PLoS ONE: En Unifying Mekanisme for Cancer Cell Død gennem Ion Channel Aktivering af HAMLET

Abstrakt

ionkanaler og ionstrømme styre mange aspekter af vævshomeostase. Under onkogen transformation, kan kritiske ionkanal funktioner forstyrres, men bevaret tumor specifik ion fluxe mangler at blive defineret. Her anvendte vi tumordræbende protein-lipid kompleks HAMLET som en probe til at identificere ionstrømme involveret i tumorcelledød. Vi viser, at HAMLET aktiverer en ikke-selektiv kation strøm, som nåede en størrelse på 2,74 ± 0,88 nA inden 1,43 ± 0,13 min fra HAMLET ansøgning. Rapid ionstrømme var afgørende for HAMLET-induceret carcinom celledød som hæmmere (amilorid, bacl

2), forhindrer ændringer i fri cellulære Na

+ og K

+ koncentrationer også forhindret væsentlige skridt ledsagende carcinoma celledød , herunder ændringer i morfologi, optagelse, global transskription og MAP kinase aktivering. Gennem globale transkriptionel analyse og phosphoryleringsbegivenheder arrays, blev en stærk ion flux afhængig p38 MAPK respons opdaget og hæmning af p38-signalering forsinket HAMLET-induceret død. Sund, differentierede celler var resistente overfor HAMLET udfordring, som blev ledsaget af medfødte immunitet i stedet for p38-aktivering. Resultaterne antyder, for første gang, en samlende mekanisme til initiering af HAMLET brede og hurtige dødelig virkning på tumorceller. Disse resultater er særligt vigtig i lyset af HAMLET dokumenterede terapeutiske virkning i humane studier og dyremodeller. Resultaterne tyder også på, at HAMLET tilbyder et to-differentieret terapeutisk tilgang, dræbe kræftceller og samtidig stimulere en medfødt immunrespons i omkringliggende raske væv

Henvisning:. Storm P, Kjær Klausen T, Trulsson M, Ho CS J, Dosnon M, Westergren T, et al. (2013) En Unifying mekanisme for Cancer Cell Død gennem Ion Channel Aktivering af HAMLET. PLoS ONE 8 (3): e58578. doi: 10,1371 /journal.pone.0058578

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA

Modtaget: 14. august 2012; Accepteret: 6 februar 2013; Udgivet: 7 mar 2013

Copyright: © 2013 Storm et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Sharon D. Lund fundament tilskud og den amerikanske Cancer Society, den svenske Cancer Society, det medicinske Fakultet (Lunds Universitet), den Söderberg Foundation, Segerfalk Foundation, Anna-Lisa og Sven-Erik Lundgren Foundation for Medicinsk Forskning den Knut og Alice Wallenberg Foundation, Lund By Jubileumsfond, John og Augusta Persson Foundation for Medical Research, Maggie Stephens Foundation, Gunnar Nilsson Cancer Foundation, Inga-Britt og Arne Lundberg Foundation, HJ Forssman Foundation for Medicinsk Forskning og Royal fysiografiske Society. Der blev også opnået fra den danske Frie Forskningsråd (Medicinske videnskaber). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: HAMLET patenter ejes af HAMLET Pharma – en kommercielt inaktiv selskab.. Beskrevet i dette manuskript studier blev ikke støttet af kommercielle kilder /partnerskaber. Forfatterne har indgivet et patent, der indeholder relevante oplysninger til dette dokument. Ansøgningen nummer er WO 2012/069836. Forfatterne bekræfter hermed, at dette patent ikke ændrer forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Ionkanaler er en forudsætning for normal cellefunktion. De er stærkt konserverede gennem evolutionen, og aktiveres af en lang række forskellige signaler, herunder mekaniske kræfter, spænding, pH, matrix interaktioner og vækstfaktorreceptor aktivitet [1], [2], [3], [4], [5] [6]. Som et resultat, ionkanaler lette cellulær tilpasning til forskellige fysiske miljøer, ved at justere proliferation og apoptose, organudvikling og homeostase. Ion-kanal-aktivering er blevet foreslået at regulere aktiviteten af ​​væsentlige cellulære signalleringskaskader, herunder p38 mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK’er), lille guanin triphosphat hydrolaser (GTPaser), phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K) -Akt pathway, NFκB- og Ca

2 + -afhængige signalveje [7], [8]. For nylig er der blevet foreslået ionkanal dysregulering til også fremme malign transformation, tumorgenese og metastase, hvilket tyder på en central rolle ionkanaler for udvikling af cancer. Faktisk en bred vifte af ionkanaler, herunder Ca

2+, K

+, Na

+, og Cl

– kanaler, og ikke-selektive kationkanaler, har været impliceret i forskellige aspekter for udvikling af cancer (til anmeldelser, se [1], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]).

HAMLET (human alfa-lactalbumin gjort dødelige for tumorceller) er det første medlem af en ny familie af tumordræbende molekyler med bemærkelsesværdige egenskaber. Dannet fra delvist udfoldet α-lactalbumin og med oliesyre som en integreret bestanddel [16], [17], blev HAMLET opdaget af serendipity når man studerer evne modermælk at forhindre bakterier i at binde til værtsceller. Tidlig

in vitro Salg eksperimenter viste, at HAMLET viser bred anti-tumor aktivitet med en høj grad af tumor selektivitet [16], [17]. Efterfølgende terapeutiske studier i patienter og dyremodeller har bekræftet HAMLET’s tumordræbende aktivitet og relativ selektivitet for tumorvæv

in vivo

. HAMLET behandling forsinket tumorudvikling og førte til forøget overlevelse i en rotte glioblastoma xenograft model uden tegn på celledød i sundt hjernevæv [18]. Topisk HAMLET administration fjernet eller reduceret størrelsen af ​​huden papillom, som vist ved hjælp af et placebokontrolleret protokol med en to-årig opfølgning [19]. Lokal inddrypning af HAMLET hos patienter med blærecancer hurtigt dræbt tumorceller uden toksiske virkninger på sunde væv, der omgiver tumoren [20] og terapeutiske virkning HAMLET blev påvist i en murin blærecancer model [21]. For nylig er peroral HAMLET administration vist terapeutisk såvel som profylaktisk virkning mod tyktarmskræft i APC min mus (GUT, under trykning).

Følsomheden over for HAMLET mindste delvist afspejler forøget c-Myc onkogen ekspression og fejlreguleret glykolyse i tumorceller [22], men de specifikke membran interaktioner, der initierer HAMLET celledød proces er ikke blevet defineret. Cellulære reaktioner på HAMLET er ganske hurtig i forhold til celledød inducere som FAS ligand eller TNF-α [23], hvilket indebærer en mere umiddelbar og generel mekanisme til HAMLET sensing på cellemembranen end via traditionelle ydre apoptose induktion. I tidlige undersøgelser, vi har registreret hurtig Ca

2 + fluxe efter tumor celle udsættelse for HAMLET [17], hvilket tyder på, at ionkanaler og /eller transportører kan blive aktiveret. For nylig er der observeret dramatiske ændringer i strukturen af ​​kunstige, receptor-fri membraner og plasma membran vesikler fra kræftceller efter HAMLET udfordring [24]. Afrundede, defineret vesikler ændret morfologi til amorfe former, hvilket afspejler dannelsen af ​​lange membran distensioner med øget flydeevne. En lignende reaktion på HAMLET blev observeret i plasma membranvesikler fra carcinomaceller, hvilket antyder, at direkte membran virkninger kan bidrage til tumordræbende virkning HAMLET. Normale differentierede celler viste ingen tegn på membranen perturbation [24], hvilket tyder på, at membranen perturbationer kan karakterisere HAMLET følsomme tumorceller.

Denne undersøgelse kendetegnet ionstrømme udløst af HAMLET og undersøgte deres rolle i tumorcelledød. Vi viser, at HAMLET aktiverer en hel celle non-selektiv kation strøm, som vi karakteriserer elektrofysiologisk. Vigtigt er, viser vi, at ionstrømme er afgørende for at iværksætte HAMLET-induceret tumorcelledød og til at skelne tumorceller fra normale celler i denne sammenhæng. Virkningerne af HAMLET om kræft celle levedygtighed blev vendt ved amilorid eller bacl

2, ikke-specifikke inhibitorer af flere ionkanaler og transportere. I parallelle, ændringer i morfologi, ionstrømme, global transskription blev MAPK signalering og p38 MAPK-afhængige tumor celledød også ophævet. Desuden reaktion normale, differentierede celler til HAMLET viste markante forskelle fra det af kræftceller, defineret af mønsteret af ændringer i den globale transskription, signalvejen aktivering og overlevelse. Etableringen af ​​en ikke-selektiv, amilorid-følsomme kation kanal som afgørende for HAMLET-induceret kræft celledød beskriver en hidtil uløst mekanisme og kan repræsentere en ny behandlingsmulighed.

Materialer og metoder

HAMLET Production

α-lactalbumin blev oprenset fra affedtet human mælk ved ammoniumsulfatpræcipitation og hydrofob interaktionskromatografi og konverteret til HAMLET ved delvis udfoldning og binding til oliesyre som tidligere beskrevet [16]. Kort fortalt blev nativ α lactalbumin opløst i Tris (10 mM Tris /HCI pH 8,5) og Ca

2+ blev fjernet ved tilsætning af 3,5 mM EDTA. Den delvist udfoldet protein blev påført på en DEAE-Trisacryl M matrix forkonditioneres med oliesyre ved pH 8,5 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Den HAMLET kompleks blev elueres med en NaCl gradient. Dialyse blev anvendt til at fjerne overskydende salt og HAMLET blev lyofiliseret og opbevaret ved -20 ° C. Renheden af ​​hvert HAMLET batch blev bekræftet ved SDS PAGE (NuPAGE, Invitrogen) og aktivitet ved at kvantificere celledød, som beskrevet nedenfor.

Modermælk blev opnået fra individuelle donorer, efter underskrevet informeret samtykke. Hver donor var klar over, at prøverne kan anvendes i videnskabelig forskning. Prøverne blev de-identificeret og taget skridt til at beskytte deltagernes identitet. Proceduren blev godkendt af menneskelige etiske komité af det medicinske fakultet, Lunds Universitet, Lund, Sverige.

Celler

For at identificere bevarede respons veje forklarer de brede tumordræbende virkninger af HAMLET [25] tumor celler afviger i væv oprindelse, onkogen repertoire, cellemembran sammensætning, ionkanal-udtryk og vækst kapacitet blev brugt. T-celle lymfom celler (Jurkat), lunge carcinoma (A549), ovariecarcinom (HeLa) og nyre (A498) carcinoma celler (ATCC, Manassas, VA) blev dyrket i RPMI-1640 med ikke-essentielle aminosyrer (1:100 ), 1 mM natriumpyruvat, gentamicin (50 ug /ml, Gibco, Paisley, UK), og 5% (A549 og Jurkat) eller 10% (HeLa og A498) føtalt kalveserum (FCS, Gibco), hhv. Sunde, differentierede humane renale epitelceller (HRTEC) i primær kultur blev venligst stillet til rådighed af professor D. Karpman (Lunds Universitet, Lund, Sverige) efter etisk godkendelse fra Medical Ethics Committee for Lunds University Medical Faculty (afgørelse nummer LU 456- 96). Disse celler er tidligere blevet vist at være resistente over for de letale virkninger af HAMLET [16]. HRTECs blev dyrket i DMEM /F12 med 15% FCS (som i [26]) Primære RPTEC celler (human renal proximal tubulus epitelceller) blev indkøbt fra Lonza (Basel, Schweiz) og dyrket i DMEM-F12 suppleret med NEAA, natriumpyruvat , gentamicin, glutamax og 15% FBS (Gibco).

celledødsassays

carcinomceller blev løsrevet fra celle kultur flasker med Versen (0,2 g EDTA i 200 ml H

2O og 800 ml PBS) vasket med PBS og resuspenderet i serum-frit RPMI-1640. Celler blev podet ved en densitet på 50.000 /brønd i en plade med 24 brønde og lodes adhærere natten over i vækstmediet. HAMLET opløst i PBS blev inkuberet med celler i serum-frit medium og FCS blev tilsat efter 1 time. Jurkat-celler i suspension ( 80% levedygtige) blev blandet med HAMLET ved 37 ° C ved en densitet på 10

6 /ml i serum-frie medier. Alle celledød målinger blev udført tre timer efter HAMLET tilsætning, med mindre andet er anført. Celledød blev kvantificeret ved trypanblåteksklusion (Chroma Gesellschaft Schmid Co) ved at tælle på mindst 300 celler /prøve eller ved at måle ATP-niveauer (ATPLite Kit, PerkinElmer, Infinite F200, Tecan). Lette billeder blev taget med HoloMonitor ™ M2 digital holografisk mikroskop (fase Holografisk Imaging AB, Lund, Sverige). Trypanblåt er en klassisk vitalfarvestof, afspejler tabet af membranen integritet i døende celler. ATP er almindeligt anvendt som et surrogat biokemisk markør for levedygtighed, baseret på den antagelse, at levende celler producerer ATP og det er absolut nødvendigt for cellulære liv [27]. HAMLET behandlede celler er tidligere blevet undersøgt for tegn på programmeret celledød, herunder apoptose og autofagi [28], [29]. Mens caspaser og autofagi aktiveres i HAMLET behandlede celler, betyder inhibering af disse veje ikke redde celler fra HAMLET-induceret død. er derfor apoptotiske og autophagic parametre næppe forklare HAMLET-inducerede effekter og ikke blev undersøgt i denne undersøgelse.

Intracellulære ionkoncentrationer og ionstrømme

De relative, gratis intracellulære koncentrationer af Ca

2+ ([Ca

2 +]

i) og Na

+ ([Na

+]

i) blev estimeret ved hjælp af calcium-indikator Fluo-4 NW og natrium fluorophor Corona Green henholdsvis (Invitrogen). For Ca

2+ målinger, A549-celler blev givet frisk medium med Fluo-4 NW (5 uM) og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter, og efterfølgende behandlet som angivet. Fluo-4 fluorescens blev målt ved 535 nm efter excitation ved 485 nm ved anvendelse af en fluorescenspladelæser (TECAN uendelig F200, Tecan Group, Schweiz). Ca

2+ A23187 (1 uM, Invitrogen) blev anvendt som en positiv kontrol. Relativ [Na

+]

i blev målt i Jurkat-celler ved at indlæse cellerne med natrium- indikator corona Green (Invitrogen) ved 10 uM i 30 min. Til estimering af K

+ flusmidler blev FluxOR ™ kaliumion kanal assay (Invitrogen) anvendt ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev celler inkuberet med FluxOR ™, som er en Tl

+ indikator. En stigning i fluorescens signal svarer til en tilstrømning af Tl

+, hvilket indikerer åbning af kalium-kanaler, som blev målt til 535 nm efter excitation ved 485 nm i TECAN uendelige pladelæser. K

+ flusmidler og [Ca

2 +]

Jeg blev desuden analyseret ved konfokal billeddannelse. Billeder blev taget til fange hver 10 s i 5 min på en LSM510 META konfokal mikroskop (520 nm emission efter excitation ved 488 nm).

Patch Clamp Målinger

Løsninger.

standard ekstracellulære opløsning indeholdt (i mM): 150 NaCl, 6 CsCI, 2 MgCl

2, 1 CaClz

2, 10 HEPES, 10 glucose og pH blev justeret til 7,4 under anvendelse af NaOH. Pipetten løsning til standard måling indeholdt (i mM): 20 CsCI, 100 Cs-aspartat, 1 MgCl

2, 0,08 CaCl

2, 10 HEPES, 10 1,2-bis (2-aminophenoxy) ethan- N, N, N ‘, N’-tetraacetat (BAPTA), 4 Na

2-ATP og pH blev indstillet til 7,2 under anvendelse af CsOH. Den frie calciumkoncentration i denne opløsning er -200 nM. Til estimering af den relative permeabilitet af monovalente kationer indeholdt den ekstracellulære opløsning: (i mM) 20 CsCI, 130 xcl, 10 HEPES og 10 glucose, hvor X betegner den respektive monovalent kation (Na

+, K

+, eller Cs

+). Alle opløsninger blev justeret til pH 7,4 under anvendelse af Tris. Pipetten opløsning vedrørende selektivitet målinger var: (i mM) 100 Cs-aspartat, 20 xcl, 10 HEPES og 10 glucose, med X = Na

+, K

+ eller Cs

4 Na

2-ATP og 5 ethylenglycol tetraeddikesyre (EGTA) med X = Na

+, K

+, eller Cs

+. pH blev indstillet til 7,2 under anvendelse af Tris. For at opretholde ioniske sammensætning blev HAMLET, α-lactalbumin og oleat direkte opløst i optagelsesløsninger.

Elektrofysioloqisk optagelse.

For patch clamp målinger, A549 celler, hvor podet på runde dækglas 24-48 timer før måling. Alle målinger blev udført ved stuetemperatur med konstant perfusion. Helcelle strømme blev målt under anvendelse af et EPC10-USB forstærker (HEKA Elektronik, Lambrect, Tyskland), der anvender bristede patches. Pipette modstand var 6,5 ± 0,4 MOhm i asymmetriske løsninger. Kapacitans og serie modstand blev registreret kontinuerligt og 65% af serien modstand var elektronisk kompenseret for at reducere spænding fejl. Som referenceelektrode blev Ag-AgCl elektrode anvendes under standardbetingelser, mens en 3 M KCI agar Broen blev brugt til selektivitet målinger. Alle målinger, hvor der udføres ved hjælp af en 400 ms lineær spænding rampe fra -100 mV til 100 mV. Protokollen blev indledt ved en 50 ms prepulse ved -100 mV og efterfølges af 1550 ms ved -30 mV. Alle data blev filtreret 2,9 kHz og stikprøven 1 kHz.

Beregning af den relative permeabilitet.

grund af den relativt smalle vindue af tid fra HAMLET stimulation at forsegle brud (formodentlig afspejler membran perturbation af HAMLET se Resultater), relativ permeabilitet nøgletal blev beregnet ud fra de absolutte vending potentialer (V

rev) ved hjælp af ligningen [30]: hvor P giver

X repræsenterer permeabilitet given ion [X

+]

jeg, [X

+]

e repræsenterer intracellulære og ekstracellulære koncentrationer, og F, T, R har deres normale værdier. Den relative Ca

2+ permeabilitet blev beregnet som [30]:.

hvor a = P

Na /P

Cs

Før beregninger, V

rev blev korrigeret for flydende junction potentialer [31] (V

LJ) som:.

V

LJ blev beregnet ved hjælp af den indbyggede JPCalcW software i Clampex7 (Axon Instruments, USA)

konfokalmikroskopi

For konfokal mikroskopi blev celler dyrket natten den 8.-brønds kammer slides (Nalge Nunc A /S, Roskilde, Danmark). Efter de respektive eksperimentelle procedurer blev celler fikseret i 3,7% paraformaldehyd, kerner og plasmamembran blev farvet med DRAQ5 (eBiosciences) og Alexa-Fluor 488-mærket hvedekimagglutinin (Invitrogen) og undersøgt i et LSM510 DUO konfokalt mikroskop under anvendelse af en 63 × nedsænkning olie mål (Carl Zeiss, Jena, Tyskland). 488 nm Argon laser linje blev anvendt til at excitere Alexa-Fluor 488 fluorescens, som blev detekteret under anvendelse af et band pass filter fra 505 til 530 nm. Alexa-Fluor 568 var ophidset ved anvendelse af HeNe543 nm laser, og fluorescens blev detekteret ved anvendelse af et båndpasfilter 560-615 nm. 633 nm HeNe laser blev anvendt til at excitere DRAQ5, og fluorescens blev målt under anvendelse af en 650 langpasfilter. For ionkanal inhibering blev celler præinkuberet med medium indeholdende inhibitorer i 30 minutter og behandlet med 35 pM HAMLET (3,5 uM Alexa-Fluor 568-mærket HAMLET (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 31,5 uM umærket HAMLET) i serumfrit medium. For levende celler blev celler holdt ved 37 ° C blev kerner farvet med Hoechst 33342 (Invitrogen) og Alexa-Fluor 568-mærket HAMLET blev tilsat i serum-frit medium. Cellerne blev holdt ved 37 ° C, 5% CO

2 og billeder blev indsamlet regelmæssigt ved konfokal mikroskopi under anvendelse af en LSM510 META (Carl Zeiss, Jena, Tyskland).

transkriptomisk Analyse

for microarray analyse, 200.000 A549-celler /brønd fik lov at adhærere natten over på en plade med 6 brønde. Efter 1 time af HAMLET behandling (21 uM), vedhæftet samt flydende celler blev lyseret, og RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Prøverne blev sendt til AROS Applied Biotechnology (Århus, Danmark) til analyse og køre på Human Genome U219 Array Plade ifølge standard Affymetrix protokoller. Dataanalyse blev udført ved hjælp af R og BioConductor (https://www.r-project.org). Den rå data blev normaliseret ved hjælp RMA (Irizarry et al., 2003), hvor rå intensiteter er baggrund korrigeret, log2 transformeret og derefter normaliseret ved hjælp fraktiler. En lineær model er tilpasset til dataene for at opnå ekspression værdi for hver probe sæt. Den normaliserede data viste sig at være af fremragende kvalitet med høj replikere korrelation ( 0,99) og nBrug (normaliserede uskalerede fejl) værdier tæt på 1 (interval 0,994-1,008). At udlede differentielt udtrykte gener en lineær model blev monteret ved hjælp af BioConductor limma pakke og gener med empiriske Bayes justerede p-værdier 0,05 og log2 fold ændringer 1 blev anset differentielt udtrykte og var funktionelt karakteriseret ved hjælp af Database til anmærkning, Visualisering og Integreret Discovery (DAVID;.. (Dennis et al, 2003) og opfindsomhed Pathway analyse for den udvidede microarray analyse blev genekspression vurderet ved hele genom Illumina microarrays (HumanHT-12 Expression BeadChip) Dataene blev normaliseret ved hjælp krydskorrelation [32. ] Gener med en Benjamini-Hochberg justerede p-værdi. . 0.05 og log2 gange ændring ≥1.2 i tumorceller og ≥2.0 i normal, blev differentierede celler på noget tidspunkt betragtes som differentielt udtrykt Alle microarray data blev registreret i NCBI s Gene Expression Omnibus database (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo) med tiltrædelse nummer GSE23772.

Western blots og Cytokine Kvantificering

For Western blots blev 200.000 celler lov til at adhærere natten over i en 6-brønds plade, udsat for forskellige eksperimentelle betingelser og lyseret i M-PER lysepuffer (Pierce, Rockford, IL) indeholdende Complete Protease inhibitor cocktail og PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail (begge fra Roche, Mannheim, Tyskland). Lysaterne blev klaret ved centrifugering og proteinkoncentrationer blev målt ved anvendelse af DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) på en Tecan Infinite pladelæser. Lige store mængder protein blev separeret ved SDS-PAGE på 4-12% Bis-Tris-geler (Invitrogen) og blottet på PVDF-membraner (GE Healthcare). Membraner blev mættet med BSA (GAPDH), fedtfri tørmælk (phospho-p38 MAPK, p38 MAPK, phospho-ERK1 /2, ERK1 /2, ATF6, phospho-eIF2α) eller lør-1 og lør-2 (α-lactalbumin) og inkuberet med anti-bovin α-lactalbumin (1:500, Bethyl Laboratories, Montgomery, Texas), anti-p38 MAPK, anti-phospho- (Thr180 /Tyr182) p38 MAPK, anti-ERK1 /2, anti-phospho- ( Thr202 /Tyr204) -ERK, anti-phospho-eIF2α (Ser51) (alle 1:500-1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-ATF6 (1:1000, IMG-273, IMGENEX) eller anti-GAPDH (1:3000-5000, Novus Biologicals) antistoffer efterfulgt af peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin (1:1000, DakoCytomation, Glostrup, Danmark), anti-ged (1:1000, Sigma-Aldrich) eller anti-muse (1: 40,000-50,000, Novus Biologicals) sekundære antistoffer til farvning. Bundne antistoffer blev påvist med ECL Plus Western Blotting Reagent (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) og GelDoc udstyr (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). For at kontrollere for lige lastning blev membraner strippet med Restore Western Blot Stripping Buffer (Pierce), blokerede og testet igen med nye antistoffer. For siRNA eksperimenter blev lige store volumener af lysater separeret ved SDS-PAGE på 4-12% Bis-Tris-geler (Invitrogen) og blottet på PVDF-membraner.

MAPK-phosphorylering blev analyseret på en human Phospho-MAPK array ( Proteome Profiler Array, R 0,05 blev betragtet som signifikant. De fejl barer i alle grafer repræsenterer SEMs fra mindst tre uafhængige biologiske gentagelser.

Resultater

Na

+, K

+ og Ca

2 + transport på induceret af HAMLET i tumorceller

Ændringer i intracellulære ionkoncentrationer induceret af HAMLET (35 uM) i tumorceller blev karakteriseret ved fluorometri (figur 1A) og tidstro konfokal billeddannelse (figur 1B). HAMLET udløste en hurtig stigning i [Na

+]

jeg i jurkatceller forudindlæst med Na

+ fluorophor corona Green. Åbning af en plasmamembran K

+ transportvej som reaktion på HAMLET blev registreret i A549 lungecarcinomceller vha FluxOR ™ assay, der overvåger tilstrømningen af ​​thallium som en surrogatmarkør for K

+ [34]. I betragtning af den drivende kraft for K

+ flux over plasmamembranen dette svarer til K

+ udstrømning, forudsat at transporten vej er en kanal (se Diskussion). HAMLET udløste også en hurtig og vedvarende stigning i [Ca

2 +]

i i Fluo-04:00 præinstalleret lungecarcinomaceller (figur 1A). I modsætning hertil native α-lactalbumin eller oliesyre fremprovokere Na

+, K

+ eller Ca

2 + fluxe (figur 1A).

(A) Skøn over den relative frie, intracellulære koncentrationer af Na

+, K

+, og Ca

2+ ([Na

+]

jeg, [K

+]

i, og [Ca

2 +]

i henholdsvis) blev opnået i A549-celler (K ​​

+ og Ca

2+) og Jurkat-celler (Na

+) ved fluorescens spektrometri hjælp corona Green , FluxOR og Fluo-4. Rapid ionstrømme blev påvist og disse virkninger var HAMLET specifikke som α-lactalbumin, oliesyre eller PBS havde ingen virkning. (Midler af fire forsøg, p. 0,05 (Studerende t-test ved t = 2 minutter) (B) Forskel i HAMLET-induceret ionstrømme mellem tumorceller og raske celler Ca

2+ og K

+ flusmidler gøres synlige ved tidstro konfokal billeddannelse af A549 lungecarcinomceller og HRTEC sunde, differentierede nyreceller, lastet med Ca

2+ og K

+ fluoroforer og behandlet med HAMLET (35 uM) i op til 290 sekunder. repræsentative tal fra tre forsøg er vist. (C) calcium ionofor (A23187, 1 uM) respons i A549 lungecarcinomceller fyldt med Fluo-4. repræsentativt tal fra tre forsøg. (D) Inhibering af intracellulært calcium frigivelse fra eR reducerer Ca

2+ Fluxes. A549-celler blev forbehandlet med en PLC-inhibitor (10 uM, U73122), dens inaktive analog (10 uM, U73343) eller EDTA (1 mM) i 30 minutter og behandlet med HAMLET som angivet. hjælp af tre eksperimenter. (E) amilorid (Amil, 1 mM) hæmmede Na

+ og Ca

2 + fluxe i A549-celler (Ca

2+) og Jurkat-celler (Na

+) induceret af HAMLET (markeret som H i figuren). Bacl

2 (1 mM) hæmmede Na

+, K

+ og Ca

2 + flusmidler. Celler blev præ-fyldt med de respektive fluoroforer, forbehandlet med inhibitorer (30 minutter) og udfordret med HAMLET (35 uM) i op til 5 minutter. Effekter af amilorid på K

+ flusmidler kunne ikke bestemmes på grund af auto fluorescens. Ruthenium rød (RR, 30 uM) reduceret Ca

2 + fluxe mens tetranidrine (Tet, 10 uM) havde ingen signifikant effekt.

[Ca

2 +]

i og K

+ ion fluxe blev også visualiseret under anvendelse konfokal mikroskopi og vist at forekomme i næsten alle celler (Figur 1B). Disse hurtige ionstrømme blev ikke observeret ved konfokal mikroskopi hos raske, differentierede celler i primær kultur (HRTEC). Konfokal billeddannelse af Fluo-4 belastede celler viste en forskel i kinetik og størrelse mellem reaktioner på HAMLET eller Ca

2+ A23187 (figur 1C), hvilket tyder på, at de virker ved forskellige mekanismer. Ca

2 + -chelation med EGTA haft ringe effekt på stigningen i [Ca

2 +]

i, hvilket tyder på, at inddragelsen af ​​ekstracellulære Ca

2+ var minimal (Figur 1D). Men hæmning af InSP3-gated ER Ca

2 + kanaler med U73122 væsentlige afskaffet stigning i [Ca

2 +]

i, hvilket indebærer, at den stammer primært fra intracellulære lagre (Figur 1D, [35] ).

HAMLET-induceret ionstrømme er amendable til Ion Channel hæmmere

Et panel af velkarakteriserede ion kanal hæmmere blev brugt til yderligere at undersøge den lille landsby induceret ionstrømme. Ændringen i [Na

+]

jeg i Jurkat-celler blev hæmmet af amilorid og bacl

2, K

+ flux i lungecarcinomceller af bacl

2 og Ca

2+ flux af amilorid og bacl

2 (figur 1E). Virkningen af ​​amilorid på K

+ flux kunne ikke testes som følge af autofluorescens. Den molekylære karakter af HAMLET-aktiverede strøm blev yderligere undersøgt ved hjælp af den bredspektrede Ca

2 + kanal hæmmere, ruthenium rød og tetrandrine, hvoraf ingen væsentligt påvirket den nuværende (figur 1E).

HAMLET aktiverer en selektive Whole Cell kation Current i carcinomceller

De observerede ændringer i intracellulære ion-koncentrationer var vejledende, at HAMLET aktiveret en ikke-selektiv ionkanal. Denne hypotese blev bekræftet af helcelle patch clamp-forsøg (figur 2). HAMLET (35 uM) aktiveret en hel celle strøm, som nåede en størrelsesorden af ​​2,74 ± 0,88 nA inden 1,43 ± 0,13 min. Den nuværende udviste en temmelig lineær strøm-spændings-forholdet (figur 2A, B) og en klar tidsafhængig inaktivering ved depolariserede potentialer (figur 2C). Initial nuværende aktivering udstillet en forsinkelse på 0,88 ± 0,13 min fra HAMLET ansøgning. I modsætning hertil α-lactalbumin eller oleat, var inaktive, og understreger behovet for HAMLET komplekset til at aktivere cellens aktuelle (Figur 2A-B). Tilbageførslen potentiale (V

rev) i Cs-baserede løsninger var -5,1 ± 0,99 mV, der svarer til den beregnede Nernst potentiale 4,85 mV mens V

rev var -8,3 ± 1,3 mV og 2,4 ± 2 mV i Na

+ og K

+ baserede løsninger, henholdsvis, hvilket giver en permeabilitet forhold af P

Cs (1) P

K (0,88 ± 0,1) P

Na (0,48 ± 0,03 ) (figur 2D). GAPDH blev anvendt som en loading kontrol.