PLoS ONE: Comparative Genomic og transkriptom Analyser af LNCaP og C4-2B prostatakræft Cell Lines

Abstrakt

The LNCaP og C4-2B cellelinjer danner en glimrende præklinisk model til at studere udviklingen af ​​metastatisk kastrationsresistent prostatacancer, idet C4-2B celler blev afledt fra en knoglemetastaser, der voksede i nøgne mus efter podning med LNCaP-afledte, kastrationsresistent c4-2 celler. Exome sekventering opdaget 2188 og 3840 mutationer i LNCaP og C4-2B celler henholdsvis hvoraf 1784 blev fundet i begge cellelinier. Overraskende, de parentale LNCaP-celler har over 400 mutationer, som ikke fandtes i C4-2B genomet. Mere end halvdelen af ​​mutationerne fundet i exomes blev bekræftet ved at analysere RNA-seq data, og vi observeret, at de udtrykte gener er mere udsat for mutationer end ikke-udtrykte gener. De transcriptomes afslørede også, at 457 gener viser øget ekspression og 246 gener viser nedsat udtryk i C4-2B forhold til LNCaP celler. Ved at kombinere listen over C4-2B-specifikke mutationer med listen over differentielt udtrykte gener, vi har registreret væsentlige ændringer i de centrale vedhæftning og ECM-receptor interaktion veje. Integration af disse veje konvergerer på myosin let kæde-genet (MLCK), som kunne bidrage til metastatiske potentiale C4-2B celler. Afslutningsvis giver vi omfattende databaser for muterede gener og differentielt udtrykte gener i LNCaP og C4-2B prostatakræft-cellelinier. Disse kan være nyttige for andre forskere ved hjælp af disse celle modeller

Henvisning:. Spænder L, Helsen C, Clinckemalie L, Van den Broeck T, Prekovic S, Joniau S, et al. (2014) Sammenlignende genomiske og transkriptom Analyser af LNCaP og C4-2B Prostata Cancer cellelinjer. PLoS ONE 9 (2): e90002. doi: 10,1371 /journal.pone.0090002

Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: 9. december 2013; Accepteret: 24 Jan 2014; Udgivet: 28 februar 2014

Copyright: © 2014 Spænder et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde var muligt takket være forskningsbevillinger fra FWO-Vlaanderen (G.0684.12N), fra den belgiske føderale regering (Kræftplan KPC_29_023) og fra KU Leuven (OT /11/081). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den hyppigst diagnosticerede kræft og tredje hyppigste dødsårsag blandt mænd i Europa [1]. På trods af sin udbredelse, er et flertal af mænd diagnosticeret med lokaliseret, lav risiko PCa og ville aldrig dø på grund af deres kræft, når venstre ubehandlet [2]. Men patienter med høj risiko og især metastatisk sygdom har en langt højere risiko for at dø af PCa med rapporterede PCa-specifikke dødelighed på op til 28,8% for høj risiko for sygdom og 66,1% for metastatisk sygdom på 10-års opfølgning [ ,,,0],3]. De seneste epidemiologiske data har vist, at næsten 10% af alle PCA patienter er metastatisk på tidspunktet for diagnosen, hvilket understreger den kliniske betydning af at udvikle en bedre indsigt i de underliggende mekanismer for metastatisk PCa [4]. De genomiske og transkriptom ændringer, der følger omdannelsen af ​​lokaliseret sygdom til metastatisk kastrationsresistent PCa bliver opdaget, men er blokeret af vanskelighederne med at opnå biopsier fra de forskellige stadier af sygdommen [5], [6].

som et alternativ cellelinier kan anvendes som modeller til at studere overgangen til metastatisk kastrationsresistent PCa [7]. En af de bedst undersøgte PCA cellelinier utvivlsomt er LNCaP-cellelinien. Denne cellelinie blev afledt af en nål biopsi taget fra venstre supraclavicular lymfeknude af en 50-årig kaukasisk mand [8]. Denne patient led af en hurtigt frem PCa med minimal og korte svar på hormonbehandling og ingen respons på kemoterapi. Efterfølgende blev c4-2 sublinjen afledt af en tumor, der er udviklet i kastrerede nøgne mus injiceret med LNCaP-celler. Endelig blev C4-2B cellelinie afledt fra en knoglemetastaser efter ortotopisk transplantation af c4-2 celler i nøgne mus [9], [10]. Med andre ord, C4-2B er en metastatisk derivat af LNCaP-celler. Den LNCaP og C4-2B progression model derfor efterligner sygdom fremrykkende fra dårligt tumorigen, androgen-følsomme og ikke-metastatisk i LNCaP, til metastatisk og androgen-ufølsom (eller kastrationsresistent) i C4-2B.

for disse to cellelinjer, ændringer i karyotype og genomisk kopiantal, nogle punktmutationer, insertioner og deletioner er blevet beskrevet, men sammenligningen af ​​exome sekvenser er ikke rapporteret endnu [9], [11]. Det første mål med denne undersøgelse var derfor at opnå omfattende exome data for LNCaP og C4-2B celler. Selvfølgelig er en sammenligning af disse mutationsmønstre landskaber giver kun mening i overværelse af oplysninger på aktiviteten af ​​de berørte gener. Den blev opnået fra transkriptom sidstnævnte analyser.

Et første skridt til katalog punktmutationer, indsættelser og sletninger i LNCaP celler blev rapporteret i Spænder

et al.

[12]. Her rapporterer vi om en sammenlignende hel exome og transkriptom sekventering undersøgelse af både LNCaP og C4-2B cellelinjer. Så vidt vi ved, er dette den første direkte og grundig sammenligning af denne art. Desuden kan disse databaser være meget oplysende for prækliniske studier, for hvilke både LNCaP- og C4-2B celler der bliver brugt. De kan også anvendes til at frembringe hypoteser om den metastatiske proces, som eksemplificeret for MLCK pathway.

Materialer og metoder Salg

DNA isolation

LNCaP-cellelinje blev opnået fra American Type Culture Collection, mens C4-2B cellerne var en slags gave fra Dr. M. Stallcup (Norris Comprehensive Cancer center, University of Southern California, USA) [9]. Begge cellelinier blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute (RPMI, Gibco, Invitrogen), der indeholder 2 g /l glucose suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum (FCS). Passagen antal LNCaP og C4-2B celler var 48 og 42. Højmolekylært DNA blev ekstraheret fra dyrkede celler under anvendelse af GenElute Mammalian Genomisk DNA Miniprep kit (Sigma-Aldrich). Efter rensning ved anvendelse ethanolfældning med ammoniumacetat blev koncentrationen kvantificeret ved hjælp af en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific) og Bioanalyzer (Agilent).

Hele exome sekventering

Hele-exome capture de LNCaP-celler blev udført ved anvendelse af SureSelect Humant Alle Exon System (Agilent) ifølge producentens instruktioner. Parret-ende, blev 100 bp lang sekventering læser genereres ved hjælp af GAIIx sequencer (Illumina). Den exome fange af C4-2B cellerne blev udført ved hjælp af SeqCap EZ Exome version 2 kit (Roche NimbleGen) og parret ende 100 bp lange læser blev genereret ved hjælp af HiSeq2000 (Illumina).

Kvalitetskontrol blev udført hjælp FastQC software (version 0.10.1) (https://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/) og Picard (version 1.22) (https://picard.sourceforge.net/). Sekventering læser blev justeret til den menneskelige henvisning genom (hg19, NCBI Build 37) ved hjælp af BWA, hvor læsninger blev trimmet, når kvaliteten var under 15 (version 0.5.9) [13]. Alignment filer blev yderligere behandlet med Genome Analysis Toolkit (GATK) før variant kald og omfattede to eksemplarer fjernelse, lokale kursjustering omkring kendte indels og base kvalitet rekalibrering (version 1.0.5777) [14]. Prøverne blev fyldt individuelt til GATK UnifiedGenotyper software. Punktmutationer og ekspressionssystemer data blev afbildet under anvendelse af Circos-software (version 0.52) [15]. Sammenligning af punktmutationer blev udført ved hjælp Venny (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html).

RNA isolation

LNCaP og C4-2B celler , med passagetal 30 og 43 henholdsvis, blev udpladet i 6-brønds plader (1,75 millioner celler /brønd) og behandlet natten over (18 timer) med 1 nM R1881 (Perkin Elmer). Cellerne blev opsamlet og vasket med PBS. Cellepelleten blev anvendt til at ekstrahere total RNA under anvendelse af RNeasy Mini Kit fra Qiagen. Kvaliteten og renheden af ​​RNA blev inspiceret på en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer. Integriteten af ​​RNA blev kontrolleret på Bioanalyzer på Genomics Kerne af UZ Leuven.

RNA-sekventering

Efter valg af polyA + RNA, blev RNA konverteret til cDNA-biblioteker ved hjælp af TruSeq RNA Sample forberedelse kit (Illumina). Efter sekventering parret ende kort læser af 100 bp med HiSeq2000 (Illumina) blev normaliserede gen tæller (Fragmenter Per kb pr Million af kortlagt læser, FPKM) beregnet via Tuxedo pipeline (Tophat – Manchetknapper – cummerbund) [16]. Kort sagt, blev RNA-seq data tilpasset til referencen genomet under anvendelse TopHat (version 2.0.6), der udnytter Bowtie som algoritmisk kerne. Den Manchetknapper pakke (version 2.0.2) samles de udskrifter og opdaget differentielt udtrykte gener og udskrifter. Cummerbund (version 2.0.0) blev anvendt til at visualisere genekspression data. Variant telefonerer via RNA-seq data blev udført med GATK (version 2.2), efter justering med Tophat [14]. RNA-seq for begge cellelinier blev udført tredobbelt, som muliggør identifikation af differentielt udtrykte gener. For variant ringer blev tredobbelte aggregeret at opnå højere dækning. Pathway-Express blev anvendt til bestemmelse, fra en liste af gener, enten i et specifikt pathway flere gener er involveret, end det kunne forventes ved en tilfældighed [17].

Kvantitativ RT-PCR

cDNA blev genereret fra RNA (1 ug) med Random hexamer primere og RevertAid revers transkriptase (Thermo Scientific). Kvantitativ realtids-PCR blev udført under anvendelse Platinum SYBR Green QPCR Supermix-UDG (Invitrogen). Resultater blev normaliseret til husholdning gen β-actin og hver prøve blev analyseret tredobbelt. Sekvensen af ​​de anvendte primere er: β-actin fremadrettet 5′-ACCCAAGGCCAACCG-3 ‘og revers 5′-TGTACGTTGCTATCCAGGCTGT-3′, TMPRSS2 fremadrettet 5’-CCTGCATCAACCCCTCTAACTG-3 ‘og revers 5′-AGGCGAACACACCGATTCTC-3′, IGF1 fremad 5’-TGGATGCTCTTCAGTTCGTG-3 ‘og omvendt 5′-TCATCCACGATGCCTGTCT-3′, IGF1R frem 5’-GTACAACTACCGCTGCTGGA-3 ‘og omvendt 5′-TGGCAGCACTCATTGTTCTC-3’.

tiltrædelsespartnerskaber numre

Binary sekvens alignment /kort (BAM) filer fra hele exome sekventering data samt RNA-seq data blev deponeret i databasen af ​​den europæiske Nucleotide Archive med tiltrædelsen nummer PRJEB4877 og er tilgængelige via https://www.ebi.ac.uk /ena /data /view /PRJEB4877. prøvenumre tiltrædelsesforhandlingerne er ERS363578 og ERS363580 for hele exome sekventering data for LNCaP og C4-2B hhv. For RNA-sekventering, prøvenumre tiltrædelsesforhandlingerne er ERS363579 og ERS363581 for LNCaP og C4-2B celler hhv.

Bekræftelse af ikke-synonyme varianter

Varianter af interesse blev bekræftet ved Sanger sekventering af amplificerede PCR-produkter. Primere specifikke for regionen indeholdende variant, der skal undersøges, blev konstrueret under anvendelse af NCBI Primer-Blast (https://ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) og opnået fra Integrated DNA Technologies. Polymerasekædereaktioner blev udført ifølge standardprotokoller under anvendelse af Taq-DNA-polymerase (Thermo Scientific). Amplifikation af specifikke PCR-fragmenter blev bekræftet ved agarosegelelektroforese. Sanger sekventering blev udført på LGC Genomics. Sekvens sporingsfiler blev analyseret ved hjælp kulørtheder Lite.

Resultater

Afsløring punktmutationer med hele exome sekventering

Vi udførte en hel-exome re-sekventering studie for både LNCaP og C4 2b celler ved hjælp 100 basepar, parret ende læser på Illumina platformen. Dette genererede 49 og 80 millioner læser for LNCaP og C4-2B (Tabel S1); for LNCaP-celler, blev 74% af exome dækket mindst 20x, versus 88% for C4-2B celler. Sekventering egenskaber og kvalitetskontrol data er ens for begge datasæt (tabel S1 og figur S1)

blev opdaget De punktmutationer i exomes bruge GATK rørledning, som yderligere filtrering blev anvendt:. Kun mutationer, som havde mindst 12 × dækning og en mutation frekvens over 30% blev taget i betragtning. Data blev også filtreret for fravær af basepar ændring i dbSNP130. Endvidere blev streng forspænding elimineret manuelt (tabel S2). Dette resulterede i lister over 2188 og 3840 ikke-synonym punktmutationer i LNCaP og C4-2B celler (tabel S3-4-). Kun 1784 mutationer var almindelige mellem begge cellelinier med tydelig angivelse af ophobning af mere end 2000 yderligere mutationer i C4-2B genom. Denne store forskel i mutation belastning kan ikke forklares med den lidt lavere dækning af LNCaP exome. Mest sandsynligt, har disse yderligere C4-2B mutationer opstået under tumor progression og knoglemetastaser.

Afsløring punktmutationer i transkriptom sekventering

Transkriptomet sekventering blev udført i første omgang at bestemme forskellen genekspression. RNA blev isoleret fra LNCaP og C4-2B celler der var blevet behandlet i 18 timer med den syntetiske androgen methyltrienolone. Vi opnåede 157 og 131 mio 100 basepar, parret ende læser for LNCaP og C4-2B celler. I disse læser, procentdelen af ​​ribosomale, introniske og intergeniske baser var meget lav (1,6% i alt), hvilket resulterer i en høj dækning af mRNA baser (tabel S1). Som et mål for kvaliteten af ​​transkriptomet data, er variationen i dækning langs hver transkript vist i figur S2. Dette viser ingen 5 ‘eller 3’ forspænding selvom der er en noget lavere dækning nær enderne af transkripterne.

Arbejdsgangen til påvisning og efterfølgende filtrering af punktmutationer den samme som blev anvendt til exome sekventering beskrevet højere. Vi fandt 1505 og 1882 mutationer i LNCaP og C4-2B celler henholdsvis hvoraf 1054 blev detekteret i begge cellelinier (tabel S5); 451 var specifikke for LNCaP og 828 for C4-2B.

Sammenligning exome med transkriptom sekventering data

En sammenligning af allel-specifikke læse tæller fra genom og transkriptom sekventering data for alle registrerede punktmutationer kan bruges som et mål for sekventering kvalitet. Størstedelen af ​​mutationer har en lignende allel frekvens i både DNA og RNA-sekventering (figur 1A-B). Selv de få homozygote mutationer med allel frekvens tæt på 1 i exome data, har en lignende allel frekvens i RNA sekventering data.

A-B. Sammenligning af varianten allele hyppighed af mutationer påvises under anvendelse hele exome og transkriptom sekventering. Sorte prikker er mutationer, der er blevet fundet af både exome sekventering og transkriptom sekventering; røde prikker blev kun detekteret ved exome sekventering og grønne prikker kun ved RNA-sekventering. For variant calling, blev en afskæringsværdi på 30% variant allel frekvens anvendes. Ved siden af ​​grafen en figur viser antallet af mutationer fra exome sekventering transkriptom sekventering og antallet fundet af begge metoder. Grafer er vist for LNCaP (A) og C4-2B celler (b). C. Overlapning af alle mutationer observeret af exome og transkriptom sekventering i LNCaP og C4-2B celler.

Kombinationen af ​​både exome og transkriptomet sekventering resulterede i alt 2244 mutationer fælles for begge cellelinier (figur 1C). Desuden er antallet af LNCaP-specifikke mutationer (546) er meget lavere end for C4-2B-specifikke ændringer (2129), hvilket igen indikerer at mutationer har akkumuleret under progression til C4-2B. RNA-sekventering bekræftede kun 41 og 35% af de exoniske varianter identificeret ved hele exome sekventering af LNCaP og C4-2B. Dette tal steg til 52%, da vi tog kun de udtrykte gener i betragtning (FPKM 1). Omvendt, 60 og 71% af LNCaP og C4-2B varianter identificeres ved transkriptom sekventering henholdsvis blev bekræftet af exome sekventering.

Nukleotidsubstitutioner

De forskellige typer af overgange og transversioner i exomes og transcriptomes af LNCaP og C4-2B cellelinjer kan give indsigt i de mutationsmønstre processer, der fandt sted under udviklingen af ​​disse celler. Vi observerede, at de fremherskende mutationer (40-42%) i begge cellelinier var G-til-A og C-til-T-overgange (figur 2).

Procentdele af mutationer i hver af de seks mulige mutation klasser er repræsenteret for exome sekventering og transkriptom sekventering data for både LNCaP og C4-2B celler.

den mest udbredte form for RNA redigering i højere eukaryoter er omdannelsen af ​​adenosin til inosin. Som inosin læses som en guanin efter sekventering denne redigering typen manifesterer sig i RNA-sekventering som en A-til-G udskiftning [18]. Men i vores datasæt, antallet af A-til-G overgange i exome og transkriptomet sekventering data er sammenlignelige argumentere imod en vigtig rolle af RNA redigering (figur 2).

Validering af punktmutationer

i alt 80 mutationer i exome data fra LNCaP (47) og C4-2B (33) blev valideret ved manuel Sanger re-sekventering (figur 3). Generne, der blev udvalgt til validering blev placeret højt i en funktionel prioriteringen af ​​alle muterede gener i C4-2B cellelinje (beregnet som i [12]). Ni af disse mutationer (i PIK3R1, TP53BP1, PRKCQ, CHEK2, RIPK2 og KLK3) blev detekteret ved DNA og RNA-sekventering i begge cellelinier, og disse blev bekræftet med Sanger sekventering på genomisk og komplementært DNA fra LNCaP og C4-2B. Når vi testede syv af de C4-2B exome mutationer (PIAS1 P216S og K380M, MKNK2 L229M og T244N, STAT5A I85N og MYO18A A1571T og Q646 *), blev de ikke opdaget af LNCaP exome sekventering, men deres tilstedeværelse i LNCaP genom var tydeligt i RNA sekventering data og bekræftes også af Sanger sekventering på genomisk og komplementære DNA.

Validering blev udført ved hjælp af PCR på både genomisk DNA og kopi-DNA, efterfulgt af konventionel Sanger sekventering. Den første og anden søjle repræsenterer navnet af genet og aminosyren substitution henholdsvis. Den tredje, fjerde, syvende og ottende søjle repræsenterer næste generation sekventering resultater for hele exome og transkriptom sekventering, som derefter valideret med Sanger sekventering i femte, sjette, niende og tiende søjle. A + angiver, at blev opdaget mutationen, a – angiver, at mutationen ikke blev registreret, mens 0 betyder, at ingen PCR-produkt kan forstærkes og /, at denne holdning ikke var dækket af næste generation sekventering

.

Vi har også påvises og bekræftes C4-2B specifikke mutationer i CASP9, FLNB, POLR2A og STAT5A i genomisk DNA og cDNA af C4-2B celler, men ikke i LNCaP celler. Endelig mutationer i gener, der ikke er udtrykt i LNCaP eller C4-2B (KIT og GRAP) kunne kun blive bekræftet på genomisk DNA.

Som konklusion GATK UnifiedGenotyper for variant kald, som vi sammen med vores omfattende filtrering genereret få falske positiver. Lignende resultater blev vist for nylig af Liu

et al.

Ved at sammenligne GATK med SAMtools, Atlas 2 og glftools [19]. Desuden skal det bemærkes, at vores valideringer indikerede, at exome analyser ikke afdække alle mutationer, men de variationer, der blev opdaget sandsynligvis er ægte mutationer.

Differential genekspression mellem LNCaP- og C4-2B celler

Vi næste ønskede at søge efter differentielt udtrykte gener mellem de to cellelinier, da disse kan give et fingerpeg om mekanismerne bag udviklingen af ​​LNCaP-celler i C4-2B celler. Differential udtryk blev kaldt af Tuxedo algoritme baseret på RNA-seq data for triplikater for hver cellelinje, med yderligere filtrering af log2-gange ændring 2 og q-værdi 0,001. Alle replikater var meget ens, som det kan ses i figur S3. Desuden den kvadrerede variationskoefficient, der er et normaliseret mål for cross-replikat variabilitet, er under 0,05 for udtrykte gener.

Vores analyse resulterede i identifikationen af ​​703 differentielt udtrykte gener (Tabel S6), hvoraf 457 gener er højere udtrykt i C4-2B og 246 er højere udtrykt i LNCaP celler (Figur S2). En oversigt over placeringen af ​​differentielt udtrykte gener i hele genomet kan findes i figur 4, sammen med frekvensen af ​​punktmutationer påvist i begge cellelinier, i C4-2B celler alene eller i kun LNCaP-celler. Kvantitativ RT-PCR på fem differentielt udtrykte gener bekræftes RNA-seq data (data ikke vist).

Kromosom ideogrammer er vist omkring den ydre ring og orienteret PTER-qter i urets retning med centromerer angivet i rødt. Den ydre ring repræsenterer differentielt udtrykt gener: 457 gener med højere udtryk i C4-2B (røde prikker) og 246 gener med højere udtryk i LNCaP (blå prikker). Andre spor indeholder (udefra og ind): 2244 mutationer i fælles mellem LNCaP og C4-2B celler, 2129 mutationer specifikke for C4-2B celler og 546 mutationer specifikke for LNCaP celler vist ved tæthed pr 10 megabaser

.

Fu

et al.

allerede beskrevet nogle differentielt udtrykte gener mellem LNCaP- og C4-2B, men ingen af ​​de gener, de opdaget udtrykkes forskelligt i vores data [20]. Vi foreslår, at dyrkningsbetingelser og forskelle mellem afsløring platforme sandsynligvis forklare denne uoverensstemmelse. På den anden side er der er en betydelig overlapning af vores datasæt med andre undersøgelser, der sammenlignet LNCaP og c4-2 transcriptomes [21] – [25].

Pathway analyse af genomiske og transkriptom datasæt

LNCaP og C4-2B celler fortsat anvendes i grundlæggende og præklinisk forskning. Vi foreslår vores databaser af mutationer og differentielt udtrykte gener som vigtige inspirationskilder til yderligere forskningsprojekter. Desuden kan disse databaser nu kontrolleres for specifikke mutationer, før man begynder at bruge disse celler til at studere nogen specifik PCa-relateret vej.

Dette stykke giver et eksempel på en hypotese baseret på

in silico

analyse af vores data. Pathway-Express analyse af de C4-2B specifikke mutationer kombineret med de 703 gener udtrykkes forskelligt mellem LNCaP- og C4-2B celler viste, at de væsentligste ændringer blev fundet i ECM-receptor interaktion vej og i fokal vedhæftning. Begge veje konvergerer i opreguleret ekspression af myosin let kæde-kinase (MLCK) genet (figur 5).

Ændringer defineres som havende en forøget (rød) eller nedsat (blå) ekspression i C4-2B sammenlignet med LNCaP eller ved somatiske mutationer i C4-2B celler kun (fed sorte linjer). Overekspression af myosin let kæde kinase i C4-2B celler kan skelne dem fra LNCaP celler i celle migration og fokale vedhæftning egenskaber.

Diskussion

En høj mutation sats i LNCaP og C4- 2B celler

C4-2B celler er afledt fra en knoglemetastaser i nøgne mus inokuleret med celler, der stammer fra LNCaP-afledte, kastrationsresistent xenotransplantater kaldet c4-2. De betragtes en nyttig præklinisk model for metastatisk, kastrationsresistent og androgen receptor positiv PSA. Her giver vi for første gang sammenlignende kort over de punktmutationer detekteres i LNCaP og C4-2B celler. Endvidere selvom transkriptom analyser af LNCaP og c4-2 er blevet rapporteret, at vi ved, er dette den første transkriptom analyse af C4-2B celler.

C4-2B celler såvel som LNCaP-celler har en overraskende højt antal punktmutationer: 4373 og 2790 mutationer hhv. Ligesom i primær PCa og kastrationsresistent PCA prøver, er den mutations- spektrum domineret af G-til-A og C-til-T-overgange [26] – [28]. Det er kendt, at mismatch reparation defekter forårsage overgang mutationer, især G-til-A og C-til-T-substitutioner [29]. Derfor kan de fleste mutationer være forårsaget af det defekte fejlparringsreparationssystem i LNCaP-celler, på grund af den homozygote deletion af 3′-enden af ​​MSH2 genet [30]. Chen

et al.

Allerede beskrevet i LNCaP-celler en korrelere store ustabilitet af satellit-DNA [31].

Antallet af punktmutationer i vores cellelinjer er meget højere end den gennemsnitlige 16-33 mutationer fundet i hele exomes af PCA prøver [26], [32] – [34]. Disse cellelinier er således atypiske, men kan betragtes som en model for tilfælde af PCa, hvor mismatch reparation er defekt som beskrevet for eksempel ved Barbieri

et al.

, Hvor en enkelt PCa tumor rummede et rammeskift mutation af MSH6 genet blandt 996 andre mutationer [32]. Naturligvis sådanne højere mutationsrater ville forklare den endnu større antal mutationer, vi fandt i C4-2B sammenlignet med LNCaP. Desværre vil dette også tilsløre føreren mutationer, der kan have tillagt en overlevelse fordel under den metastatiske proces.

Link mellem mutationsrater og udtryk

For både LNCaP og C4-2B cellelinje, vi se, at højt udtrykte gener oftere indeholder punktmutationer end ikke-transskriberede gener (p 0,0001, Chi Square test, for den højeste versus laveste udtrykt tertil). Dette strider mod generelle sammenhæng mellem heterochromatin organisation og højere regionale mutationsrater i humane cancerceller [35]. Muligvis, i disse cellelinier, den åbne kromatin og forbundet transkription inducerer flere fejlparringer som normalt effektivt afhjælpes, men ikke i tilfælde af en mangelfuld mismatch repair.

Sammenligning af LNCaP og C4-2B mutationer

Vi har detekteret 1784 delte mutationer i exomes af LNCaP- og C4-2B, og 2056 C4-2B-specifikke ændringer, som giver mening, da C4-2B celler er afledt af LNCaP celler. Men opdaget vi også 404 LNCaP-specifikke ændringer, hvoraf mange blev bekræftet af vores transkriptom sekvenser. Naturligvis har de LNCaP-celler vi analyserede afveget fra de LNCaP-celler, der blev brugt oprindeligt at udvikle C4-2B celler [9]. Vi har faktisk vist tidligere, at selv LNCaP-celler fra forskellige laboratorier er genetisk forskellige, og mens vores celler blev opnået fra ATCC (passage 48) blev den C4-2B sandsynligvis afledt fra et meget tidligere passage af LNCaP-celler i 1994 [9] , [12].

forslag af en rolle MLCK i metastatiske proces

Vores data kan klart føre til hypotesen om den metastatiske proces, der fandt sted under omdannelsen af ​​LNCaP til C4 2B celler. Dette er eksemplificeret ved konvergensen af ​​en række berørte veje til en opregulering af MLCK. Faktisk er der flere publicerede forbindelser mellem MLCK og den metastatiske proces. Diskriminant analyse af mikroarrays identificeret MLCK genet som den mest informative gen for tilblivelsen proces PCa [36], og inhibering af MLCK i rotte PCA celler resulterer i reduktion af invasivitet, som hovedsagelig skyldtes forringet cellulær motilitet [37]. Inhibering MLCK i fibrosarkom, pancreascancer og brystcancerceller resulterer også i reduceret adhæsion, migrering og invasion og øget apoptose [38] – [41]. Omvendt aktivering MLCK fører til en stigning i invasion i brystcancerceller og en øget metastatisk potentiale i ikke-småcellet lungecancer [42], [43]. Den differentielle ekspression af MLCK genet i de to celler undersøgte her linier kunne derfor korrelerer med højere metastatisk kapacitet af C4-2B celler.

Konklusion

Som konklusion vore data viser klart, at der er store forskelle i antallet og fordelingen af ​​mutationer og genekspression mellem LNCaP og C4-2B celler. Eftersom disse cellelinjer universelt bruges til at studere udviklingen fra ikke-metastatiske til metastaserende PCa disse data er afgørende for forskere at korrekt fortolke deres resultater, når du bruger disse cellelinjer. Desuden vil vores databaser være meget nyttige i at udvikle nye testpræparater ideer.

Støtte Information

figur S1.

FastQC kvalitetskontrol resultater af pr basen kvaliteter. Output resultater af FastQC kvalitetskontrol software (version 0.10.1) er vist her exome og transkriptom sekventering af LNCaP og C4-2B celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090002.s001

(TIF)

Figur S2.

Normaliseret dækning af position. Den gennemsnitlige relative dækning er vist ved hver relative position langs transkriptet længde. LNCaP er afbildet i grøn, mens C4-2B er afbildet i rødt. X-aksen repræsenterer det gen længde normaliseret til 100%, hvor 0 er 5′-enden af ​​hvert transkript og 100 er 3′-enden

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090002.s002

(TIF )

Figur S3.

Heatmap af 703 differentielt udtrykte gener. Den Heatmap viser de tre gentagelser af hver cellelinje, der er meget lig. Alle differentielt udtrykte gener blev påvist ved hjælp af Tuxedo algoritmen, med q 0,001 og log2-fold ændring 2 som cut-offs. Det er klart, at størstedelen af ​​gener opreguleres i C4-2B sammenlignet med LNCaP, mens en mindre gruppe af gener nedreguleres i C4-2B

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090002.s003

(TIF )

tabel S1. .

Sequencing egenskaber

doi: 10,1371 /journal.pone.0090002.s004

(XLSX)

tabel S2. .

Filtre bruges til at identificere punktmutationer i exomes af LNCaP og C4-2B celler

doi: 10,1371 /journal.pone.0090002.s005

(XLSX)

tabel S3.

Liste over punktmutationer identificeret i exome af LNCaP celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090002.s006

(XLSX)

Tabel S4.

Liste over punktmutationer identificeret i exome af C4-2B celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090002.s007

(XLSX)

tabel S5. .

Filtre bruges til at identificere punktmutationer i transcriptomes af LNCaP og C4-2B celler

doi: 10,1371 /journal.pone.0090002.s008

(XLSX)

tabel S6.

Liste over 703 gener, der udtrykkes forskelligt mellem LNCaP og C4-2B celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090002.s009

(XLSX)

Tak

Vi er meget taknemmelige for Rita Bollen og Hilde De Bruyn for deres fremragende teknisk bistand. Vi takker vores kolleger i Molekylær Endokrinologi Laboratorium for nyttige diskussioner.