra LNCaP-celler behandlet med vehikel eller bicalutamid blev mærket med cyanin-3 (Cy3) eller cyanin-5 (Cy5) Dye, henholdsvis anvendelse af Genome DNA Enzymatisk Labeling Kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) og oprenset ved fjernelse af ubundne cyaninfarvestoffer med en Microcon centrifugal filter enhed Ultracell YM-30 (Millipore Japan, Tokyo, Japan). Microarray hybridisering blev udført under anvendelse af Oligo cDGH /chip-on-chip hybridisering Kit (Agilent). Agilent Feature Extractor software blev brugt til at scanne microarray billeder. GEO tiltrædelse nummer for microarray data GSE60382. En vulkan plot blev genereret ved gruppering baseret på sonder. Forarmet (fold forandring 0,5;

P

0,01) signaler i bicalutamid behandlede LNCaP celler sammenlignet med vehikelbehandlede celler blev valgt som bicalutamid respons gener [23], [25], [26].

siRNA transfektion og western blot analyse

Lyddæmper vælge pre-designede siRNA’er rettet mod kandidatgener blev indhentet fra Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) (tabel 1). siRNA targeting p53 (sip53: sc-29.435) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). En kontrol siRNA targeting luciferasegenet (siLuc) og en ikke-targeting kontrol siRNA (siControl) med ingen homologi til det kendte gen mål i mammale celler blev opnået fra RNAi (Tokyo, Japan). LNCaP og BicR celler blev udpladet i 6-brønds plader ved en densitet på 100.000 celler per brønd og dyrket natten over. Celler blev transficeret med siRNA ved en slutkoncentration på 10 nm ved anvendelse af Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Knockdown effektivitet siRNA blev bestemt ved QRT-PCR under anvendelse af RNA fremstillet fra cellerne 48 timer efter transfektion og normaliseret med den for siControl. Til Western blot-analyse blev bicalutamid (1 uM) eller vehikel tilsat til mediet 12 timer efter transfektion. Efter 48 timer blev celler høstet og lyseret i en prøvepuffer ved 100 ° C i 15 min for natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Cellelysater blev opløst på en 10% eller 15% SDS-PAGE-gel og derefter overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore Japan). Membraner blev undersøgt med en af ​​følgende primære antistoffer: anti-RPL31 (Abcam, Tokyo, Japan), anti-p53 (DO-7; LeicaBiosystems, Newcastle, UK), anti-MDM2 (SMP14; Santa Cruz Biotechnology), anti- p21 (C-19; Santa Cruz Biotechnology), og anti-Flag (M2; Sigma-Aldrich). Membraner blev derefter inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin IgG (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) eller anti-muse-IgG, og fremkaldes med forøget kemiluminescens (GE Healthcare). Membraner blev strippet og testet igen med et muse-anti-β-actin antistof. (AC-74, Sigma-Aldrich) som en belastning kontrol [27]

Kvantitativ PCR-analyse

LNCaP og BicR celler blev transficeret med siRNA (10 nM) i 48 timer. Totalt RNA blev ekstraheret fra cellerne under anvendelse af Isogen reagens (Nippon Gene, Tokyo, Japan). Første-streng cDNA blev syntetiseret fra 2 ug totalt RNA ved anvendelse af SuperScript III revers transkriptase (Invitrogen) med oligo (dT) 20-primer. QRT-PCR blev udført på en StepOnePlus instrument (Life Technologies) under anvendelse af FAST SYBR Green Master Mix (Life Technologies) og 150 nM af hver genspecifikke forward og reverse primer (tabel S1). Cykliseringsbetingelserne var 95 ° C i 2 min, efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C i 2 s og ved 60 ° C i 30 s. De relative forskelle i PCR-produkt mængder blev bestemt ved sammenlignende tærskelcyklus metoden på glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (

GAPDH

) som en intern kontrol [27], [28]. Forsøgene blev udført in triplo. Den studerendes

t

-test blev anvendt til statistisk analyse, og en sandsynlighed værdi på

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Celleproliferationsassay

Celleproliferation blev vurderet ved anvendelse af et kit, der indeholder WST-8 ((2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H tetrazolium, monosodium salt; Nacalai Tesque,. Kyoto, Japan) BicR, LNCaP, VCap og 22Rv-1-celler blev podet i 96-brønds plader ved densiteter på 2000, 4000, 16.000, og 4000 celler pr henholdsvis i dyrkningsmedium, og transficeret med siRNA målretning enten en kandidat-gen eller luciferase (siLuc) (10 nM hver) under anvendelse af lipofectamin RNAiMAX på dag 0. på 12 timer efter transfektion blev cellerne overført til dyrkningsmedium indeholdende 1 uM bicalutamid eller vehikel. Ved de angivne tidspunkter efter transfektion 10 pi af et reagens indeholdende WST-8 blev tilsat til hver brønd, og cellerne blev inkuberet i 2 timer ved 37 ° C. absorbansværdierne for hver brønd blev målt ved 450 nm på en Multiskan FC ELISA-læser ( Thermo Scientific; Ulm, Tyskland) [23], [28]. Repræsentative resultater fra 3 uafhængige forsøg er vist som middelværdi ± s.d. af triplikerede brønde. Studerendes

t

-tests blev anvendt til statistisk analyse, og

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Cell-cyklus analyse

LNCaP og BicR celler blev transficeret med siRNA (10 nM) i 12 timer. Cellernes medier blev ændret til medier indeholdende bicalutamid (1 uM) eller vehikel, og celler blev dyrket i yderligere 36 timer. Celler blev vasket en gang med PBS og fikseret i 70% ethanol. De blev derefter vasket to gange med PBS og behandlet med 0,2 ug /uL RNase A i 30 min. Endelig blev de farvet med 5 pg /ml propidiumiodid (Sigma-Aldrich). Prøver blev kvantificeret under anvendelse af et FACScalibur (Becton Dickinson, Cockeysville, MD, USA) baseret på DNA-indhold, og resultaterne blev analyseret med CellQuest-software (Becton Dickinson) for at bestemme de procentdele af celler i G0 /G1, S og G2 /M faser [28], [29].

Bioinformatik

ONCOMINE database er en kræft microarray database og online data-mining platform til formål at lette opdagelse fra genom-dækkende udtryk analyser [30]. Den ONCOMINE database (https://www.oncomine.org/resource/login.html) blev søgt efter kandidatgener, der er opreguleret i prostatakræft versus normal prostatavæv med mindst 2-fold (

P

0,5-fold ved en tærskel på

P

0,01) sammenlignet med køretøj behandling, som vist i vulkan-plot-analyse (figur 1B og tabel 1). Denne shRNA screeningsanalyse var nyttigt at udtrække gener, der blev formodet involveret i bicalutamid modstand.

(A) Skematisk fremstilling af shRNA screening. LNCaP-celler blev inficeret med en lentiviral shRNA bibliotek og yderligere dyrket med eller uden bicalutamid i 1 måned. Individuelle integrerede shRNA beløb blev kvantificeret ved microarray. (B) Volcano plot af microarray data, som genereres ved clustering baseret på sonder, der blev beriget eller depleteret (fold forandring 0,5;

P

0,01) i bicalutamid-behandlede celler i forhold til vehikelbehandlede celler .

Validering af kandidatgener

for at vurdere effekten af ​​de enkelte gener udvalgt af shRNA screening på prostatakræft cellebiologi, den knockdown effekt af tilgængelige siRNAs målrettet til 19 af de 25 kandidatgener blev bedømt ved kvantitativ revers transkription (QRT) -PCR. Tretten af ​​de 19 siRNA’er reducerede ekspressionen af ​​deres tilsvarende målgener ved 37-94% (tabel 1). Dernæst blev effekten af ​​disse siRNAs på celleproliferation i bicalutamid-resistent LNCaP (BicR) celler vurderet ved anvendelse af WST-8 celleproliferationsassay (figur 2). Resultaterne indikerede, at lyddæmpning af

RPL31, HIST1H2BD

, og

ADAMTS1

betydeligt undertrykt celleproliferation i BicR celler ved . 50% i forhold til at styre siRNA

Vækst hæmning af BicR celler ved siRNA målretning

RPL31

(siRPL31),

HIST1H2BD

(siHIST1H2BD), og

ADAMTS1

(siADAMTS1) blev vist. Celler blev transficeret med 10 nM siRNA i dyrkningsmedium. Tolv timer efter transfektion blev cellerne derefter yderligere dyrket i medium indeholdende 1 uM bicalutamid. WST-8 celleproliferationsanalyser blev udført ved de angivne tidspunkter efter transfektion. Absorbansen af ​​brøndene i pladerne blev målt under anvendelse af en mikropladelæser ved 450 nm. Data er præsenteret som middelværdi ± s.d. (N = 3; *,

P

0,05, **,

P

0,01).

opreguleret udtryk for

RPL31, HIST1H2BD

, og

ADAMTS1

i BicR celler

Dernæst vi evaluerede ekspressionsniveauerne af

RPL31, HIST1H2BD

, og

ADAMTS1

mRNA i LNCaP og BicR celler ved QRT-PCR. Disse tre gener blev væsentligt overudtrykt i BicR celler sammenlignet med parentale LNCaP-celler (figur 3A). At undersøge, om

RPL31, HIST1H2BD

, og

ADAMTS1

ekspressionsniveauerne blev ændret i kliniske prøver prostatakræft, vi vurderede udtryk status af disse gener baseret på ONCOMINE microarray datasæt [30]. I en sammenligning af prostatacarcinom prøver og normale prostataprøver ved en tærskel på mindst 2-fold ændring (

P

0,01) (figur 3B),

RPL31

opregulering blev observeret i den undersøgelse, som Tomlins og kolleger [35]. I et RNA-sekventering studie integreret i The Cancer Genome Atlas [31], [32],

RPL31

udtryk blev også forhøjet i prostatakræft sammenlignet med normale prostata væv (Figur 3C). For

HIST1H2BD

, opregulering blev vist i et datasæt, mens nedregulering blev vist i en anden (data ikke vist). Desuden

ADAMTS1

ekspression blev reduceret i prostatacancer hos nogle datasæt (data ikke vist). Disse resultater antyder, at

RPL31

spiller en rolle i prostatakræft progression, herunder bicalutamid modstand. At studere celle væksthæmmende effekter af siRPL31 i forskellige prostatacancerceller, VCap, 22Rv-1, og LNCaP-celler blev analyseret ved anvendelse af et WST-8 assay. siRPL31 undertrykt spredning af disse celler (figur S1).

(A) Expression niveauer af

RPL31

,

HIST1H2BD

, og

ADAMTS1

mRNA vurderet ved kvantitativ revers-transkription-PCR-analyse (QRT-PCR) med genspecifikke primere. Data er normaliseret til

GAPDH

og vist som gennemsnit ± standardafvigelse (N = 3; **,

P

0,01). (B)

RPL31

mRNA rigeligt udtrykt i kliniske prostata karcinom væv sammenlignet med normale prostata væv (af 2 gange)., Som hentes fra datasæt ved Tomlins

et al

i ONCOMINE database [30]. Normal: Normal prostata væv, PCa: prostatakræft, PIN-kode: prostata intraepitelialneoplasi. (C)

RPL31

mRNA-ekspression er forhøjet i kliniske prøver prostatakræft

versus

normale prøver i en undersøgelse af RNA-sekventering i The Cancer Genome Analysis [31], [32].

RPL31

regulerer celle-cyklus progression

af de siRNA’erne undersøgte, si

RPL31

var den mest effektiv til at undertrykke BicR celleproliferation. Derfor vi yderligere undersøgt patofysiologiske rolle

RPL31

i prostata kræftceller. Celle cyklus analyse af BicR celler viste, at

RPL31

knockdown signifikant øget andelen af ​​celler i G0 /G1 fasen, mens faldende andel i S-fasen, sammenlignet med kontrol siLuc behandling (figur 4A og 4B).

RPL31

Knockdown også inducerede lignende cellecyklus profil ændringer i LNCaP-celler (figur 4C og 4D). Disse resultater viser, at

RPL31

knockdown væsentligt undertrykt cellecyklusprogression af BicR celler såvel som LNCaP celler.

(A) Knockdown af

RPL31

i BicR celler øget andelen af celler i G0 /G1 og faldt andelen af ​​dem i S-fase. Celler blev transficeret med siRPL31 eller siLuc i dyrkningsmedium i 48 timer. Celler blev derefter vasket med PBS, farvet med propidiumiodid og underkastet FACS-analyse. (B) De procentdele af BicR celler i S, blev G0 /G1, og G2 /M-fase bestemt ved anvendelse af CellQuest software og er vist som gennemsnit ± S.D. (N = 3; *,

P

0,05, **,

P

0,01). (C) Knockdown af

RPL31

faldt spredning af LNCaP celler. Celler blev behandlet på samme måde som beskrevet i (A). (D) De procentdele af LNCaP celler i S, blev G0 /G1 og G2 /M faser bestemmes ved hjælp CellQuest software og er vist som gennemsnit ± standardafvigelse (N = 3; **,

P

0,01).

RPL31 modulerer udtryk for p53 og MDM2 samt p53 protein nedbrydning

For at belyse mekanismerne bag rolle RPL31 i celle-cyklus progression af prostata kræftceller undersøgte vi effekten af ​​

RPL31

knockdown på ekspressionen af ​​celle-cyklus regulatorer, herunder p53, MDM2 og p21. Interessant nok proteinniveauer af tumor suppressor p53 [19], [29], [36] – [40] og dets nedstrøms celle-cyklus negativ regulator p21 [20] blev forstærket af

RPL31

knockdown i BicR celler og LNCaP-celler (figur 5A). Udtrykket af MDM2 protein, en kendt E3 ubiquitinligase målrette p53 [21], [36], [37], blev også forbedret på

RPL31

knockdown.

(A) Knockdown af RPL31 øger p53, MDM2, og p21-proteinekspression. LNCaP og BicR celler blev transficeret med siRPL31 eller siLuc i 48 timer. Celleekstrakter blev udsat for SDS-PAGE og western blot-analyse under anvendelse af de angivne antistoffer. (B) RPL31 reguleret nedbrydningen af ​​p53-protein. BicR celler blev transficeret med siRPL31 eller siLuc i 60 timer og behandles med 50 ug /ml cycloheximid (CHX) for den angivne tid. Celleekstrakter blev analyseret ved western blotting. (C) p53-protein-niveauer blev kvantificeret ved densitometri og normaliseret til niveauet af den tilsvarende β-actin protein og vist som middelværdi ± s.d. (N = 3; *,

P

0,05).

Vi derefter vurderet, om

RPL31

lyddæmpning påvirket nedbrydningen af ​​p53 i prostata kræftceller. Proteinniveauer af p53 blev kvantificeret ved western blot-analyse i BicR celler behandlet med

RPL31

siRNA og cycloheximid, en inhibitor af proteinsyntese (figur 5B). p53 proteinniveauer blev normaliseret til niveauerne af det tilsvarende β-actin under anvendelse af densitometri (figur 5C). p53 blev stabiliseret mere i

RPL31

-silenced BicR celler end i siLuc-behandlede celler.

p53 delvist medierer de cellulære virkninger af RPL31

Vi næste undersøgt virkningerne af

RPL31

knockdown på

p53

MDM2

mRNA ekspressionsniveauer i BicR og forældrenes LNCaP celler.

p53

mRNA niveauer blev ikke øget i BicR og LNCaP celler efter

RPL31

knockdown (figur 6A, figur S2). Dette fund tyder på, at

RPL31

silencing opreguleret p53-ekspression på proteinniveauet. I modsætning hertil

MDM2

p21

mRNA niveauer blev forøget på

RPL31

knockdown i BicR og LNCaP-celler (Figur 6A, figur S2), i overensstemmelse med opregulering af disse proteiner i begge cellelinier (figur 5A).

(A) Knockdown virkninger af RPL31 og p53 på MDM2 og p21 mRNA. BicR celler blev transficeret med siRPL31, sip53, siRPL31 plus sip53 eller siLuc. QRT-PCR for RPL31, p53, MDM2, og p21 mRNAwas udført. Eksperimenter blev udført tre gange; mRNA-ekspression er normaliseret til GAPDH og vist som gennemsnit ± S.D. (N = 3; **,

P

0,01). (B) sip53 delvist aflyst undertrykkelsen af ​​cellevækst induceret af siRPL31. BicR celler blev transficeret med 10 nM hver siRPL31, sip53, siRPL31 plus sip53 eller siLuc og dyrket med medium indeholdende 1 uM bicalutamid. WST-8 celleproliferationsassay blev udført ved de angivne tidspunkter. Absorbanserne af brøndene i pladerne blev målt under anvendelse af en mikropladelæser ved en 450 nm. Data er præsenteret som middelværdi ± s.d. (N = 4; **,

P

0,01).

Vi yderligere kontrolleres, hvis p53 bidraget væsentligt til væksten hæmning medieret af

RPL31

lyddæmpning . Det er bemærkelsesværdigt, at RPL31 knockdown-medieret opregulering af

MDM2

p21

mRNA i BicR celler var signifikant reduceret med p53 knockdown i kombination med RPL31 knockdown (figur 6A). Virkningerne af disse siRNAs på BicR celleproliferation blev vurderet ved anvendelse af WST-8 assay (figur 6B). Resultaterne viste, at

p53

RPL31

knockdown delvist øget celleproliferation sammenlignet med

RPL31

knockdown alene i tilstedeværelse af bicalutamid. I LNCaP celler, kombination af sip53 og siRPL31 også delvist vendt virkningerne af siRPL31 på

MDM2

p21

mRNA ekspression niveauer samt cellevækst (figur S2). Vi derefter undersøgt effekten af ​​kombinatorisk brug af siRPL31 og sip53 på cellecyklus profil BicR celler (Figur S3). Dobbelt knockdown af

RPL31

p53

øget andelen af ​​celler i S-fasen i forhold til

RPL31

knockdown alene.

Vi genererede LNCaP celler, der udtrykker eksogene RPL31 ved stabil transfektion at undersøge effekten af ​​RPL31 overekspression på p53 protein (figur S4A). Det forlyder, at p53-protein er stabiliseret af en kemoterapi stof docetaxel i LNCaP-celler [41]. Vi undersøgte p53 proteinniveauer i denne situation og fundet, at p53-proteinet niveauer blev reduceret i RPL31-overudtrykkende LNCaP-celler sammenlignet med virkningen af ​​vektor-udtrykkende celler (Figur s4b). Disse gain-of-funktion forsøg indikerede også, at RPL31 negativt kunne regulere protein ekspressionsniveauer af p53. Desuden har vi undersøgt, om RPL31 udtryk er reguleret af bicalutamid (Figur S5). Især blev det vist, at bicalutamid stærkere induceret RPL31 mRNA-ekspression i BicR celler end i LNCaP-celler siden, ved 24 og 48 timer efter bicalutamid behandling var de RPL31 mRNA-niveauer var signifikant højere i BicR celler end LNCaP-celler (

P

. 0,01)

diskussion

i den foreliggende undersøgelse, vi identificeret gener modulerer bicalutamid reaktion i prostata kræftceller via funktionel screening ved hjælp af en lentiviral shRNA bibliotek kombineret med siRNA eksperimenter. Ud af ~10,000 shRNAs der blev transduceret ind i LNCaP celler, valgte vi en lille undergruppe af shRNAs med væsentligt reduceret ekspression i celler efter en måned bicalutamid behandling. Fra de 13 gener er omfattet af den valgte shRNAs, fandt vi, at knockdown af

RPL31, ADAMTS1

, og

HIST1H2BD

signifikant hæmmede spredning af BicR prostata kræftceller. Vi fokuserede på karakterisering af ribosomale protein RPL31 i prostatakræft biologi, som nedregulering af

RPL31

væsentligt reduceret cellecyklusprogression af BicR celler. Vi fandt, at ekspressionsniveauet af

RPL31

mRNA blev signifikant forhøjet i BicR celler sammenlignet med LNCaP-celler, og kliniske undersøgelser viser, at RPL31 ekspression i prostatacarcinom er højere end i benigne prostatavæv. Tilsammen disse resultater tyder på, at RPL31 positivt bidrager til udvikling og fænotype for prostatakræft.

Vi søgte at bestemme den mekanisme, som

RPL31

knockdown alvorligt vækst anholdt BicR prostata kræftceller. RPL31 er en komponent af den store subunit af ribosomet i eukaryoter [15], [17], [18], [42]. Fordi bicalutamid behandling i prostatacancerceller svækker ribosomale RNA-syntese [43],

RPL31

knockdown kunne yderligere forværre dysregulering af ribosomale funktion i tilstedeværelse af bicalutamid. Desuden

RPL31

knockdown kunne mediere extraribosomal funktioner og modulere pathway tumorsuppressor p53. Extraribosomal funktioner er andre end proteinsyntese, herunder DNA-replikation, transkription, reparation, RNA-splejsning, cellevækst, apoptose, differentiering og cellulær transformation [33] cellulære aktioner, [34], [42], [44] – [49] . Især til relevansen af ​​extraribosomal funktioner cellevækst og celledeling blev bekræftet af den iagttagelse, at forringelse af disse processer opregulerer p53 og forårsager celle-cyklus anholdelse [36], [37]. I den foreliggende undersøgelse,

RPL31

knockdown væsentligt forøgede protein niveauer af p53, p21, og MDM2. Det er også bemærkelsesværdigt, at RPL31 knockdown fugtet nedbrydningen af ​​p53-protein ved cycloheximid behandling.