PLoS ONE: Onkogene funktioner i Cancer-Testikel Antigen SSX på spredning, overlevelse, og signalveje af kræftceller

abstrakt

SSX er en transkriptionsfaktor med flygtige onkogene funktioner udtrykt i en række humane tumorer af epitel- og mesenchymal oprindelse. Det har rejst betydelig interesse som et mål for kræftbehandling, da det fremkalder humorale reaktioner og viser begrænsede udtryk for kræft, spermatogonier og mesenkymale stamceller. Her undersøgte vi de onkogene egenskaber af SSX ved at anvende en RNA-interferens til knock-down den endogene ekspression af SSX i melanom og osteosarkom cellelinier. Udtømning af SSX-ekspression resulterede i reduceret proliferation med celler akkumuleres i G1-fasen af ​​cellecyklussen. Vi fandt, at den vækstfremmende og overlevelse egenskaber SSX medieres delvist selvom modulering af MAPK /Erk og Wnt signalveje, eftersom SSX silencing hæmmede Erk-medieret signalering og transkription af cMYC og Akt-1. Vi fandt også, at SSX danner en transient kompleks med β-catenin ved G1-S fase grænse hvilket resulterer i ændret ekspression af β-catenin target gener, såsom E-cadherin, snail-2 og vimentin, der er involveret i epitel-mesenchymale overgange. Vigtigere undertrykkelse af SSX udtryk i

in vivo

forringet betydeligt væksten af ​​melanom tumorxenoplantater. Tumorbiopsier fra SSX lyddæmpede tumorer de viste reduceret cyclin A farvning, indikerer lav spredning og overvejende cycloplasmic β-catenin sammenlignet med SSX udtrykkende tumorer. Den foreliggende undersøgelse viser en hidtil ukendt funktion af SSX, at som et onkogen og som en tumor mål for udvikling af nye lægemidler mod kræft

Henvisning:. D’Arcy P, Maruwge W, Wolahan B, Ma L, Brodin B (2014) Onkogene funktioner Kræft-Testikel Antigen SSX om spredning, overlevelse, og signalveje af kræftceller. PLoS ONE 9 (4): e95136. doi: 10,1371 /journal.pone.0095136

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA

Modtaget: September 17, 2013; Accepteret: 24 marts 2014; Udgivet: 30 April, 2014

Copyright: © 2014 D’Arcy et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den svenske Children Cancer Foundation, Lillian Sagens och Curt Ericssons Forskningsstiftelse, og Stockholms Cancer Foundation til Bertha Brodin. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

SSX

blev oprindeligt identificeret som en del af

SS18 /SSX

fusion gen i synovial sarkom [1], og som melanom tumor antigen HOM-Mel40 [2] . Den består af en familie på ni, meget homologe gener organiseret i klynger på X-kromosomet med produkter, der er klassificeret som kræft-testis-antigener baseret på deres begrænsede udtryk i tumorer og testikler. I normale celler, er SSX-ekspression er fundet i spermatogonier [3], [4], mesenkymale stamceller [5]. Ekspressionen af ​​SSX familiemedlemmer i tumorer er blevet grundigt undersøgt, og det har vist sig, at SSX1, SSX2, SSX4 og SSX5 udtrykkes uafhængigt eller samtidig ofte vise udbredte, spredt eller fokale ekspressionsmønstre i tumorer i epitel, hæmatopoietiske, neurale og mesenkymale . oprindelse [3], [6] – [8]

proteinet er rig på ladede aminosyrer [9], og indeholder to såkaldte repressor domæner, der undertrykker transskription

In vitro

; en Krüppel associeret boks lokaliseret ved N-terminalen, og en stærkere repressordomæne (RD) ved C-terminalen [10], [11]. I celler, SSX har et granulært ekspressionsmønster og lokaliserer i kernen og cytoplasmaet [5], [12]. Direkte interaktion af SSX med DNA er ikke påvist, det antages derfor, at SSX undertrykke transskription ved at danne komplekser med DNA-bindende proteiner. Til støtte for denne model både SSX og SS18 /SSX fusionsgenproduktet er blevet vist at interagere med medlemmer af Polycomb repressor kompleks Bmi-1 og Ring 1 [13], og kernehistoner [14] tyder på, at SSX kan kontrollere ekspressionen af gener, der regulerer celledifferentiering. Andre proteiner, der interagerer med SSX er de Ras-lignende GTPase bindende protein RAB3IP, den kerneprotein SSX2IP [15], og den LIM homeobox protein LHX4 [16].

Siden opdagelsen som en cancer-testis antigen, det immunterapeutiske målretning af SSX har rejst stor interesse som et anti-cancer-strategi på grund af dets immunogenicitet [2], [3], begrænset tumor ekspression, og korrelation mellem SSX-ekspression og sygdomsprogression [8], [17], [18] . T-celle cytotoksiske reaktioner er blevet genereret

in vitro

mod SSX epitoper [19] – [21], men valideringen af ​​SSX som terapeutisk target

in vivo

er ikke blevet rapporteret. I nærværende undersøgelse har vi vurderet rolle SSX ved mediering cellevækst og overlevelse af kræftceller i

vitro

in vivo

, og identificerede vækst signalveje SSX udtryk.

Resultater

SSX2 fortrinsvis udtrykkes i metastatisk melanom læsioner og cellelinier, men ikke i normale celler

Vi undersøgte udtryk for SSX1 til SSX5 i 12 metastatisk melanom læsioner, 9 tidligt passerede melanomcellelinier, normale humane epiteliale melanocytter (NHEM) og humane diploide fibroblaster (HDF) under anvendelse af en sekventering valideret RT-PCR-fremgangsmåden beskrevet tidligere [5]. I lighed med andre offentliggjorte undersøgelser fandt vi, at flere SSX-transkripter blev samtidigt udtrykkes i alle melanomer og melanomcellelinjer undersøgt. Interessant SSX2 blev fundet i næsten alle melanom væv og afledte cellelinier (95%) sammenlignet med SSX4 (57%), SSX1 (38%), SSX5 (33%) og SSX3 (19%) udtryk. Ingen af ​​SSX medlemmer blev detekteret i normale humane epiteliale melanocytter (NHEM) eller i normale humane diploide fibroblaster (HDF) (figur 1). Sekvensen af ​​primerne anvendt til påvisning af SSX-1 til SSX-9 og ekspressionen af ​​SSX i osteosarkomer cellelinjer, herunder linjen anvendt i denne undersøgelse SAOS-2 er vist i fig S1.

SSX-ekspression var analyseret ved en nested RT-PCR-fremgangsmåden beskrevet tidligere under anvendelse af primere, der genkender SSX1 til SSX 9 cDNA. Friske biopsier blev opnået fra metastatiske læsioner af melanompatienter. DFW melanom cellelinie, der udtrykker høje niveauer af SSX1 til SSX5 blev anvendt til RNAi studier. NHEM: normale humane epitelceller melanocytter, HDF:. Humane diploide fibroblaster

Den Betinget Silencing af SSX Hæmmer tumorcelleproliferation ved Blokering Indtastning af tumorceller i S-fasen

For at få en indsigt i funktionen af ​​SSX i tumorceller, vi tavshed SSX i melanomacellelinien DFW der udtrykker SSX1 til SSX5 (figur 1) under anvendelse af plasmider til både stabil og doxycyclin betinget ekspression af shRNA molekyler rettet SSX1-9 transkripter (figur 2A og figur S2) som beskrevet i materiale og metoder.

A) Grafisk repræsentation af shRNA sekvens (komplementær til SSX1 til SSX9) ligeret ind shRNA vektorer til stabil og doxycyclin reguleret shRNA ekspression (se materiale og metoder). B) Western blot, der viser SSX ekspression i kontrol-shRNA og SSX-shRNA transficerede celler 24 timer efter doxycyclin tilsætning til dyrkningsmediet. C) Cell koloni kvantificering i kontrol og SSX-shRNA transficerede DFW celler dyrket i nærvær af doxycyclin i 8 dage. D) kurver for celleproliferation bestemt ved at tælle antallet af levende celler i kontrol og SSX stilhed kulturer under anvendelse af trypanblåt-farvning. E) S-fase cellecyklusprogression bestemt ved BrdU-inkorporering i en fluorescens-aktiveret cellesorterer (FACS). F) Procentdel af celler ved G1, S og G2 faser af cellecyklus i kontrol og SSX shRNA bankede ned DFW celler i løbet af 96 timer periode.

Betinget lyddæmpning af SSX blev induceret ved tilsætning af doxycyclin i mediet og resulterede i et signifikant fald af SSX-protein efter 24 timer (figur 2B). Celle levedygtighed tæller under anvendelse trypanblåteksklusion celler viste tilstedeværelse af levedygtige, men ikke- prolifererende celler i nærvær af doxycyklin indikerer, at SSX-ekspression er nødvendig for cellevækst (figur 2D). For at undersøge gyldigheden af ​​denne observation vi også udført siRNA knockdown af SSX udtryk i yderligere to osteosarkom cellelinjer, U2-OS og Saos-2, ved hjælp af RNAi-molekyler rettet mod SSX1-9, eller specifik for SSX1 og SSX2. I lighed med de tidligere resultater SSX udtømning resulterede i reduceret proliferation sammenlignet med kontrol siRNA viser at den observerede fænotype er en bona fide effekt af SSX knockdown og ikke på grund af off-target effekter (figur S2). I klonogene assays, undertrykkelse af SSX i DFW tumorceller resulterede i en forringet kolonidannelse som observeret ved en fire gange formindskelse i antallet af kolonier i celler dyrket i nærvær af doxycyclin i 14 dage sammenlignet med kontroller (figur 2C). Cellecyklusanalyse af DFW celler i efter tilsætning af doxycyclin viste, at cellerne ikke komme ind i S-fasen af ​​cellecyklussen (figur 2D). Procentdelen af ​​celler i S-fase faldt fra 50% (ved 0 og 24 timer) til 5% (ved 72 og 96 timer) sammen med en ledsagende akkumulering af celler i G1-fasen, der indikerer en defekt i cellecyklusprogression ( Figur 2F). For at bekræfte denne effekt af SSX udtryk på S-fasen indrejse, synkroniserede vi vildtype (SSX +) og SSX bankede-down DFW celler i G1 /S fase ved dobbelt thymidin blok og frigivelse til normale FBS indeholdende medium. Kontrol (SSX +) DFW celler hurtigt skred fra G1 til S-fase 4 til 10 timer efter frigivelse fra thymidin blok. I modsætning kunne SSX-knockdown celler ikke krydse G1 /S fase grænse, med resterende celler standset i G1-fasen (figur 3A). Overensstemmelse med dette er observationer, niveauer af cyclin E, det regulerende element af cyclin E-CDK2 kompleks og en central regulator af G1 og S-fase progression, faldt parallelt med nedregulering af SSX. (Figur. 3B).

Kontrol (SSX +) og bragt til tavshed (SSX-) DFW melanom celler blev synkroniseret i G1 /S fase ved dobbelt thymidin blokade og udgivet i normal medium, som beskrevet i materialer og metoder. A) Indtastning af cellerne til S-fasen (S) blev analyseret ved at kvantificere DNA-indhold ved hjælp af propidiumiodid (PI) stiftelse og et fluorescerende cellesorteringsapparat FACS. B) Western blot, der viser tidsafhængige ekspression af SSX og cyclin E i kontrol og SSX tavshed (+ Dox) DFW celler. Cellerne blev synkroniseret i G1 /S (0 h), frigives i normal medium indeholdende FBS og høstet ved de angivne tidspunkter.

SSX medierer tumorcellevækst gennem Mapk /Erk signalvej

konstateringen af, at SSX opretholder celledeling og er nødvendig for optagelse af tumorceller i S-fase fik os til at undersøge, om denne virkning var forbundet med at signalere kaskader, der stimulerer celledeling og overlevelse. Vi begyndte med at sammenligne potentialet af SSX udtrykke og knockdown-celler for at aktivere (phosphorylere) de intracellulære messengers Erk og Akt-1 efter vækstfaktorstimulering.

Tab af SSX-ekspression blev forbundet med nedsat phosphorylering af det ekstracellulære signal -regulated kinase (Erk) 1 og 2, men ikke af Akt-1 efter stimulering med FBS. En reduktion af proteinniveauer af Akt-1 blev imidlertid observeret i SSX tavshed celler (figur 4). Vores resultater antyder, at virkningerne af SSX på tumorcelleproliferation er forbundet i det mindste delvis til at modulere aktiviteten af ​​MAPK /Erk signalvej.

Western blot, der viser ekspressionen af ​​Erk1-2 og Akt-1 og deres aktiverede (phosphorylerede) former Pakt (Ser 473) og kvikke (Thr202 /Tyr204) i kontrol shRNA og SSX-shRNA DFW celler. Celler blev sultet i serumfrit medium i 36 timer (0 h) og cellesignalering blev aktiveret ved tilsætning af serum i medierne. Prøver blev opsamlet ved 10 og 30 minutter (10 ‘og 30’) og efter 6 og 24 timer (6 H, 24 h) efter serumstimulering. SSX udtryk blev bestemt ved immunopræcipitation (fl188 antistof) og western blot (N18 antistof) de senere recognozing bånd på ca. 22 og 14 kDa.

SSX Interagerer β-catenin at regulere transskription af EMT associerede β catenin gener

3′-regionen af ​​SSX-1, 2 og 4 gener fusioneres til næsten hele SS18-genet i synoviale sarkomer. Interessant SS18 /SSX2 fusionsproteinet danner et kompleks med β-catenin resulterer i aktivering af en T-celle faktor TCF /lymfocyt enhancer faktor (LEF) reporterkonstruktion når ektopisk udtrykkes i pattedyrceller [22]. Vi undersøgte derfor, hvis denne interaktion er bevaret for fuld længde SSX proteiner.

Da SSX udtryk varierer med cellecyklusprogression vi synkroniseret DFW og Saos-2-celler (tid 0) ved G1 /S fase grænse og udgivet i celle cyklus for 6 og 24 timer og udførte immunudfældning på cellelysater med SSX antistoffer og immunblotting med β catenin antistoffer (figur 5a). β-catenin blev co-udfældet med SSX fra begge Saos-2 og DFW celler blokeret i G1 /S (tid 0) og fra celler, der blev udgivet i cellecyklussen for 6 og 24 timer. At sikre specificitet blev lige proteinmængder af Saos-2 celleekstrakter immunpræcipiteret med irrelevante immunoglobuliner fra mus (M) og kanin (R) som kontroller (figur 5A). Salg

A) DFW og Saos-2-cellelinjer blev synkroniseret i G1 /S ved at dobbeltklikke thymidin blokade som angivet i materialer og metoder (0 timer), og frigives til normal medium indeholdende FBS i 6 og 24 timer. SSX blev immunpræcipiteret fra proteinekstrakter indsamlet på de angivne tidspunkter ved hjælp af kanin anti SSX antistof (FL188, afsløre SSX1-9). En ækvivalent mængde af protein fra G1 /S blokeret Saos-2-celler blev immunopræcipiteret med et irrelevant anti mus (m) eller ant-kanin (R) antistof. Proteinkomplekset blev elektroforeret i reducerende betingelser og blottet ether med gede-anti SSX (N18) eller muse anti β-catenin antistoffer. De samlede input niveauer af β-catenin er vist i den øvre gel billedet. B) Virkning af en TCF /Lef luciferase reporter i SSX tavshed og kontrollere DFW og Saos-2-celler, 48 timer efter transfektion af siRNA-molekyler (n = 5). Aktiviteten af ​​TCF /Lef reporter i SSX tavshed celler er i forhold til den for kontrolceller (= 1). C) gentransskription forbundet med SSX ekspression i både Saos-2 og DFW celler, fastsættes på grundlag af PCR arrays indeholdende 84 gener forbundet med epitelial til mesenkymale overgang (n = 5) og bekræftet ved Q-RT-PCR i SSX tavshed og kontrollere DFW og Saos -2 celler som beskrevet i materialer og metoder. SSX blev slået ned i Saous-2 eller DFW celler ved hjælp siRNA molekyler eller shRNA vektorer som angivet. Celler blev opsamlet, og RNA blev isoleret 6 vores efter siRNA transfektion eller 6 timer efter tilsætning af doxycyclin i mediet (betinget shRNA). Tabet af SSX-ekspression efter RNAi silencing blev bekræftet ved Western blot før hvert Q-RT-PCR-array, som vist i figuren. Fold-Change [2∧ (-delta Delta Ct)] er den normaliserede genekspression [2∧ (-delta Ct)] i SSX tavshed celler divideret med den normaliserede genekspression i kontrolgruppen (SSX +) celler. Værdier mindre end én indikerer en negativ eller nedregulering.

Den omvendte eksperiment blev også udført, hvor celleekstrakter fra DFW blev udfældet med β-catenin antistoffer og blottet med anti-SSX antistoffer. Immunopræcipitation af β-catenin resulterede i co-udfældning af SSX. Af meddelelsen er, at udbyttet af SSX opnået efter β-catenin antistoffer var lavere end den omvendte immunpræcipitation, hvilket kan skyldes øget konkurrence mellem β-catenin binding med andre proteiner (figur S3).

I den kanoniske Wnt pathway, β-catenin binder til TCF /Lef at aktivere transkription af gener associeret med celleproliferation, overlevelse, motilitet og differentiering [23]. Baseret på dette undersøgte vi, hvis interaktionen af ​​β-catenin med SSX påvirker transkriptionen af ​​TCF /β-catenin målgener. For det første vi bestemt aktiviteten af ​​en TCF /Lef-luciferase reporter i SSX-bankede-down og kontrol (SSX +) celler. DFW og Saos-2-celler blev transficeret i tetraplicates med en TCF /Lef- ildflueluciferase reporter og med enten siRNA til SSX eller kontrol molekyler. Aktiviteten af ​​reporter blev evalueret 48 timer efter transfektion. Interessant vi observeret et fald i reporteraktivitet siRNA-SSX behandlede celler i fem uafhængige eksperimenter (figur 5B). Derefter undersøgte vi, om SSX /β-catenin interaktion var associeret med ændringer i transkription af endogene β-catenin /TCF målgener. Til dette formål, vi sammenlignede transskription profiler af kontrol og SSX knockdown hjælp RT-PCR arrays til 84 udskrifter forbundet med Epithelial til Mesenchyma (EMT) overgange i Saos-2-celler. Vi valgte gener associeret med EMT baseret på rollen af ​​β-catenin i fremme EMT og vores tidligere rapport, der viser, at SSX-ekspression er forbundet med invasiv kapacitet af tumorceller og med ekspression af mesenchymale gener [5]. De opnåede i 5 uafhængige arrays resultater blev bekræftet ved RT-PCR i DFW cellelinie. Af 84 analyserede gener, vi fandt, at tabet af SSX-ekspression i Saos-2 og DFW var forbundet med reduceret transskription af Akt-1, E-cadherin (CDH1), GSK3p, snail 2 (SNAI2), c-myc (cMYC), og vimentin (VIM) (figur 5C). Med undtagelse af Akt-1, alle disse gener bærer DNA bindende sekvenser for TCF /Lef og betragtes derfor som β-catenin mål. Vi observerede også en øget kollagen 3A transskription efter nedregulering af SSX i Saos-2 (tabel S1).

siRNA Målretning af SSX svækker Tumor xenograft Vækst

Efter at have vist, at SSX er nødvendig for tumor celle vokse

in vitro

undersøgte vi væksten af ​​kontrol og SSX tavshed implanteret i mus. Vi subkutant injiceret SCID-mus med enten kontrol-shRNA (SSXm) eller SSX-shRNA (SSXi) stabilt transficeret DFW celler (figur 5A-B), eller med DFW celler, hvor shRNA ekspression blev betinget reguleret med doxycyclin (figur 5C-D ). I den betingede systemet, blev SSX knockdown induceret ved subkutan implantation af langsomme frigivelse doxycyclin pellets som beskrevet i materialer og metoder. I forhold til kontrol (SSX +) tumorxenoplantater viste SSX Knockdown tumorer nedsat vækst som observeret af reducerede kurver tumor vækst og reduceret tumor volumen ved endpoint for testen (Figur 6 A-D). Mikroskopisk, SSX negative tumorer viste omfattende nekrose, op til 80% og havde afgrænsede grænser (figur 6E, HTX) med lokal prolifererende cyclin A positive celler. I modsætning udviste kontrol tumorer radial cellevækst med rigelige proliferativ (cyclin A positiv) områder og nuklear β-catenin (figur 6E). Interessant SSX Knockdown tumorer viste en overvejende cytoplasmatisk lokalisering af β-catenin, sammenlignet med kontrolpatienterne tumorer, hvilket muligvis indikerer en rolle for SSX i den cellulære lokalisering af β-catenin (fig 6E). Vi bekræftede SSX knockdown i tumorer ved Western blot af friske tumorbiopsier. (Figur 6F).

A) DFW melanomaceller stabilt transficeret med SSX-shRNA (SSXi) eller med en kontrol shRNA (SSXm) vektor, udvidet og xenotransplanteret i SCID-mus. A) Tumorvolumen bestemt på de angivne tidspunkter. B) Tumorvolumen ved slutpunktet af forsøget (21 dage). C) Vækst kurver af xenografter fra betinget SSX-shRNA tavshed DFW celler (SSX-) og kontrol shRNA (SSX +) celler. Doxycyclin blev administreret til alle mus ved subkutan indsættelse af en langsom frigivelse pellet at mantain stabil koncentration af doxycyclin (10 uM) i 21 dage. D) Tumorvolumen ved slutpunktet af eksperimentet. E) Immunhistokemi af tumorerne visualiseres i lysmikroskop ved hjælp 10x objektiv, indsætter 63x forstørrelse:. Hematoxillin (htx), spredning markør (ki-67) og β-catenin (β-cat)

Disse resultater viser, at nedregulering af SSX udtryk svækker tumorvækst

in vivo

og resulterer i ændrede β-catenin lokalisering.

diskussion

The SSX proteiner er kodet ved gener, som kun udtrykkes i flere cancer undertyper med ekspression i normale væv begrænset til kimceller, trophoblaster og føtale mesenchymstamceller. I betragtning af denne begrænsede ekspression, SSX antigener er attraktive mål for tumorimmunterapi [21]. Imidlertid er funktionen af ​​de SSX-proteiner i spermatogenese eller tumorgenese dårligt defineret. SSX udtrykkes i distinkte subpopulationer af spermatogonier og i føtale mesenchymstamceller antyder en rolle for SSX i celledifferentiering [4], [5]. I tumorer, SSX øger invasiv potentiale og undertrykker E-cadherin ekspression, som er blevet vist i melanom [5] og brystcancerceller, henholdsvis [24]. Vores resultater viser, at ekspressionen af ​​SSX er afgørende for optagelse af tumorceller i S-fasen af ​​cellecyklussen og dermed tumorceller, som udtrykker SSX opretholde celleproliferation og langsigtede overlevelse. Disse funktioner kan være forbundet med evnen hos SSX at modulere MAPK /Erk, Akt og β-catenin signalveje. I overensstemmelse med en rolle SSX i celleproliferation, knockdown af SSX blokeret pERK aktivering et centralt element i udbredelsen kaskade initieret af ekstracellulære vækstfaktor kinaser. Desuden resulterede SSX knockdown også i reduceret ekspression af Akt, en celle signalering kinase med en central rolle i en lang række af cellulære funktioner, herunder cellevækst, metabolisme og overlevelse [25]. Til støtte for denne, har de seneste rapporter vist, at SSX er afgørende for melanom celledeling [26] og for invasionen kapacitet brystkræftceller [24].

Vi fandt, at SSX direkte interagerer med β-catenin i G1 standsede celler, og at denne interaktion påvirker transkription af β-catenin /TCF målgener siden silencing af SSX-ekspression blev forbundet med nedsat aktivitet af et TCF /Lef reporterkonstruktion og nedsat transkription af β-catenin /TCF målgener, såsom E -cadherin, GSK3b, snail-2, vimentin og c-myc.

β-catenin er en kraftfuld transskription faktor med en lang liste af target gener involveret i celledeling, stemcellness og epitelial til mesenkymale overgange (EMT ). I en tidligere rapport foreslog vi en rolle for SSX i EMT baseret på vores resultater, at i en melanomcellelinje og i føtale mesenchymstamceller blev ekspressionen af ​​SSX forbundet med en mesenchymale fænotype såsom forøget celleinvasion kapacitet, nedsat E-cadherin og øget matrix proteinase 2 (MMP2) udtryk [5]. Vi demonstrerer nu, at SSX interagerer med β-catenin og baseret på vores transskription profildata foreslå, at denne interaktion kan fremkalde eller opretholde en mesenkymale fænotype. Aktiviteten af ​​SSX /β-catenin-komplekset på endogene målsteder kan dog afhænge af cellelinie, tid, og signaler fra mikromiljøet.

SSX er en nuværende mål for udviklingen af ​​cellebaserede immunovaccines . HLA A2-begrænsede cytotoksiske T-celler (CD8 +), som genkender SSX peptider er blevet isoleret fra lymfeknuder fra en SSX2 seropositiv melanompatient [19] og er også blevet genereret for immunotargeting af prostatacancer celler

in vitro

[ ,,,0],21]. Det er desuden blevet rapporteret, at behandlingen med autonome dendritiske celler primet med SSX peptider resulterede i tumorremission af en synovial sarkom patient [27]. I denne rapport, viser vi, at den transkriptionelle lyddæmpning af SSX hæmmer væksten af ​​melanom xenografter tilføje yderligere støtte til betydningen af ​​SSX som terapeutisk target.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle dyr arbejde er blevet godkendt af det svenske centrale bestyrelse for dyreforsøg (Centrala Försöksdjur nämnden, CFN), Stockholm North. Etiske godkendelsesnumre N399 /07, N340 /10 til B. B. Dyret er blevet gennemført undersøgelser i henhold til deres etiske retningslinjer. Indsamling af kliniske prøver til forskning blev udført med patienten concent og godkendt af Karolinska, forskningsetikkommitté Nord Intet 03-019. Alle data blev analyseret anonymt og i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen.

cellelinier

DFW er en HLA-A2 melanom cellelinie opnået fra en metastatisk melanom tumor. Linjen blev genereret ved Karolinska Institutet [28], og venligst stillet til rådighed af R. Kiessling. SAOS-2 (Sarcoma osteogent) er en cellelinie dannet ud fra en primær osteosarkom [29] og U2OS er en osteosarcomcellelinie begge cellelinier blev tilvejebragt af M. Fritsche, Universitat Freiburg, Tyskland. Alle cellelinier detektere høje niveauer od SSX1 til SSX5, bestemt under anvendelse af RT-PCR (figur 1 og figur S1). Cellerne blev dyrket som monolagskulturer i RPMI-medium (Sigma) suppleret med 10% tetracyclin-fri FBS (Clonetech), 100 ug /ml streptomycin, 100 U /ml penicillin og 2 mM L-glutamin med befugtet atmosfære og 5% CO

2 ved 37 ° C.

SSX-RNA Interference

En egnet RNA-interferens (RNAi) oligonucleotid målrettet alle SSX isoformer SSX (1, ​​2, 3, 4, 4B, 5 , 7, 8 og 9) og SS18 /SSX1, SS18 /SSX2 og SS18 /SSX4 fusionstranskripter udtrykt i synovial sarkomer blev identificeret ved at aligne mRNA-sekvenser af exon 5, exon 6 og 3’UTR region SSX1 til SSX5 hjælp etablerede RNAi kriterier. Inserter blev designet til at indeholde et 19-bp SSX mRNA-sekvens adskilt af en 9-nukleotid ikke-komplementær spacer, og efterfølges af den omvendte komplementære 19-bp mRNA-sekvens (figur 2A). For shRNA vektor kontrol blev en forvrænget sekvens indeholder 3 forkerte positioner også klonet ind i vektorer. shRNA oligonukleotider blev klonet i pSUPER (for stabil) og pSuperior (doxycyclin inducerbare) vektorer (Oligoengine) og screenet ved PCR og DNA-sekventering.

For SSX lyddæmpning i cellelinjer vi brugte både shRNA vektorer og også siRNA-molekyler . For at undersøge specificiteten af ​​RNAi-SSX-systemet og kontrollere off-target effekter Effekten af ​​siRNA-SSX anvendt i denne undersøgelse blev sammenlignet med kommercielt tilgængelige shRNA vektorer målrettet SSX1 og SSX2 i 3 independet cellelinier (DFW, U2OS og SAOS- 2. Dette er vist i den supplerende figur 2. Salg

i transiente transfektioner DFW blev transficeret med pSUPER SSX shRNA (SSXi) eller kontrol-RNA-vektor (SSXm) sammen med en tom vektor, der bærer et neomycinresistens kassette. Celler blev udvalgt efter transfektion i G418, der indeholder medier, og udvidet i løs vægt forud for assays. for generering af inducerbare siRNA celler blev DFW celler transficeret med tetracyclin repressoren udtrykkende vektor pcDNA6 /TR (Invitrogen) og pSuperior vektor under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge til producentens anvisninger og valgt med 8 ug /ml blasticidin og 1 pg /ml puromycin. cellekloner blev udvalgt ud fra deres effektivitet i silencing SSX ekspression efter tilsætning af doxycyclin i en koncentration på 10 ug /ml som bedømt ved western blot.

For gen transskription undersøgelser, vildtype DFW eller Saos-2 blev transficeret med siRNA-SSX eller kontrollere siRNA molekyler (Ambion). Effektiv silencing af SSX blev bekræftet i de transficerede kloner ved 8 og 24 timer før RNA-isolering og Q-RT-PCR-arrays.

I forenkling SSX tavshed celler omtales som SSX- og kontrolceller som SSX +.

Cell Cycle Synkronisering og analyser

Cellerne blev synkroniseret i G1 /S fasen ved at dobbeltklikke thymidin blok

Kort.; celler blev udpladet til 50% konfluens og behandlet med 2 mM thymidin i 12 timer, tripzinized, genudpladet og frigives i normalt medium i 8 timer, og blokeret igen i medium indeholdende 2 mM thymidin i 12 timer. For betingede silencing af SSX i synkroniseret DFW celler blev doxycyclin (10 ug /ml) tilsat til cellerne 2 timer før frigivelsen celler i normalt medium og celleprøver blev derefter opsamlet ved angivne tidspunkter og analyseret ved propidiumiodidfarvning, eller 5′- brom-2′-deoxy-uridin (BrdU) (Roche Diagnostics) farvning og FACS-analyse. Procentdelen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen blev beregnet ved anvendelse ModFit software.

Antistoffer, immunblotting og Immunpræcipitation

I SSX immunopræcipitation dyrkede celler blev lyseret i RIPA-lysepuffer (50 mM Tris HCI pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,25% Na deoxycholat, 1% NP-40) suppleret med proteaseinhibitorer (Roche). Prøver blev derefter sonikeret og centrifugeret i 10 min (14000 x g). 100 ug protein fra den resulterende supernatant blev resuspenderet i et samlet volumen på 1 ml med PBS indeholdende proteaseinhibitorer og immunpræcipiteret natten over ved 4 ° C med med 3 ug anti SSX 1-9 antistof-fl188 (Santa Cruz Technologies) koblet til protein G-Dynabeads (Invitrogen). Immunopræcipitaterne blev vasket en gang med lysepuffer og to gange med PBS resuspenderet i påsætningsbuffer (Invitrogen), opvarmet ved 70 ° C i 5 minutter og løst i 4-12% polyacrylamidgeler til Western blotting.

Til påvisning af proteiner ved Western blot blev cellerne lyseret

in situ

med lysis /loading buffer; sonikeret og opvarmet ved 70 ° C og løst i 4-12% polyacrylamidgelelektroforese for western blotting

Følgende antistoffer blev anvendt:. FL188 (rejst i kanin) til detektion af SSX 1-9, og N18 ( rejst i ged) til detektion af SSX1-4, 6 og 8, (Santa Cruz Biotechnologies), og en i hus fremstillet polyklonalt antistof mod et SSX peptidsekvens (SSX PAb); antistoffer mod cyclin-E (HE-12, Santa Cruz); P-catenin (BD Biosciences Pharmingen), Erk, Perk, Akt, Pakt (Cell Signalling). For kemiluminiscens detektion anvendte vi peberrodsperoxidase- koblede konjugater og forøget kemiluminescens-substrat detektion (ECL og Super Signal West Femto, Pierce).

Cell Levedygtighed Assay

Cellelevedygtighed blev vurderet at tælle antallet af levende og døde celler ved anvendelse trypanblåt udelukkelse celletal i tre eksemplarer. Kort fortalt 50.000 blev podet i 12 brønds plader og behandlet med 10 ug /ml doxycyclin. Celler blev trypsinbehandlet og farvet med trypanblåt på angivne tidspunkter. Hver betingelse blev kørt tredobbelt, og alle forsøg blev gentaget mindst tre gange.

Celleproliferation blev bestemt i realtid ved hjælp af xCELLigence celle analysator (Asea BioSciences), der måler den elektriske impedans af adhærente celler og udtrykkes i arbitrære enheder (celle indeks). Cell-indekset er afhængig cellevedhæftning, morfologi og spredning.

Colony Formation Assay

1 × 10

3 DFW SSXi celler blev udsået i 3 cm cellekultur-plader (i tre eksemplarer).