PLoS ONE: associering mellem Cannabinoid CB1 receptor Expression og Akt Signalering i prostatakræft

Abstrakt

Baggrund

I prostatakræft, tumor udtryk for cannabinoid CB

1-receptorer er forbundet med en dårlig prognose. En forklaring på dette foreningen kommer fra eksperimenter med transfekterede astrocytomceller, hvor en høj CB receptor udtryk rekrutter Akt signalering overlevelse vej. I den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt sammenhængen mellem CB

1 receptor udtryk og den Akt vej i et godt karakteriseret prostatakræft væv microarray.

Metode /vigtigste resultater

Phosphoryleret Akt immunoreaktivitet (Pakt-IR) scoringer var tilgængelige i databasen. CB

1 receptor immunoreaktivitet (CB

1IR) blev rescored fra tidligere offentliggjorte data ved hjælp af samme omfang som Pakt-IR. Der var en meget signifikant sammenhæng mellem CB

1IR og Pakt-IR. Endvidere sager med høje ekspressionsniveauer af begge biomarkører var langt mere tilbøjelige til at have en mere alvorlig form af sygdommen på diagnosetidspunktet end dem med lave ekspressionsniveauer. De to biomarkører havde additiv effekt, snarere end en vekselvirkning efter sygdomsspecifikke overlevelse.

Konklusioner /Betydning

Den foreliggende undersøgelse giver data, der er i overensstemmelse med den hypotese, at på et højt CB

1 receptor udtryk, den Akt signalvejen træder i kraft

Henvisning:. Cipriano M, Häggström J, Hammarsten P, Fowler CJ (2013) associering mellem cannabinoid CB

1 receptor Expression og Akt signalering i prostata Kræft. PLoS ONE 8 (6): e65798. doi: 10,1371 /journal.pone.0065798

Redaktør: Vinod K. Yaragudri, Nathan Kline Institut for Psykiatrisk Forskning og New York School of Medicine, USA

Modtaget: March 20, 2013; Accepteret: Maj 2, 2013; Udgivet: 5 juni 2013

Copyright: © 2013 Cipriano et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne takke det svenske Forskningsråd (Grant nr 12158, medicin.); den svenske Cancer Society (. Grant ingen CAN2010 /437); Lions Cancer Research Foundation, Umeå Universitet og forskningsmidler i det medicinske fakultet, Umeå Universitet for finansiel støtte. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

endocannabinoide (ECB), der omfatter G-protein koblede CB

1 og CB

2-receptorer, deres endogene ligander anandamid og 2-arachidonoylglycerol, og deres syntetiske og kataboliske enzymer, har været vist at være involveret i reguleringen af ​​proliferation, migration og invasive opførsel af en bred række af cancerceller [1] – [5]. Den menneskelige prostata udtrykker funktionelt aktive CB

1-receptorer [6], og anandamid reducerer hastigheden af ​​epidermal vækstfaktor (EGF) og prolaktin-stimuleret væksten af ​​humane prostata cancer cellelinjer på en måde, der involverer aktivering af CB

1-receptorer [7], [8]. I modsætning hertil både mitogene og, ved højere koncentrationer, antiproliferative virkninger af cannabinoider er set i ustimulerede prostatacancerceller [9] – [14], samt effekter ikke er knyttet til interaktioner med CB-receptorer [2], [14] – [16]. En række mekanismer, herunder produktion af ceramid, har nedregulering af EGF-receptorer (EGFR) og prolactin-receptorer, hæmning af RhoA aktivitet og vedvarende aktivering af ekstracellulære signal-regulerede kinaser (Erk) været impliceret i de inhiberende virkninger af cannabinoider upon prostata kræft cellevækst eller motilitet [7], [8], [12], [17].

Manipulation af indholdet af 2-arachidonoylglycerol og relaterede homologe (ved blokade eller knockdown af kataboliske enzym monoacylglycerol lipase, som er ansvarlig for hydrolysen af ​​disse lipider) reducerer overlevelse, mobilitet og de invasive egenskaber

in vitro

samt vækst

in vivo

af androgen-ufølsom PC-3 prostatacancerceller i en måde medieret delvist af CB

1-receptorer [18], [19]. Omvendt inhibering af syntesen af ​​2-arachidonoylglycerol eller transfektion af celler med fedtsyreamid hydrolase (FAAH), enzymet der er ansvarlig for hydrolysen af ​​anandamid, øger invasivitet af PC-3-celler in vitro [18], [20]. Disse data er alle i overensstemmelse med den opfattelse, at ECB-systemet, ud over at have et væld af andre regulerende egenskaber i kroppen [21], spiller en rolle i den lokale styring af cancerceller spredes.

Det modsatte af den regulerende rolle for ECB-systemet beskrevet ovenfor, er muligheden for, at ECB-systemet er dysfunktionel i tumorer, og at dette bidrager til sygdom patogenese. Flere undersøgelser har rapporteret, at markører for ECB-systemet viser en ændret udtryk i kræfttyper såsom mantlecellelymfom og kolorektal cancer [22] – [24], selv om retningen af ​​ændringen er ikke altid den samme. I en lille gruppe af tilfælde med hepatocellulær cancer, for eksempel en lav udtryk for CB

1-receptorer er forbundet med en dårligere resultat end i sager med en høj ekspression af CB

1-receptorer [25], mens det omvendte er sandt for kræft i bugspytkirtlen [26] og trin II mikrosatellit-stabil kolorektal cancer [24]. I tilfælde af prostatacancer, både CB

1 receptorer og FAAH overudtrykkes i tumorvævet sammenlignet med ikke-malign luminal epithelvæv eller celler [20], [27] – [29] og i et stort velkarakteriseret kohorte af patienter med en lang opfølgning, vi bemærkede en højere frekvens af alvorlige tilfælde (Gleason score 8-10) blandt de tilfælde med en høj tumor CB

1-receptoren og /eller FAAH immunreaktivitet [27], [29] . Endvidere for sager, efterfulgt af den forventede efter diagnosen, tumor CB

1 receptor immunoreaktivitet (CB

1IR) giver robust prognostisk information med hensyn til sygdomsspecifikke overlevelse, der er additiv, der ydes af Gleason score [27]. Således for eksempel til sager med Gleason score 6-7 på diagnosetidspunktet, de 15-årige sandsynligheder for event-fri overlevelse for CB1IR scores

vs.

≥ median score henholdsvis var 85 ± 9% vs. 44 ± 9% [27].

Mens undersøgelsen ovenstående klart associerer en høj CB

1 receptor ekspression med sygdommens sværhedsgrad og resultater i prostatacancer, det giver ingen mekanistisk information om, hvorfor dette er tilfældet. En mulig mekanisme er, at ECB-system “skifter” fra at være skadeligt for prostata kræftceller ved lav til moderat CB

1 receptor ekspressionsniveauerne til at fremme deres overlevelse ved høje ekspressionsniveauer. Det teoretiske grundlag for dette forslag kommer fra et studie med mus astrocytomceller [30]. I denne undersøgelse blev celler transficeret med plasmider indeholdende et reportergen (eGFP, et grønt fluorescerende protein) og enten ingen, CB

1 eller CB

2 receptorer. Kloner med lav til moderat eller høj receptor niveauer blev derefter udvalgt og behandlet med CB-receptor-agonist CP55,940. Ved lave til moderate receptorniveauer, agonisten forårsagede apoptose delvis skyldes en forlænget stimulering af Erk signalvejen. Imidlertid klonerne med høje ekspressionsniveauer receptor udviste derudover en aktivering af Akt signalvejen i afhængighed af CB receptoragonist. Denne vej er en “overlevelse” pathway regulerer celleproliferation og apoptose, og cellerne med høj CB receptor ekspressionsniveauer ikke apoptose i nærværelse af CB receptor agonist, medmindre Akt samtidigt blev hæmmet [30].

Selv om ovenstående undersøgelse giver et elegant forklaring på, hvorfor en høj CB receptor udtryk kan være skadelig, er det baseret på udvalgte transficerede astrocytom kloner snarere end prostatakræft. Men rapporten, at de cannabinoid receptor agonister Δ

9-tetrahydrocannabinol og

R

– (+) – methananandamide øge produktionen af ​​fosforyleret Akt (Pakt) i PC-3 celler på en måde blokeret af CB

1 receptor inverse agonist rimonabant, og at koncentrationen af ​​Δ

9-tetrahydrocannabinol anvendes (100 nM) forøger PC-3-celleproliferation [10] angiver en “Akt-switch” (dvs. en kobling af CB

1-receptorer til Akt signalvejen) er operativ i denne cellelinje under de betingelser, der anvendes af disse forfattere.

Hvis foreningen af ​​en høj CB

1 receptor udtryk med prostatakræft sygdommens sværhedsgrad og resultatet er resultatet af et skifte til Akt-medieret signalering, kan visse forudsigelser gøres: for det første tilfælde med en høj tumor CB

1 receptor udtryk ville forventes at have højere aktivitet i Akt vej, og derfor bør der være en positiv korrelation mellem CB

1IR scoringer og Pakt-IR scorer i tumorvæv. For det andet bør tumor spredning satser være højere i tilfælde med høj CB

1IR og Pakt-IR (dvs. hvor en “switch” kan virke) end i tilfælde, hvor enten den ene eller begge af disse to variabler er lav. Følgelig i den foreliggende undersøgelse har vi anvendt data fra vores prostatacancer væv microarray at udforske samspillet mellem CB

1-receptorer og Akt-signalvejen.

Metoder Salg

Patient materiale og immunkemi

tumoren pEGFR-IR og Pakt scores anvendt i den foreliggende undersøgelse blev taget fra vores database og er tidligere blevet offentliggjort [31], [32]. Vævet materiale (formalinfikserede, paraffinindlejrede prøver) blev indsamlet i Regional Hospital, Västerås, Sverige, mellem 1975 og 1991 fra i alt 419 patienter diagnosticeret med prostatakræft ved transuretral resektion for lavere urinvejssymptomer [33]. Patienterne blev fulgt indtil 2003. Tissue mikroarrays blev konstrueret og generelt mellem 1 og 8 kerner (normalt 5, herunder både primære og sekundære Gleason kvalitet områder, tumor væv) og 1-4 kerner (ikke ondartet væv) kunne scorede for den pågældende parameter. Kernerne blev scoret på grundlag af intensiteten og distribution til at give en sammensat værdi på mellem 0-4 for Pakt-IR og 0-5 for pEGFR-IR 0-5 [31], [32]. Hidtil upublicerede data for tumor ErbB2-IR (interval 0-4) var også tilgængelig i databasen. I alle tilfælde blev kernerne scoret af undersøgere, der var blind for de patientdata. Kliniske data (Gleason score, den lokale tumor score, tilstedeværelsen af ​​metastaser på diagnosetidspunktet, vurderet ved en knoglescanning, og den procentdel af prøven, der indeholdt tumor (% ca)) og Ki67 indeks, et mål for celleproliferation var alle tilgængelige i databasen (se [33], [34] for offentliggjorte rapporter om nogle af dette materiale). Forskningen etiske komité på Umeå Universitetshospital (Regional Etisk Review Board i Umeå, Sverige), der er godkendt af undersøgelsen og frafaldes behovet for informeret samtykke.

Da den oprindelige CB

1IR scoringer blev returneret af en enkelt investigator ved hjælp af en 0-3 skala [27], vi valgte at rescore de immunofarvede tumor kerner ( “NCB

1IR”), men denne gang ved hjælp af digitaliserede billeder, to uafhængige efterforskere (MC, CJF) og den samme intensitet interval som anvendes til Pakt-IR [32]. Fordelingerne ved hver intensitet blev bedømt som 0, 25, 50, 75 eller 100%. Således kan for eksempel, en kerne scoret ved 25% intensitet 1, 25% intensitet 2 og 50% intensitet 3 for biomarkør pågældende ville score 0,25 × 1 + 0,25 × + 0,5 × 3 = 2.25. Et investigator (MC) scorede også de ikke-maligne kerner. For 2594 kerner scoret af begge forskere (herunder et par ikke-maligne kerner uforvarende scoret af CJF), en intra-class korrelationsanalyse ved hjælp af en blandet model og test for sammenhæng gav en Chronbach alpha på 0,94, og 1837 (71%) af kernerne blev scoret ≤0.5 enheder af hinanden. Eftersom kerner med farvning sted mellem intensiteten enheder (0, 1, 2, 3 og 4) og fordelingen rater (0, 25, 50, 75 og 100%), der anvendes er ikke ualmindelige, en forskel i scorer på op til 1 kan accepteres. I alt 95 (3,7%) af kernerne havde forskelle i scoringer større end 1. Forskellene i disse tilfælde kunne skyldes, for eksempel på grund af typografiske fejl eller mønstre af immunoreaktivitet, der var vanskelige at score. Følgelig blev disse rescored, igen uafhængigt og uden adgang de tidligere scores. Efter rescoring blev 6 kerner kasseret på grund af dårlig kvalitet (dvs. ikke anses score-stand af begge undersøgere), 88 kerner nu havde scorer inden for 1 enhed af hinanden, og kun 1 kerne med en score forskel større end 1 tilbage. Denne kerne blev derfor udelukket. Det store antal kerner analyserede udtryk for, at flere sider blev farvet mere end én gang, da teknisk fejl (manglende farvning) var mistænkt i de første tre til fire rækker af første sæt kerner på hvert dias. Dette blev bekræftet, da de individuelle scores blev analyseret: fordelingen af ​​scorer for positionerne 1-4 til det første sæt kerner blev betydeligt venstre-forskudt (dvs. mange scoringer af 0-1 returneres) i det første løb i forhold til de efterfølgende kørsler, hvorimod afgivelsen af ​​de scorer for positionerne 5-enden (enten 7 eller 8, afhængigt af dias) var meget ens for de første og de efterfølgende kørsler. Som følge heraf blev scorer for alle positionerne for den første kørsel og første sæt scoringer kasseret. Median værdier blev derefter bestemt for de scores for hver investigator (kun kerner bliver scoret af begge efterforskere blev anset), og scoringer blev derefter gennemsnit inden den tilsættes til databasen. Sammenhængen mellem den oprindelige CB

1IR tumor scores (skala 0-3) og den nationale centralbank

1IR tumor scores (skala 0-4) var meget høj (Spearman Rho = 0,81, P 0,0001, n = 364) , og den optimale (Youden) score identificeres ved en Reporter Operated Karakteristisk (ROC) kurve af den nationale centralbank

1IR data for patienter behandlet med den forventede efter diagnosen med en 15 år cut-off var på et split på snesevis af ≤2.75 og . 2,75

Statistik

Tre statistiske softwareprogrammer blev brugt. De intraclass korrelationskoefficienter, Cox proportionel-farer regression og to-trins cluster analyser blev udført ved hjælp af IBM SPSS softwareversioner 20 og 21. De ordinale regressionsanalyser blev gennemført ved hjælp af software udviklet i R projekt for statistisk computing (version 2.15.2) [ ,,,0],35]. Alle andre statistiske beregninger blev foretaget ved hjælp af den statistiske pakke indbygget i GraphPad Prism 5 og 6 computerprogrammer til Macintosh (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). For overlevelse analyser, blev en begivenhed defineret som dødsfald som følge af prostatakræft og trådte i databasen som “event = 1”, hvorved bestemmelsen af ​​sygdomsspecifikke overlevelse. Døden fra andre årsager blev censureret, som var tilfælde, hvor patienten var i live på tidspunktet for sidste opfølgning. Tre sager, hvor resultatet sygdommen var ukendt, blev udelukket fra overlevelse analyser.

Resultater

Korrelation af CB

1IR og Pakt-IR i prostatakræft væv microarray prøver

i tabel 1 er Spearman Rho værdier givet for sammenhængen mellem NCB

1IR og Pakt-IR scoringer i tumor prøver. Hvis

1IR og Pakt-IR ville forventes en høj tumor CB

1 receptor ekspression resulterer i en switch til en Akt vej [30], en positiv korrelation mellem den nationale centralbank. Dette blev faktisk fundet (Spearman Rho = 0,29, P 0,0001, n = 274) for tumorer. En meget lignende værdi blev set (Spearman Rho = 0,27), når den oprindelige CB

1IR scores [27] blev anvendt i stedet for NCB

1IR. I teorien denne sammenhæng er den betragtelige kunne induceres mellem to uafhængige variable af en tredje faktor: hvis parameter A, for eksempel inducerede både Pakt (ved at udnytte den som en nedstrøms signalering molekyle) og samtidig forøget syntese af CB

1-receptorer, en korrelation mellem Pakt-IR og NCB

1IR ville blive set. En oplagt kandidat i den forbindelse ville være EGF-receptorer og nært beslægtede ErbB2-receptorer, da de par til Akt signalering i prostatacancerceller [36], [37]. Faktisk, i vævet microarray blev pEGFR-IR- og ErbB2-IR scores korreleret med Pakt-IR i tumorvævet (tabel 1 og [32]). Men den første og anden ordens korrelationskoefficienter for Pakt-IR og CB

1IR, beregnet som beskrevet i [38], fortsat betydelig, når styret for pEGFR-IR og ErbB2-IR (tabel 1). Der var ingen signifikant sammenhæng mellem den ikke-maligne Pakt-IR og NCB

1IR scores (Spearman Rho = 0,066, n = 232, P = 0,32).

De enkelte scores anvendes i denne korrelation blev opnået fra 1-8 tumor kerner pr tilfælde (se metoder). Eftersom kernerne omfatter en tumor tilfælde bestå af både primære og sekundære Gleason karakteren områder [33], er det muligt, at en korrelation kan ses på niveauet af kernen, dvs. at en kerne fra en given sag med en lav CB

1IR vil have en lavere Pakt-IR end en anden kerne fra samme sag med en høj CB

1IR (se fig. 1A for eksempler på to kerner fra samme tilfældet med dramatisk anderledes CB

1IR) . Derfor undersøgte vi sammenhængen mellem NCB

1IR og Pakt-IR i de enkelte kerner. I betragtning af det store antal kerner scoret for begge parametre (n = 892), kunne vi opdele dataene tilfældigt i en prøveopstilling (n = 594) og validering sæt (n = 298) af kerner. I begge sæt blev en signifikant sammenhæng set, med kerner i den øverste kvartil af CB

1IR har en signifikant større Pakt-IR end i de to nederste kvartiler (fig. 1B, C).

Panel a viser to tumor kerner fra den samme sag (Gleason score 7), der viser en stor variation i CB

1IR intensitet. De havde stilling 1 og 5 af tumoren serien pile. Den venstre kerne blev scoret 0,75 (50% score 0, 25% score 1, 25% score 2) af en investigator, og 1 (25% score 0, 50% score 1, 25% score 2) ved den anden. Den rigtige kerne blev scoret 2,75 af begge efterforskere (50% score 2, 25% score 3, 25% score 4 af én investigator, 25% score 2, 75% score 3 af den anden investigator). Panel B og C viser Pakt scorer for individuelle kerner i testen (n = 595, panel B) og validering (n = 297, Panel C) datasæt, opdelt i omtrentlig NCB

1IR kvadranter. Antallet af tilfælde i hver kvadrant er vist i grafen, sammen med median og interkvartile intervaller. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 for sammenligningerne viste, ellers ikke signifikant (Dunns multiple test sammenligning efter signifikant (P . 0,0001) Kruskal-Wallis test Spearman Rho for sammenhænge mellem de centrale NCB

1IR og kernen Pakt-IR var 0,29 og 0,28 (begge P 0,0001). for test og validering sæt henholdsvis

Association viser ikke kausalitet, men oplysninger om dette kan udledes fra dataene ved anvendelse af ikke-parametriske regressionsteknikker. blev valgt tilfældigt og en ikke-lineær multipel regression (npreg i R statistiske pakke) en prøve (80%) af datasættet blev derefter kørt at se, hvilke variabler var relevante, og som ikke. Denne proces blev gentaget 1000 gange, for at identificere robust relaterede variabler. Når Pakt-IR var den afhængige variabel som reaktion på NCB

1IR og pEGFR-IR, de to uafhængige variabler blev aldrig udelukkes. den samme var tilfældet, da Pakt-IR var den afhængige variabel som reaktion på NCB

1IR og ErbB2-IR, og når NCB

1IR var den afhængige variabel og Pakt-IR og enten pEGFR-IR eller ErbB2-IR var uafhængige variable. Disse data ikke tilføje oplysninger om kausalitet. Men når NCB

1IR var den afhængige variabel og Pakt-IR, pEGFR-IR og ErbB2-IR var uafhængige variable, blev Pakt-IR udelukket i 100% af tilfældene (de to andre variabler blev aldrig udelukket). I den omvendte analyse (når Pakt-IR var den afhængige variabel og NCB

1IR, pEGFR-IR og ErbB2-IR de uafhængige variable), NCB

1IR blev udelukket i 80% af tilfældene, mens de to andre variabler blev aldrig udelukket. Da udelukkelsen var højere for Pakt-IR med NCB

1IR som den afhængige variabel end for NCB

1IR med Pakt-IR som den afhængige variabel, data tyder på, at scenario, hvor aktiveringen af ​​Akt er neden for CB

1-receptorer er mere sandsynligt end den modsatte retning.

Foreningen af ​​tumor NCB

1IR og Pakt-IR med sygdommens sværhedsgrad ved diagnose

Vi har tidligere rapporteret, at både tumor CB

1IR og Pakt-IR score i denne patient materiale er associeret med sværhedsgraden af ​​sygdommen på diagnosetidspunktet [27], [32]. Kombinationen af ​​de to parametre har dog ikke undersøgt. I fig. 2, de individuelle værdier for sager scorede for både CB

1IR og Pakt-IR er farvekodet på grundlag af deres kliniske /histopatologiske data (Gleason score, forekomsten af ​​metastaser på diagnose, tumor scenen og Ki67 indeks [en foranstaltning af celleproliferation]). Graferne er opdelt i kvadranter baseret på median scorer for de to parametre. De scatter plots tjener det yderligere formål at påvise, at selv om korrelationskoefficienten mellem CB

1IR og Pakt-IR er stærkt signifikant (se ovenfor), er det en lang vej faktisk fra at forklare den biologiske varians af datasættet. I de tilfælde, grupperet som Gleason score 4-5, 6 eller 7, var der ingen indlysende forhold mellem Gleason score og positionen på grafen. Men sager med Gleason score 8-10 købmandsbutikker i øverste højre kvadrant af grafen (fig. 3A). Tilsvarende tilfælde, hvor metastaser blev fundet ved diagnose tendens også at samles i øverste højre side af grafen (fig. 2B), som gjorde sager med en højere celleproliferation (fig. 2C) og tumor bedømmelse (Fig . 2D).

Ki67 indeks er en kontinuerligt variabel i området fra 0-48% i datasættet [34]. De trancher blev valgt her til illustrative formål, men repræsenterer bunden 50% ( “Ki67 Low”), den 50-75% ( “Ki67 mellemliggende”), og de øverste 25% ( “Ki67 høj”). De stiplede linjer i figurerne viser median score for NCB

1IR og Pakt-IR for datasættet.

Panel A viser et scatter plot af de enkelte tilfælde, således at gruppens navne i de andre paneler er lettere at følge. I Kaplan-Meier plot vist i paneler B til D,

† Pca henviser til antallet af patienter, der døde som følge af deres prostatakræft i follow-up perioden. De

2 værdier er for log-rank (Mantel-Cox) forsøg, med P-værdier er vist. Panel B, alle tilfælde; Panel C, Gleason score 4-6 tilfælde; Panel D, Gleason score 7-10 sager.

kvadranter i tal er baseret på median opdelinger af de to parametre, og uforudsete analyser af de data, der viste, at fordelingen af ​​de kliniske parametre var signifikant forskellige i de kvadranter (tabel 2). Således for eksempel% af tilfældene med Gleason scorer 8-10 varierede fra 19% (nederste venstre kvadrant) til 59% (øverste højre kvadrant) og lignende mønstre blev set for forekomst af metastaser på diagnosetidspunktet, tumor stadium den procentdel af de prøver, der indeholdt tumor (% ca) og Ki67-indekset (tabel 2).

Selvom dramatisk, de data, der er vist i fig. 2 og tabel 2 indikerer ikke, om sammenhængen mellem de to biokemiske markører og de kliniske data er simpelthen additive eller om der er en vekselvirkning til stede. Dette blev undersøgt for tre af de parametre (Gleason score,% CA og Ki67-indeks) ved anvendelse ordinal regression (kumulativ logit model). For regressioner uden en vekselvirkning parameter, bidrag Pakt-IR og NCB

1IR var betydelig, som forventet (tabel 3). Men væsentlige bidrag interaktionen Pakt-IR × NCB

1IR blev også set for Gleason score og% ca, da de blev medtaget i analysen (tabel 3).

Foreningen af ​​NCB

1IR og Pakt-IR med sygdomsspecifikke overlevelse

Omkring to tredjedele af tilfældene i databasen var blevet fulgt af den forventede efter diagnosen, hvilket er standard behandling protokol på det tidspunkt i Sverige. Disse sager kan give nyttige oplysninger med hensyn til foreningen af ​​en given biomarkør med sygdomsspecifikke overlevelse. Dette er tidligere blevet rapporteret for både Pakt-IR og den oprindelige CB

1IR scores [27], [32]. Samspillet mellem de to variable er dog ikke blevet undersøgt. For at gøre dette, har vi brugt de optimale cut-offs for de to parametre ( 2,75 og ≥2.75 for Pakt-IR [32] og Youdin cut-off værdi for NCB

1IR (≤2.75 og .. 2.75) for alle 196 patienter efterfulgt af forventede og scoret for både NCB

1IR og Pakt-IR (figur 3A viser fordelingen af ​​værdier), der var et klart mønster, hvorved sager med scoringer af begge parametre over afskæringsværdier havde en dårligere prognose end de tre andre grupper (fig. 3B). en bivariate Cox proportional-risiko regressions analyse viste, at den prognostiske oplysninger fra NCB

1IR var additiv, der ydes af Pakt-IR (tabel 4). Men det er ikke overraskende i betragtning af, at grupperne har forskellige andele af sager med forskellige Gleason score (se fig. 2A). Men med Gleason score (som en median split) blev taget i betragtning, de to parametre beholdt deres additivitet (Trivariate vigtigste virkninger analyse, tabel 4), og dette afspejles i Kaplan-Meier afbildninger af Gleason score 7-10 sager (fig. 3D). Samspillet sigt Pakt-IR × NCB

1IR var imidlertid ikke signifikant i hverken den bivariate eller trivariate analyser (tabel 4).

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse vi har udforsket forholdet mellem Pakt og CB

1 i prostatakræft tumorer og cellelinier for at undersøge muligheden for, at der er en “Akt switch” i prostatacancer. Som udgangspunkt er det måske værd at kommentere på det faktum, at aktivering af CB

1-receptorer betragtes her i form af kræft celle overlevelse, mens mange (men ikke alle) studier i cellelinjer peger på skadelige virkninger af cannabinoider upon kræft celler [1] – [5], [39]. virkningerne af cannabinoider upon tumorceller kan imidlertid være mere kompliceret. Dette er blevet påvist elegant i serum-sultede NCI-H292 lunge kræftceller: 300 nM Δ

9-tetrahydrocannabinol (THC) giver en robust stigning i celledeling, som vurderet af en thymidininkorporering assay, mens højere koncentrationer af THC ( 4-10 uM) producere en betydelig apoptose [40]. En mitogene effekt af mikromolære koncentrationer på 50 og 100 nM THC upon thymidininkorporering blev set i PC-3 prostatacancerceller hvorimod 500 nM THC var uden virkning [10]. Højere koncentrationer af THC producerer apoptose i disse celler, selv om dette synes at være medieret af en CB-receptor-uafhængig mekanisme [15]. Det er bemærkelsesværdigt, at studier, der undersøger de antiproliferative virkninger af cannabinoider ofte bruger mikro- snarere end nano-molær koncentrationer af ligander (for diskussion, se [2], [39]). Endelig antiproliferative virkninger af CB

1 receptor antagonister /inverse agonister såsom rimonabant er også rapporteret for kræft cellelinjer [41], [42], selv om det ikke er klart, om sådanne virkninger skyldes blokade af CB

1 receptorer eller off-target handlinger af forbindelserne

der er to vigtigste resultater af undersøgelsen, som diskuteres igen:.

CB

1 receptor-ekspression og Pakt udtryk er positivt korreleret i prostatakræft

En af forudsigelser af Pakt switch model er, at ekspressionen af ​​CB

1-receptorer bør være positivt korreleret til Pakt i tumorceller. Pakt er en nedstrøms effektormolekyle til en bred vifte af signalveje. Dette øger risikoen for et falsk negativt, hvor en sammenhæng mellem CB

1-receptorer og Pakt er tabt i støjen. Imidlertid blev en særdeles signifikant positiv sammenhæng mellem CB

1IR og pAktIR set og korrelationen blev bibeholdt på de enkelte kerner. Endvidere korrelationen fortsat betydelig, selv når styret til to andre receptorer kendt for par til Akt, nemlig pEGFR og ErbB2 [36], [37].

CB

1IR og Pakt-IR associeret med sygdommens sværhedsgrad ved diagnose

Flere undersøgelser har undersøgt sammenhængen mellem Pakt-IR med sygdommens sværhedsgrad som vurderet af Gleason score, tumor scenen og Ki67 indekset [32], [43] – [46]. Generelt er en høj Pakt-IR forbundet med en mere alvorlig form af sygdommen på diagnosetidspunktet, selv om der er forskelle mellem kohorter (til diskussion, se [32]). Med hensyn til CB

1IR, har to kohorter blevet undersøgt. I vores undersøgelse ved hjælp af den nuværende store kohorte af prøver fremstillet ved diagnose efter transuretral resektion for lavere urinvejssymptomer, en klar sammenhæng med Gleason score og blev fundet de andre histopatologiske foranstaltninger [27]. I modsætning hertil i et meget mindre (n = 35) kohorte af prøver fremstillet ved prostatektomi, nogen klar sammenhæng mellem CB

1 receptorekspression (vurderet i Western blot eksperimenter og ved QT-PCR) og Gleason grad blev set, selvom ekspressionsniveauerne var højere end set for kontrol væv [28] Hvorvidt patienterne modtog andre behandlinger før prostatektomi blev ikke angivet.

i betragtning af at både CB

1IR og Pakt-IR er forbundet med sygdom sværhedsgraden i vores kohorte, ville det forventes, at sager med høj score for begge mærker ville have en overrepræsentation af Gleason score 8-10 og de øvrige histopatologiske parametre sygdommens sværhedsgrad. Dette blev faktisk fundet. Men med hensyn til Gleason score og den procentdel af prøven, som blev tumorassocieret, en interaktion mellem NCB

1IR og Pakt-IR blev set. Aktivering af Akt producerer en række forskellige cellulære virkninger, herunder inaktivering af pro-apoptotisk protein BAD og en øget vækst af prostatacancerceller i en xenograft model [47], [48]. Vore resultater stemmer overens med en model, hvor en høj CB

1 receptorekspression foder i at øge Akt signalering [30] ud over at på grund af andre signalveje, og derved øge den patologiske karakter af tumorcellerne og dermed sygdomssværhedsgraden . Præcis hvordan CB

1 receptor aktivering feeds i at påvirke Akt signalering bedst undersøges i kræftceller. Men i kinesisk hamster-ovarieceller transfekteret med CB

1-receptorer, CB-receptoragonister såsom THC (1 uM), CP55,940 (25 nM) og HU-210 (25 nM) producere en robust aktivering af Akt.