PLoS ONE: Meget følsom Kvantitativ Imaging for Overvågning Single cancercellevækst Kinetics og Narkotikamisbrug Response

Abstrakte

påvisning og behandling af kræft har gjort betydelige fremskridt i de sidste mange årtier, med væsentlige forbedringer i vores forståelse af grundlæggende molekylære og genetiske grundlag for sygdommen. Trods disse fremskridt er narkotikarelaterede screening metoder væsentlige forblevet uændret siden indførelsen af ​​

in vitro

cellelinje skærm menneske i 1990. Selvom de eksisterende metoder giver oplysninger om de samlede virkninger af forbindelser på cellelevedygtighed, de er begrænset af bulk-målinger, store stikprøvestørrelser, og manglende evne til at måle spredning kinetik på den enkelte celle niveau. For virkelig at forstå karakteren af ​​kræft celledeling og udvikle personlige adjuverende behandlinger, er der behov for nye metoder, der giver kvantitative oplysninger for at overvåge effekten af ​​narkotika på cellevækst samt morfologiske og fænotypiske ændringer på enkelt celle niveau. Her viser vi, at en kvantitativ fase imaging modalitet kendt som rumlig lys interferens mikroskopi (SLIM) adresserer disse behov og giver yderligere fordele i forhold til eksisterende proliferationsassays. Vi demonstrerer disse muligheder gennem målinger på effekten af ​​hormonet østradiol og antiøstrogen ICI182,780 (Faslodex) på væksten af ​​MCF-7 brystkræftceller. Sammen med at give oplysninger om ændringer i den overordnede vækst, SLIM giver yderligere biologisk relevante oplysninger. For eksempel finder vi, at eksponering for østradiol resulterer i hurtigt voksende celler med lavere tørvægt end kontrolgruppen befolkning. Efterfølgende blokering af østrogenreceptoren med ICI resulterer i langsommere voksende celler, med lavere tørvægten end kontrollen. Denne evne til at måle ændringer i vækst kinetik som reaktion på miljømæssige forhold giver ny indsigt om regulering vækst mekanismer. Vores resultater etablere mulighederne i SLIM som en avanceret stof screening teknologi, der giver oplysninger om ændringer i spredning kinetik på celleniveau med større følsomhed end nogen eksisterende metode

Henvisning:. Mir M, Bergamaschi A, Katzenellenbogen BS, Popescu G (2014) Highly Sensitive Kvantitativ Imaging for Overvågning Single cancercellevækst Kinetics og Narkotikamisbrug svar. PLoS ONE 9 (2): e89000. doi: 10,1371 /journal.pone.0089000

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: 9 oktober, 2013; Accepteret: 13 januar 2014; Udgivet: 18 februar 2014

Copyright: © 2014 Mir et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (NSF) Tilskud: Videnskab og teknologi center på Emergent opførsel for integreret Cellular Systems cbet 0.939.511 (til GP), NSF KARRIERE 08-46.660 (til GP), cbet-1.040.461 MR (til GP), Breast Cancer Research Foundation (til BSK), National Institutes of Health (NIH) P50 AT006268 (til BSK), og en postdoc Fellowship fra Department of Defense, W81XWH-09-1-0398 (til AB). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: G. Popescu har økonomiske interesser i Phi Optics, Inc., en virksomhed, der udvikler kvantitative fase mikroskoper, som dog ikke sponsorere denne forskning. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Cell vækst og masse homeostase er blevet beskrevet som grundlæggende for biologi, men de er ikke tilstrækkeligt forstået [1]. Denne mangel kan føres tilbage til manglen på metoder, der kan kvantificere enkelt cellemasse med den fornødne følsomhed. Som et resultat, for nylig, er der gjort betydelige fremskridt i retning af at udvikle ny teknologi til at studere cellevækst. Disse fremgangsmåder kan opdeles i

mikromekaniske

[2] – [4], oversætte resonante frekvensskift af mikrostrukturer i celle opdrift masse og

optiske

[5] – [8], konvertering kvantitativ fase billeder ind tørvægt kort tæthed. Optiske metoder er ideelt egnede til at studere vækst af adhærente enkeltceller samt celleklynger. Denne evne åbner nye muligheder i kræft cellebiologi, hvor følsomme målinger af celledeling kan føre til en bedre forståelse af sygdommen samt kvantitativ overvågning af narkotika effekt. Her demonstrerer vi, at

kvantitativ fase imaging (QPI)

giver en meget følsom metode til at studere kræft cellevækst og for at teste lægemidler. Vi bruger brystcancercellelinier som en model for at bevise at princippet om vores metode.

Brystkræft udgør 30% af alle diagnosticerede kræfttilfælde og for 14% af alle kræftrelaterede dødsfald hos kvinder [9]. Et signifikant fald (7%) i forekomsten er blevet observeret siden 2002, der direkte kan henføres til en bedre forståelse af sammenhængen mellem østrogen og væksten af ​​brystkræft [10] – [16]. Denne viden har ført til udviklingen af ​​en klasse af midler, som direkte modulerer østrogenreceptoren (ER), og som nu hjørnestenen i behandling og forebyggelse i ER-positive patienter (70% af alle tilfælde) [17]. Med den erkendelse, at det er muligt at udøve kontrol over væksten kræft gennem anti-hormoner og kemoterapeutiske stoffer kom behovet for omfattende test af evt egnede forbindelser store. I 1974 blev over 40.000 forbindelser, der testes årligt bruger murine modeller [18], [19]. I 1990, NCI etableret den primære skærm på 59 humane cellelinjer, som stadig er i brug i dag [20], [21]. Denne nye primære skærm kræves metoder til at vurdere væksten

in vitro

. Adskillige metaboliske analyser blev udviklet til at måle cellevækst og levedygtighed-som hidtil har været stort set uændret [20], [22] – [26].

En udbredt metode er baseret på reduktion af en farveløs tetrazoliumsalt til opnåelse af en farvet formozan proportional med antallet af levedygtige celler. Selv om sådanne assays er nyttige til måling af den samlede cytotoksiske effektivitet af en forbindelse, stort antal celler (10

3-10

5) [27] har der skal anvendes for at undgå forkerte konklusioner af effekter såsom variable fordoblingstider [20]. Da mange lægemidler har effekt på cellecyklus arrest, der ikke resulterer i metaboliske ændringer, i nogle tilfælde kan en falsk udlæsning [28]. Ikke-tetrazolium baserede assays er også blevet udviklet. Disse assays udnytter farvestoffer, som binder elektrostatisk på basiske aminosyrer [25] og den målte signal er således lineær med celletallet. På trods af de praktiske vanskeligheder, blev en sådan reagens kendt som sulforhodamin B (SRB) til sidst vedtaget for rutinemæssige screeninger. Begge assay typer giver indirekte målinger af vækst: tetrazolium assays måler metaboliske aktivitet mens SRB analysen hovedsagelig måler total protein koncentration. Begge metoder er afhængige af hjælp et stort antal af celler, kun give bulk-målinger på hele samlingen af ​​celler, og er ude af stand til at måle tid afhængige reaktioner på medicin på celleniveau. Typisk vækst assaydata suppleret med fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) eksperimenter for at give yderligere statistisk information, og studere genekspression og cellecyklusprogression. Selvom meget informativ, FACS analyser kræver celler, der skal fjernes fra deres normale dyrkningsbetingelser, celleklynger skal adskilles, forårsager ændringer i fænotype og morfologi.

Derfor bliver det mere og mere klart, at der virkelig forstår karakteren af cancercelleproliferation og at udvikle personlige adjuvans-terapier, er der behov for nye metoder, der giver kvantitative oplysninger til at overvåge virkningen af ​​stoffet på cellevækst og de ledsagende morfologiske og fænotypiske ændringer på enkelt celle niveau. Det ideelle lægemiddel skærmen skal være følsom nok til hurtigt at vurdere virkningen på et lille antal celler til en række potentielle terapier for at direkte evaluere responset af en patient eller effektiviteten af ​​et bestemt lægemiddel. Her viser vi, at QPI [29] omhandler dette teknologiske kløft. Rumlig lys interferens mikroskopi (SLIM) [30] er en QPI tilgang, der har femtogram niveau følsomhed over for ændringer i tørvægt og kan samtidig give disse oplysninger på både enkelt celle og befolkningsniveau [31]. Slim kan kombineres med fluorescensmikroskopi til måling cellecyklusafhængig vækst [31]. I dette arbejde, bruger vi østrogenreceptoren (ER) -positiv MCF-7 brystcancer cellelinje [32], [33] som et modelsystem for at demonstrere, at Slim kan anvendes som et yderst følsomt lægemiddel proliferationsassay.

MCF-7-cellelinje har været en udbredt model til undersøgelse hormonal indflydelse på vækst brystcancer, navnlig som svar på østrogener som spiller en afgørende rolle for at fremme vækst og progression af kræftceller. Vi målte væksten af ​​MCF-7-celle klynger i standard cellekulturmedier (Veh) og under påvirkning af estradiol (E2), den fremherskende form af østrogen i reproduktive år, og ICI, 182, 780 – også kendt som Faslodex- [ ,,,0],34], en fuldstændig antagonist af ER anvendes til behandling af metastatisk brystcancer i postmenopausale kvinder. De viste resultater fastslår, at, ud over at være en værdifuld proliferationsassay, kvantitativ fase billedbehandling giver også biologisk relevant information på den enkelte celle og celle klynge population niveau, der ikke er tilgængelige via andre fremgangsmåder. Sådanne målinger i kombination med eksisterende molekylære analyser har potentiale til at forbedre drug design og karakterisering og at bygge bro over forbindelsen mellem vores molekylære forståelse af kræft og narkotikabehandling effekter på vækst og fænotypiske celle egenskaber såsom cellestørrelse /masse.

Resultater

MCF-7 celler blev podet i en to godt slide kammer og målinger blev udført i tre cellekultur (se

Materialer og metoder

for flere detaljer om cellekultur og behandling) . Først, typisk cellevækst medier som vehikelkontrollen (Veh), andet cellevækst medier indeholdende 10 nM Estradiol (E2), og endelig cellevækstmedier med antiøstrogenet 1 uM ICI182,780 +10 nM E2 (E2 + ICI). Til behandling E2 + ICI blev celler dyrket under E2 betingelser i 10 timer før ICI blev tilsat. Den 10-timers point blev valgt til at administrere lægemidlet, da dette er det tidligste tidspunkt, hvor en væsentlig forskel mellem de vækstrater Veh og E2-behandlede befolkninger blev observeret (fig. S1). En 1,55 × 1,16 mm

2 område hver brønd blev scannet hver 30 minutter ved hjælp af en kommerciel fasekontrastmikroskop udstyret med en SLIM tillægsmodul. For hvert eksperiment én brønd indeholdt en ubehandlet kontrolpopulation (Veh) og den anden brønd indeholdt E2 eller E2 + ICI behandlede population. To målinger blev udført på en sådan måde for hver betingelse. Alle data vil blive gjort frit tilgængelige på anmodning.

En skematisk af instrumentet og repræsentative SLIM billeder fra en brønd er vist i fig. 1 A og B henholdsvis. SLIM fastholder subcellulære opløsning (fig. 1 B) over et stort område ved at scanne hvert kammer i en mosaik mønster (for yderligere oplysninger om målingen refererer til

Materialer og metoder

). Fra de store mosaik billeder, kanterne af individuelle klynger (sammensat af 2-3 celler ved t = 0 timer) blev sporet ved hvert tidspunkt, og overfladearealet og total tørvægt blev målt (se Movie S1 for en tidsforskydning af synsfelt for alle grupper). På denne måde kan vi analysere både den samlede vækst tendenser for hver gruppe og heterogeniteten i klyngen niveau inden hver population. Det skal bemærkes, at denne type måling er i øjeblikket umuligt at udføre med nogen eksisterende spredning assay.

(A) Skematisk af forsøgsopstillingen. Et fuldt automatiseret kommerciel fasekontrastmikroskop udstyret med bordets øverste inkubation kontrol og x, y, z-scanning blev anvendt til at scanne en 1,5 mm x 1,2 mm område i hver brønd af en 2-brønd glide hver 30 minutter. Komponenterne i den stiplede linje omfatter SLIM tillægsmodul: Fourier Objektiv 1 (FL1) projekter eleven plan fasekontrastmikroskop på en Liquid Crystal Phase Modulator (LCPM), som giver kontrol over fase forsinkelse mellem spredte og un-spredt lys; Fourier Lens 2 projekter fase-modulerede billede på en CCD. Alle komponenter i instrumentet blev synkroniseret ved hjælp af CPU. (B) Repræsentative billeder af et scannet synsfelt i et af kamrene ved 0 timer og 94 timer, det område, den stiplede gule linje er forstørret og vist ved hvert tidspunkt (skala bar gul er 50 mikrometer). (C) Gennemsnitlig normaliseret overfladeareal for klynger i hver gruppe i de mærkede tidsperioder. (D) Gennemsnitlig normaliseret masse for klynger i hver gruppe i de mærkede tidsperioder. (C-D) Square markører angiver middelværdi, midterlinjen er median, toppen af ​​kassen er 25

percentil linje, bunden er 75

percentil linje, whiskers angiver 5

th og 95

th percentiler , signifikans blev testet under anvendelse af et ikke-parret t-test, o: p 0,05, *: p 0,05, **: p 0,01, ***: p 0,001. (E) WST-1 proliferation assay måling på 72 timer.

Temporal Ændringer i Masse og Område

Først etablerer vi mulighederne i SLIM som spredning assay ved at måle effekterne af østradiol på de relative ændringer i vækst, hvilket er kvalitativt til de oplysninger, som traditionelle analyser. Mængderne af interesse her er de relative mængder af vækst i størrelse og masse, ikke de absolutte værdier. For at udføre denne analyse, massen og overfladearealet af hver klynge er normaliseret i forhold til sin oprindelige størrelse, M (t) /M (t = 0) og område (t) /Area (t = 0), hhv. Den normaliserede område og masse for alle analyserede klynger (mindst 5 pr gruppe) blev adskilt i 15-timers placeringer som vist i fig. 1C og 1D. Der er ingen signifikant forskel i den normaliserede område ved hvert tidspunkt. Derimod forskellene i den normaliserede masse er påviselige i hele måleperioden (fig. 1 C-D). Dette understreger vigtigheden af ​​at måle masse i stedet for blot arealet af en klynge. Desuden ICI behandling får virkning hurtigt som E2 gruppe udviser større relativ vækst i massen inden for 30 timer. En forskel mellem E2 + ICI og kontrolgruppe kan detekteres ved 60 timer. Det skal bemærkes, at mens de nuværende proliferationsassays afhængige anvendelse af et stort antal celler, var slim målinger udført ved den enkelte klynge niveau.

Sammenligning med kolorimetrisk analyse

Til sammenligning målinger fra en WST-1 assay taget efter 72 timers behandling er vist i fig. 1E. Det kan ses, at der er en god kvalitativ overensstemmelse mellem dataene WST-1, hvilket indirekte indikerer proliferationshastighed, og de normaliserede målinger området efter 75 timer. Men den normaliserede masse er højere i kontrolgruppen end E2 + ICI gruppe efter 60 timer. Disse forskelle er sandsynligvis fordi WST-1 assay simpelthen måler reduktionen af ​​en tetrazolium farvestof uden for cellen. Selv om niveauet for denne reduktion er relateret til den metaboliske aktivitet af cellerne og afspejler antallet af levedygtige celler i populationen, er det ikke en direkte måling af cellulær masse eller størrelse. Endvidere er sådanne assays begrænset til tilvejebringelse af et nummer til en bulk befolkning og udgøre nogen praktisk måde at studere heterogeniteten i populationen. For bedre at illustrere den målte variabiliteten i de data den normaliserede masse og område for individuelle klynger er vist i fig. 2.

(A) Normalized masse vs. tid for alle klynger, der blev analyseret. (B) Normalized område vs. tid for alle klynger. (A-B) Stiplede linjer viser individuelle klyngedata og fuldt optrukne linier viser gennemsnitsværdier data. Stiplede linjer angiver, hvor forskellen mellem grupperne bliver signifikant.

Temporal Ændringer i Mass Growth Rate

Ud over at give en kvantitativ beskrivelse af, hvordan forskellige behandlinger påvirker relative ændringer i størrelse og masse kan SLIM også måle ændringer i vækstraten for små celleklynger som en funktion af tid eller størrelse. Måling af vækstraten med høj følsomhed er mere informativ end blot at måle relative ændringer i massen, da det giver en forståelse af, hvor behandlinger begynder at træde i kraft, og hvor længe effekten varer ved. Tørvægten density kort over typiske klynger fra hver gruppe over tid er vist i fig. 3A (se Movie S2 for). Fig. 3B viser vækstraten for klynger i hver gruppe vs. tid. kan detekteres En væsentlig forskel i vækstraten mellem alle tre grupper så tidligt som 15 timer (5 timer efter ICI behandling blev administreret), hvilket er 15 timer tidligere end den påviselige ændring i både området og masse. Selv det normaliserede masse er større for E2 + ICI gruppen end kontrollen op til 60 timer, væksten af ​​kontrollen overstiger E2 + ICI gruppe ved 45 timer. Det kan også ses, at selv om klynger i E2-gruppen opnår meget større relative masser og områder end kontrollen, er der ingen signifikant forskel i vækstraterne mellem de to grupper efter 90 timer.

(A) Dry massefylde kort over repræsentative klynger fra hver gruppe af MCF-7 brystcancerceller ved hver 22 timer. Farverne angiver tørvægten densitet ved hver pixel som vist på farven bar. Skalaen bar gule er 50 mikrometer. Bemærk, at i E2 + ICI-gruppen, blev ICI tilsat til hver prøve ved 10 timer. (B) Cluster vækstrate i hver gruppe i den viste periode. (C) Cluster vækstrate i hver gruppe som funktion af normaliseret masse. Solid linjer er vist som en vejledning for øjet at bestemme, hvordan væksten ændrer sig som en funktion af masse vækst. (B-C) Square markører angiver middelværdi, midterlinjen er median, toppen af ​​kassen er 25

percentil linje, bunden er 75

percentil linje, whiskers angiver 5

th og 95

th percentiler , signifikans blev testet ved hjælp af en un-parret t-test, o: p 0,05, *: p 0,05, **: p 0,01, ***: p. 0,001

efter plotte vækstraten som funktion af den normaliserede masse (fig. 3C) væksten tendens (eksponentiel eller lineær) af grupperne kan bestemmes. Det kan ses, at den gennemsnitlige tilvækst for klynger i E2 og VEH grupper fortsætter med at stige, indtil der opnås en 4-fold forøgelse i masse, hvorefter vækstraten er enten stabil eller aftager. Denne tendens indebærer, at i ca. to massefordoblinger begge grupper udviser eksponentiel vækst, hvorefter væksten er lineær. I modsætning hertil E2 + ICI gruppe udviser eksponentiel vækst (lineær trend i fig. 3C), indtil der opnås et 2-fold stigning i masse, hvorefter væksten er lineær (konstant kurve i fig. 3C). Det er vigtigt at bemærke her, at en fordobling i massen ikke nødvendigvis svarer til en komplet cellecyklus som både østrogen og ICI er kendt for at resultere i ændringer i, hvordan en celle udvikler sig gennem cellecyklussen, dvs. fordoblingstiden og størrelse og division både kan blive påvirket.

effekter af estradiol på Cell størrelse og fordoblingstid

for at bestemme, hvordan ændringer på enkelt celle plan bidrager til de målbare ændringer i relative størrelse, masse, og vækstrater målte vi fordoblingstiden og procentvis ændring i den gennemsnitlige cellestørrelse for individuelle celler, der udgør klyngerne (Fig. 4). Den fordoblingstid beregnes blot som, hvor

t

f

er det sidste tidspunkt,

t

0

er den indledende tidspunkt, og

N

celle (t)

er celletallet på tidspunkt

t

. Fordoblingstiderne for E2 gruppen fandtes at være betydeligt lavere end både Veh og E2 + ICI grupper (fig. 4A). Disse data viser, at østradiol inducerer celler til at dele sig på næsten det dobbelte af kontrolgruppen og at behandling med ICI næsten helt vender denne effekt. I overensstemmelse med tidligere rapporterede undersøgelser, finder vi, at østrogener accelerere celler gennem cellecyklusen, hvilket resulterer i en stigning i celleproliferation. Det skal bemærkes, at effekten af ​​ICI i stigende celle-fordoblingstid betyder ikke, at cellecyklussen returneres til normale forhold, men mere sandsynligt er et resultat af cellerne bruger en større mængde tid i en specifik fase af cellecyklussen.

(A) fordoblingstid i hver gruppe, er den gennemsnitlige fordoblingstid reduceret med 12 timer i E2-gruppen sammenlignet med VEH og E2 + ICI grupper, hvilket indikerer, at tilsætning af ICI returnerer fordoblingstiden til kontrolniveauer. (B) Procentvis ændring i den gennemsnitlige cellemasse i måleperioden for hver gruppe. Et signifikant fald i cellemassen observeres i både E2 og E2 + ICI grupper i sammenligning med kontrolgruppen. (C) Målt fordoblingstid vs. ændring i gennemsnitlig cellemasse for hver klynge, der blev målt, kan disse to parametre anvendes til at adskille de tre grupper fuldstændigt og kan tjene som en vækst signatur.

ændring i gennemsnitlig cellemasse over tid blev beregnet ved at dividere den samlede masse af hver klynge med antallet af celler i klyngen. Figur 4B viser den procentvise ændring i den gennemsnitlige cellemasse mellem de første og endelige tidspunkter for hver klynge. Resultaterne indikerer et signifikant fald i den gennemsnitlige cellemasse over tid i E2 og E2 + ICI-celler sammenlignet med kontrollen. Dette fald i cellemasse og fordoblingstid viser, at sammenlignet med kontrollen, østrogen medfører mindre, hurtigere delende celler, og at tilsætning af ICI resulterer i længere fordoblingstider sammen med mindre celler. De mindre celler i E2 + ICI grupper indebærer, at skønt fordoblingstiden er vendt tilbage til kontrolniveauer, er ICI påvirker cellernes metaboliske aktivitet og evne til at vokse normalt. Som vist i fig 4C, fordoblingstiden og ændring i gennemsnitlige cellemasse tilvejebringe en pålidelig “vækst signatur” for hver gruppe og foreslå, at niveauerne af ekspression af østrogenreceptoren eller nærvær af en ER modulator kan bedømmes simpelthen ved at undersøge disse to parametre. Da de nuværende analyser ikke giver en direkte måling af cellulær vækst, det er de første målinger, der udføres kontinuerligt på en population, der belyser, hvordan østrogen påvirker MCF-7 vækstkinetik på den enkelte celle niveau.

Diskussion

De viste resultater fastslår, at SLIM målinger af tør masse densitet kan anvendes som meget følsomme proliferationsassays. De største fordele i forhold til eksisterende metoder er, at Slim kan detektere ændringer i vækstkinetik på færre antal celler, på kortere tid, og kan bruges til at studere forskelle inden en befolkning snarere end blot at tilvejebringe et antal for størstedelen vækst af en kultur. Til sammenligning WST-1 analysen arbejder med celletal i 10

3-10

5 interval [27], mens SLIM er følsom over for ændringer i udbredelsen af ​​selv en enkelt celle. Desuden SLIM giver mulighed for at analysere væksten i de enkelte celler og klynger som en funktion af deres masse, der giver indsigt i mekanismen for regulering vækst (fx om en celle størrelse eller alder checkpoint bliver udnyttet) [35]. Disse oplysninger er utilgængelige for enhver eksisterende spredning assay. Dette system kan let anvendes til at måle vækst kinetik og fænotypiske effekter til enhver celletype og behandling.

Vores resultater viser også, at måle vækst på celleniveau og klyngeniveau ikke kun giver fordele i form af forbedret følsomhed og reduceret stikprøvestørrelser, men giver også yderligere oplysninger, der ikke er tilgængelige ved eksisterende metoder. Især viser vi kinetikken og modalitet virkningsmekanisme E2 i MCF-7. Faktisk MCF-7 under indflydelse af E2, dividere hurtigere og opnå lavere akseltryk, hvilket resulterer i et øget antal celler, der er i gennemsnit mindre. På grund af den reducerede fordoblingstiden, dette stadig resulterer i en generel stigning i den samlede masse for E2 i sammenligning med kontrolgruppen. For celler dyrket i E2 og efterfølgende behandlet med ICI fordoblingstiderne returneret til dem, der findes i kontrollen, men reduktionen i cellestørrelse var endnu større end i kontrolgruppen.

Virkningerne af E2 og anti-østrogener på celle-cyklus progression er tidligere blevet undersøgt i detaljer [11], [15], [36], [37]. Både hurtige og forbigående virkninger er blevet observeret på grund af funktionel aktivitet i både kernen (genomiske effekter) og ekstranukleære rum (ikke-genomiske virkninger) [38]. De hurtige effekter på væksten er der tydelige tegn på vores data som forskellene i væksten mellem E2 og Veh udsatte cellerne er observerbare efter 10 timer (fig. S1) og kan tilskrives den tidlige aktivering af stofskifte-relaterede gener [39 ]. Efter tilsætning af ICI, en ren ER antagonist, forskelle i vækstraten mellem E2 og E2 + ICI grupper begynder at dukke over tid (fig. 3B). De forbigående virkninger af E2 + ICI også manifesteret i, hvordan kan observeres vækstraten ændringer som funktion af øget cellestørrelse (fig. 3C), et klart brud i vækstraten når ICI klynger omtrent dobbelt størrelse.

østrogener er kendt for at aktivere transduktion kaskader, der regulerer mange gener-både positivt og negativt, som spiller en afgørende rolle i celledeling og metabolisme [10] – [15], [39]. Det har også vist sig, at østrogener forårsager ikke-cykling celler (G

0 fase) for at indtaste hele cellecyklus og hurtigt fremskridt gennem G

1 til S-fasen [11], [15], [37 ]. Denne hurtige fremadskriden gennem cellecyklussen udgør både den reducerede fordoblingstiden og reduktion i gennemsnitlig cellemasse iagttages i E2-gruppen (fig. 4). På den anden side har ICI vist sig at blokere MCF-7-celler i G0-G

1 fase [15], [28], [37]. Denne inhiberende virkning på progression gennem G1 er manifesteret i den forøgede fordoblingstiden af ​​E2 + ICI-gruppen sammenlignet med E2-gruppen. ICI påvirker også transskription af flere gener, der er ansvarlige for vækstregulering i alle faser af cellecyklus. Nedreguleringen af ​​gener, der vides at være ansvarlige for proliferation i kombination med den øgede tid tilbragt i G1 sandsynligvis ansvarlig for reduktionen i cellestørrelse observeret i E2 + ICI-gruppen [15].

Som i den tilfælde af østrogenreceptoren er celleproliferation også styres gennem aktivering og modulering af regulerende signalleringskaskader efter vækstfaktorer; måle vækst på celleniveau har potentiale til at bygge bro mellem den molekylære forståelse af vækst kræft og faktiske tumorvækst. Det er således af stor interesse at kombinere disse målinger vækst med fluorescens markører for cellecyklussen fase (som det har været tilfældet for U2OS celler [31]) eller til andre proteiner, der vides at spille nøgleroller i regulering proliferation. Måling af ændringer i vækstkinetik som en funktion af cellecyklussen eller mere specifikt gen aktiveringer, vil give mulighed for en bedre forståelse af den særlige virkning af en forbindelse /lægemiddel på cellecyklusprogression.

I summen, vi har viste en ny meget følsom proliferation assay for lægemiddel-screening applikationer. Selv om vi har fokuseret på en bestemt model celle systemet her, forsøgsopstillingen gælder uden ændringer til andre celletyper og behandlinger. Ud over at måle vækstkinetik, vores metode også samtidig giver oplysninger om cellulær morfologi og motilitet [40], og kan også let kombineres med andre mikroskopi modaliteter. En behandling senere undersøgelse vil være at forstå og karakterisere de morfologiske forskelle, der opstår som et resultat af at modulere ER (se Movie S1 og S2). De biologiske indsigter, som SLIM målinger i kombination med andre molekylære analyser vil utvivlsomt forbedre vores forståelse af kræft cellevækst i almindelighed, og har potentiale til at føre til forbedringer i design af lægemidler, beskrivelse, og terapeutisk effektivitet.

Materialer og Methods

Cell Culture

Kommercielt tilgængelige MCF-7-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og blev dyrket i MEM (Sigma-Aldrich Corp, St. Louis, MO) suppleret med 5% kalveserum (HyClone, Logan, UT), 100 ug /ml penicillin /streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA), og 25 ug /ml gentamicin (Invitrogen). Celler blev derefter podet i phenol-rød fri MEM indeholdende 5% trækul dextran behandlet kalveserum inkubere i 4 dage. To kammerobjektglas (Lab-Tek) med glasbund dækglas blev anvendt til at muliggøre side om side billeddannelse af kontrol og behandlede prøver. Mediet blev skiftet på dag 2 og 4 før behandling med vehikelkontrollen eller ligand behandlinger (estradiol (E2, 10 nM) og ICI 182.780 (ICI Fulvestrant, 1 uM)). For de kolorimetriske målinger blev en WST1-assay (Roche, Basel, Schweiz) anvendt, og absorbansen blev målt ved 450 nm under anvendelse af en BioRad 680 Microplate Reader.

under billedbehandling cellerne blev holdt ved 37 ° C og i en 5% CO2 atmosfære med en inkubator og opvarmet scene insert. Hver brønd blev scannet hver 30 minutter i en 4 × 4-flise mønster med en Zeiss EF Plan-Neofluar 10 × /0,3 PH 1 mål levere en samlet synsfelt på 1,55 × 1,16 mm

2. En z-stak på 12 skiver (48 pm) blev registreret ved hver position. Eksponeringstiden var 15 ms for hvert billede ved fuld lampe effekt (3200 K, eller 10,7 V). For hvert eksperiment blev en brønd efterladt ubehandlet for at tjene som en kontrol population og den anden brønd blev behandlet med enten E2 eller E2 + ICI tilstand. Hver tilstand blev målt sammen med sine kontrol to gange.

Imaging

Imaging blev udført ved hjælp af rumlig lys interferens mikroskopi (SLIM) [30], [41]. SLIM er et hvidt lys optisk interferometri modalitet udformet som et add-on modul til en kommerciel fasekontrastmikroskop. Kort sagt, SLIM fungerer ved at projicere tilbage omdrejningspunkt for et fasekontrast mål på en flydende fase krystal modulator (LCPM). Den LCPM er kalibreret til præcist forskyde fasen af ​​det spredte lys fra prøven i forhold til den ikke-spredte lys. Intensitet maps er optaget til af nulpunktet fase, π /2, π, og 3π /2.

SLIM setup anvendt i denne undersøgelse er baseret på en Zeiss Axio Observer Z1 (Zeiss katalog # 431.007.901.000) motoriseret omvendt forskning imaging mikroskop. Mikroskopet basen er udstyret med et motoriseret fokus drev (minimum trin bredde 10 nm). De mål, der anvendes til denne undersøgelse er en Zeiss EF Plan-Neofluar 10 × /0,3 PH 1 M27. Mellembilledet efter målet og rør linse er rettet på venstre port Mikroskopet SLIM modulet er fastgjort.