PLoS ONE: Dicarbonylforbindelser induceret Strukturelle Forstyrrelser Make histon H1 stærkt immunogene og generere en auto-immunrespons i Cancer

Abstrakt

Øget oxidativt stress under hyperglykæmiske betingelser, gennem interaktion mellem aldre med RAGE receptorer og via aktivering af interleukin medieret transskription signalering, er blevet rapporteret i kræft. Proteiner modifikationer at blive undersøgt for deres roller i udviklingen og progressionen af ​​kræft og autoantistof respons mod dem få interesse som en sonde til tidlig påvisning af sygdommen. Denne undersøgelse har analyseret ændringerne i histon H1 upon modifikation af methylglyoxal (MG) og dens konsekvenser i auto-immunopatogenese af kræft. Modificeret histon viste ændringer i de aromatiske rester, ændrede tyrosin mikromiljø, intermolekylær krydsbinding og generering af aldre. Det viste maskering af hydrofobe områder og en hypsochromic forskydning i i ANS specifik fluorescens. MG aggressivt oxideret histon H1 fører til akkumulering af reaktive carbonyler. Far UV CD målinger viste di-carbonyl induceret forøgelse af alfa struktur og induktionen af ​​beta-sheet konformation; og termisk denaturering (TM) undersøgelser bekræftede den termiske stabilitet af det modificerede histon. FTIR-analyse viste amid I bånd skift, generering af en carboxyethyl gruppe og N-Ca-vibrationer i den modificerede histon. LCMS-analyse bekræftede dannelsen af ​​Nε- (carboxyethyl) lysin og elektronmikroskopiske undersøgelser viste det amorfe aggregatdannelse. Den modificerede histon viste ændrede kooperativ binding med DNA. Modificeret H1 fremkaldte høje titre af antistoffer i kaniner og IgG isoleret form sera fra kaniner immuniseret med modificeret H1 udviste specifik binding med dets immunogen i Western blot-analyse. IgG isoleret fra sera fra patienter med lungecancer, prostatacancer, brystcancer og cancer i hoved og hals region viste bedre anerkendelse for neo-epitoper på det modificerede histon, afspejler tilstedeværelsen af ​​cirkulerende autoantistoffer i cancer. Da rapporter tyder på en sammenhæng mellem AGE-RAGE-aksen og carcinogenese, glycoxidation af histon H1 og dets immunogenicitet baner måder til at forstå rolle glycoxidatively beskadigede nukleare proteiner i kræft

Henvisning:. Mir AR, Uddin M, Khan F, alam K, Ali A (2015) Dicarbonylforbindelser induceret Strukturelle Forstyrrelser Make histon H1 stærkt immunogene og generere en auto-immunrespons i Cancer. PLoS ONE 10 (8): e0136197. doi: 10,1371 /journal.pone.0136197

Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, KINA

Modtaget: April 18, 2015; Accepteret: 31 Juli 2015; Udgivet: 28 August, 2015

Copyright: © 2015 Mir et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en af ​​de dødeligste sygdomme er ansvarlige for et stort antal dødsfald over hele verden og dens tidlig påvisning indtager scenen i at reducere sin samlede offentlige effekt [1-2]. I denne forbindelse, identifikation og evaluering af autoantistoffer til modificerede proteiner hos cancerpatienter holder fremtrædende plads i biomarkør udvikling til tidlig påvisning af sygdommen. Forskellige posttranslationelle protein modifikationer (PTMS) opstår under udviklingen af ​​kræft antages at have betydning for deres diagnostiske relevans [3-4].

Nærmere oplysninger om PTMS, ligesom dannelsen af ​​avancerede glykering slutprodukter (AGEs ) med rolle i udviklingen og progressionen af ​​kræft også opstå [5]. Det er blevet rapporteret, at cancerscreate et gunstigt miljø for produktion af AGEs på grund af deres højere optagelse af glukose til at opfylde deres energibehov [6-8]. Glycosyleringen dannede produkter har potentiale til at binde makrofagerne via makrofag scavenger receptor og, i raserianfald og dermed bidrage i udviklingen af ​​kræft via deres pro-inflammatoriske egenskaber og ved at udnytte kravet om aktivering af interleukin 6 (IL-6) -medieret mitokondrie signaltransducere og aktivatorer af transkription 3 (STAT3) [9-11]. Epidemiologiske beviser på den molekylære heterogenitet af cancere afslører genotoksiske virkninger af akut carbonyl stress, hvilket gør diabetespatienter udsat for forskellige former for cancer [12]. AGEs induceret genotoksicitet i tubulære celler med mulige konsekvenser i forbedret udvikling af kræft i avancerede nyresygdomme peger også i retning af samme korrelation [13].

Påvisning af autoantistoffer genereret mod afvigende forarbejdede proteiner i kræft, der er immunogene og stimulerer cellulær og humorale immunrespons har ført til en række undersøgelser med henblik på påvisning af cancer autoantigener på mønstret for rheumatoid arthritis, hvor anti IgG-antistoffer er blevet rapporteret som et diagnostisk biomarkør [14]. Blandt de proteiner, post-translationelle modifikationer af histoner, især har en vigtig rolle i genekspression og dermed i udviklingen af ​​kræft og progression, og ændringer bliver også undersøgt som potentielle biomarkører for sygdomsprogression og prognose [15-16].

Desuden blandt glycating midler methylglyoxal (MG), en dicarbonylforbindelse forårsaget af forskellige metaboliske veje er blevet identificeret som en vigtig precursor i modificering af forskellige proteiner, med 50.000 gange morereactivity end glucose, med både intracellulære og ekstracellulære proteiner, ved fysiologisk koncentration [17] samt ved højere koncentrationer [18] og er blevet forbundet med en rolle i en overflod af sygdomme [9, 19]. Methylglyoxal medierede forstyrrelser kan fremkalde strukturelle og funktionelle ændringer i den nukleare protein histon H1 med mulige konsekvenser i immuno-biologi af forskellige typer af kræft.

I denne undersøgelse blev histon H1 inkuberet med stigende koncentrationer af methylglyoxal at generere aldre. MG inducerede strukturelle ændringer i histon H1 blev analyseret ved UV, fluorescens og CD spektroskopi, poly acrylamid gelelektroforese, Fourier transform infrarød spektroskopisk analyse (FTIR), carbonylindhold bestemmelse, overfladehydrofobicitet (H

0) estimering væskekromatografi mass spektroskopi (m /z analyse), scanningselektronmikroskopi, og ved at studere de ændrede interaktioner i binding med DNA. Den mulige immunogenicitet indfødte og de modificerede histoner blev konstateret i kaniner. Cirkulerende autoantistoffer til stede hos patienter withvarious kræftformer blev vurderet for deres binding til indfødte og MG modificeret histon H1 gennem direkte bindende og konkurrencedygtige hæmning studier i ELISA og ved gelforsinkelsesassay.

Materialer og Metoder

histon H1, 2,4-dinitrophenyl hydrazin (DNPH), 1-anilinonaphthalen-8-sulfonsyre (ANS), natriumdodecylsulfat (SDS), methylglyoxal, aminoguanidin-hydrochlorid, diethylentriaminpenta-eddikesyre (DTPA), natrium azid, ethidiumbromid, protein A-agarose (2,5 ml præ-pakket søjle), agarose, natriumazid, Tween-20, dialyse slangerne, anti-humant og anti-kanin IgG, alkalisk phosphatase-konjugat, para-nitrophenylphosphat, Freunds komplette og ufuldstændige adjuvanser blev indkøbt fra Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA. Acrylamid, bisacrylamid, ammoniumpersulfat (APS) og N, N, N ‘, N’-tetramethylethylendiamin (TEMED) var fra Bio-Rad Laboratories, USA natriumhydroxid, ethylendiamintetraeddikesyre (dinatriumsalt), methanol, iseddike, iso- propanol, natriumchlorid, natriumcarbonat, natriumnitrit, sølvnitrat, xylen, natriumhydroxid, formaldehyd, natriumbicarbonat, ethanol, ammoniumsulfat og ammoniumpersulfat blev opnået fra Qualigens, Indien. Polystyren mikrotiterplader fladbundet ELISA-plader og moduler blev købt hos NUNC, Danmark. Alle andre kemikalier /reagenser var af højeste analytisk kvalitet til rådighed.

Bestemmelse af proteinkoncentrationen af ​​histon H1

molær ekstinktionskoefficient af kalvethymus-histon H1 (1280 M

-1cm

-1) blev anvendt til at bestemme koncentrationen af ​​proteinet ved at måle absorbansen af ​​proteinopløsninger ved 280 nm. Kalvethymushiston H1 molekylvægt bruges til beregninger var 21500 Dalton.

Ændring af H1 histon ved methylglyoxal

Den procedure givet af Roberts

et al

. [20] blev fulgt. Histon H1 modifikation blev udført i phosphatpuffer saltvand (10 mM natriumphosphatbuffer, pH 7,4 indeholdende 150 mM NaCl). Histon H1 (42 uM) prøver blev modificeret ved inkubation med varierende koncentrationer af methylglyoxal (2,5, 5, 7,5 og 10 mM) i 24 timer ved 37 ° C. Alle prøver blev udstrakt dialyseres efter inkubation.

Absorbans spektroskopi

Absorptionsprofilen af ​​indfødte og methylglyoxal-modificerede H1 histoner blev optaget på Shimadzu spektrofotometer (UV 1700 model) i bølgelængdeområdet på 250 -500 nm ved hjælp kvarts cuvette 1 cm vejlængde på ved konstant temperatur.

Fluorescens undersøgelser

Fluorescens spektre blev optaget på Shimadzu (RF-5301-PC) spectrofluorophotometer ved 25 ± 0,1 ° C i en 1 cm vejlængde celle ved 3 nm spaltebredde.

Vi målte iboende fluorescens af spændende protein prøverne ved 275 nm og optagelse emission spektre i 300-400 nm.

Tab i fluorescensintensiteten (FI) blev beregnet under anvendelse af følgende ligning:

natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese

Methylglyoxal medierede modifikationer i histon H1 blev analyseret ved anvendelse af ikke denaturerende ikke-reducerende lodret natriumdodecylsulfat -polyacrylamid gelelektroforese (PAGE) som beskrevet af

Laemilli

, med mindre ændringer [21]. 25 ug af native og modificerede histon Prøverne blev blandet med en fjerdedel volumen af ​​prøvebuffer (50% glycerol og 0,002% bromphenolblåt i 1 M Tris-HCI, pH 6,8) og påført i brøndene på 10% SDS polyacrylamidgel. Gelen blev kørt ved 80 volt i 4 timer ved stuetemperatur og derefter farvet med sølvnitrat og fotograferet af Molecular Imager Gel Doc XR-system.

Yderligere undersøgelser blev udført på histon H1 modificeret med 7,5 mM methylglyoxal med nativt histon H1 tjener som kontrol

AGE Assay

AGE-specifik fluorescens blev målt ved 440 nm efter excitation ved 370 nm og stigningen i fluorescensintensitet (FI) blev beregnet ved følgende ligning.:

Bestemmelse af overfladehydrofobicitet (H

0)

overfladen hydrofobicitet blev bestemt med den fluorescerende probe 1-anilinonapthalene- 8-sulfonsyre (ANS) ved fluorescens-spektroskopi som pr en etableret protokol [22]. Molforholdet mellem H1 histon og ANS blev taget som 1:10 og emissionsspektre blev registreret mellem 400-600 nm. Procentvis ændring i fluorescensintensitet (FI) blev beregnet ved følgende ligning:

Bestemmelse af reaktiv carbonyl indhold

Den kritiske evaluering af protein carbonyl indhold fungerer som biomarkører for protein oxidative skader. Vi analyserede carbonyl indhold af nativt og methylglyoxal modificeret histon H1 (MG-H1) ifølge den offentliggjorte protokol med små modifikationer [23]. Native og methylglyoxal (7,5 mM) modificeret histon H1-prøver blev tilsat lige store mængder af 10 mM DNPH i 2,5 M HCI. Prøver blev hvirvlet med regelmæssige mellemrum og inkuberes i mørke i 15 minutter ved stuetemperatur. Disse blev inkuberet med 10% TCA i 15 minutter ved -20 ° C og centrifugeret ved 4 ° C i 15 minutter ved 9000 g. Protein- pellets blev vasket tre gange med iskold ethanol /ethylacetat (1: 1) Efter bortkastning af supernatanten og centrifugeres i 2 min ved 9000 g mellem alle vaske. Efter den sidste vask blev pelleten suspenderet i 1 ml 6 M guanidin-HCI og blandes korrekt. Proteinprøver blev derefter fuldstændigt opløst ved at efterlade ved 37 ° C i 15-30 min. Når protein pellets blev fuldstændigt opløst, blev koncentrationen af ​​DNPH bestemt ved absorbans måling ved 360 nm mod guanidiniumchlorid (som blindprøve) anvendelse af den molære ekstinktionskoefficient på 22000 M

-1cm

-1. Absorbansen af ​​prøverne blev taget ved 276 nm og protein carbonylindhold blev udtrykt som nmol mg

-1 protein.

cirkulær dikroisme Bestemmelse

Cirkulær dikroisme evaluerer ændringerne i protein sekundær struktur, foldning og deres bindingsegenskaber. Vi udførte Far-UV CD spektralanalyse af indfødte histon H1 og dens MG modificerede produkt ved hjælp af J-815 JASCO spektropolarimeter. Instrumentet blev knyttet til en mikrocomputer med en termostatstyret celle holder fastgjort til Neslab s RTE 110 vandbad med en temperatur nøjagtighed på ± 0,1 ° C. Scanningerne blev taget ved bølgelængde intervaller på 1 nm ved 25 ° C. Alle scanninger blev optaget ved bølgelængde intervaller på 1 nm. Spektra blev indsamlet ved 50 nm min

-1 scan hastigheder, 0,1 nm data banen og en responstid på 2s. Spektrene blev registreret i langt UV-området mellem bølgelængder 190 til 250 nm og proteinkoncentrationen var 0,2 mg /ml. Resultaterne blev opnået i molært resterende ellipticitet (θ) (deg /cm

2 /dmol) ved en bølgelængde λ, baseret på ligningen nedenfor [24] Er sædet θ

obs er den observerede ellipticitet i grader,

C

p er den molære fraktion og

l

er længden af ​​lysbanen i centimeter. Den α-helix indhold af forskellige histon H1 prøver blev beregnet ud fra θ værdier ved 222 nm (MRE

222) ved følgende ligning.

termiske denaturering Studies (Tm) ved Far-UV CD

termo-stabilitet af den sekundære struktur af histon H1 og dens MG modificeret form blev analyseret ved Far-UV CD spektroskopi ved 222 nm fra 20 ° C til 90 ° C under anvendelse af en temperatur hældning på 1 ° C /min.

Fourier Transform Infrared-spektroskopisk analyse-Svækket Total reflektans (FTIR-ATR)

Fourier Transform Infrared (FTIR) spektroskopi blev udført for at analysere den sekundære struktur af histon H1 og MG modificeret histon hjælp Perkin Elmer FT-IR spektrofotometer. Infrarøde spektrale målinger blev registreret mellem 1000 cm

-1 til 4000 cm

-1. FTIR undersøgelser blev udført ved 10 mg /ml proteinkoncentration.

Væskekromatografi massespektroskopi (m /z analyse)

HPLC-systemet blev forbundet til en time-of-flight massespektrometer (LCMS-IT-TOF, Shimadzu) udstyret med en elektrospray-interface drives på en positiv ion-mode med spænding sat til 4,5 kV. Temperaturen af ​​turbo ion gas var 250 ° C. Fuld scanning MS-analyse blev udført i området fra 0-240 m /z-forhold. De MS resultater opnået for histon proteiner blev sammenlignet med CEL standard [25].

Scanning (SEM) undersøgelser

De mikro-arkitektoniske detaljer i indfødte og MG modificerede histoner blev observeret hjælp scanningselektronmikroskop. Lufttørret prøver blev adsorberet på cellulose ultrafiltreringsmembran. Prøverne blev overtrukket med guld og monteret på en carbon tape belagt rustfrit stål net, der opererer på en accelererende spænding på 15 kV og i lavt vakuum tilstand. Billederne blev taget med et JSM-6510LV (JEOL JAPAN) scanning elektronmikroskop kører [26]

Ændringer i interaktion med DNA:. Cirkulær dichroisme (CD) analyse

Interaktion af indfødte og MG modificeret histon H1 med DNA blev analyseret ved CD spektroskopi. 50 ug /ml DNA blev inkuberet i 1 time med 0,2 mg /ml nativt H1 og MG modificeret H1 henholdsvis 0,05 M tris-puffer, pH 7,4. Prøverne blev underkastet centrifugering ved 14000 rpm i 8 minutter og CD-spektre blev registreret for supernatanten. Native DNA af samme koncentration blev taget som kontrol. For at undgå enhver interferens fra protein, blev alle målinger taget ved længere bølgelængder mellem 220 cm

-1 til 330 cm

-1.

Immunologiske undersøgelser og vestlige blotting

tilfældigt opdrættet hvide New Zealand kaniner, der vejer 1-1,5 kg blev udvalgt til immunizationas pr den etablerede protokol af vores laboratorium [27]. Serum immunoglobulin G (IgG) fra forsøgsdyr blev isoleret ved affinitetskromatografi på protein A-agarose-søjle [28] og Western blotting blev udført som pr protokollen angivet i den tekniske brochure for ECL Plus Western Blotting (Amersham, UK) til etablere specificiteten af ​​antistoffer genereret mod indfødte og modificerede histoner H1 i kaninerne [29].

Indsamling af blodprøver til kliniske studier

for at sonden tilstedeværelsen af ​​auto-antistoffer mod indfødte og MG modificeret histon H1 blev sera opnået fra kræftpatienter (n = 83) af forskellige aldersgrupper deltog i JN Medical College Hospital, Aligarh, Indien, efter informeret samtykke. Prøverne blev opnået efter omhyggelig klinisk undersøgelse af patienter med dokumenteret histopatologisk diagnose. Populationen inkluderede lungekræftpatienter (n = 27), prostata (n = 19), bryst (n = 22) og patienter, der har kræft i hoved og hals region (n = 15) .Der var 49 kvinder med en gennemsnitsalder på 38,5 ± 22,9 år og 34 hanner af 36 ± 18,3 år gennemsnitsalder. Alderen af ​​alle patienter faldt mellem 15 til 63 år. Prøver fra raske individer (n = 40; 20 hanner 20 kvinder med en gennemsnitsalder på 36 ± 18,6 år) tjente som kontrol. Serumprøverne blev opvarmet ved 56 ° C i 30 min for at inaktivere komplement-proteiner og opbevaret ved -20 ° C med 0,2% natriumazid. Serum antistof-binding blev evalueret ved hjælp af ELISA.

Etik Statement

Denne undersøgelse blev behørigt godkendt af Institutional Etisk Udvalg (1617 /FM /22-01-2013) og Animal Etisk Udvalg (8289 /oah /21-02-2013), behørigt registreret under Udvalget til brug ved kontrol og tilsyn af dyreforsøg (CPCSEA) Indien (CVR-nr. 401 /RO /C /2001 /CPCSEA), Efterfyld JN Medical College, det Medicin, AMU.

Blodprøver blev indsamlet fra patienter og raske forsøgspersoner efter informeret mundtlige samtykke. Tilstanden lavalder blev behørigt godkendt af den etiske komité. En korrekt registrering af alle patienter og raske individer er blevet opretholdt.

Isolering af IgG ved affinitetskromatografi

Serum immunoglobulin G (IgG) blev isoleret ved affinitetskromatografi på protein A-agarose-søjle [ ,,,0],28]. Serum (0,5 ml) fortyndet med samme volumen PBS (pH 7,4) blev påført på toppen af ​​søjlen præ-ækvilibreret med den samme puffer. Vasken gennem blev recirkuleret 2-3 gange og ubundet materiale blev fjernet ved omfattende vask med PBS. Det bundne IgG blev elueret med 0,58% eddikesyre i 0,85% natriumchlorid og opsamlet i et rør indeholdende 1,0 ml 1,0 M Tris-HCl (pH 8,5). 3 ml fraktioner blev opsamlet og aflæst ved 280 nm. IgG-koncentrationen blev bestemt under hensyntagen 1,4 OD280 = 1,0 mg IgG /ml. Det isolerede IgG blev dialyseret mod PBS og opbevaret ved -20 ° C med 0,1% natriumazid.

direkte binding ELISA

ELISA blev udført på fladbundede polystyren plader som beskrevet tidligere [27] . Polystyren Polysorp mikrotiterbrønde blev hver coatet med 100 pi native eller methylglyoxal modificerede proteiner (10 ug /ml). Absorbansen (A) i hver brønd blev overvåget ved 410 nm på en automatisk mikropladelæser. Hver prøve blev kørt i to eksemplarer, og resultaterne blev udtrykt som gennemsnit af to behandlinger.

Konkurrence ELISA

antigen specificitet af antistofferne blev bestemt ved konkurrence-ELISA [27] .Varying mængder af inhibitorer (0-20 ug /ml) blev blandet med en konstant mængde affinitetsoprenset IgG, og blandingen blev inkuberet ved stuetemperatur i 2 timer og natten over ved 4 ° C. Immunkomplekset således dannede blev coatet i brøndene i stedet for IgG. De resterende trin var samme som i direkte bindende ELISA. Procentvis inhibering blev beregnet under anvendelse af formlen:

Band ændring-assay

I den visuel påvisning af antigen-antistof-binding og immunkompleksdannelse, gelforsinkelsesassay blev udført [30]. Immune komplekser blev fremstillet ved at inkubere en konstant mængde af native og MG-modificerede histoner med varierende mængder af affinitetsoprenset immunt IgG fra sera fra cancerpatienter i TBS i 2 timer ved 37 ° C og natten over ved 4 ° C. En fjerdedel af prøve farvestof blev tilsat til blandingen, og elektroforesebehandlet på 10% SDS-PAGE i 4 timer ved 80 V. Gelerne blev visualiseret under anvendelse af sølvnitrat-farvning [21].

Statistisk analyse af resultater

Alle målinger blev udført i dubletter. Resultater udtrykkes som middel ± S.D. En to tailed

s Drømmeholdet værdi lavere end 0,05 blev anset for at være signifikant.

Resultater

Absorbans spektroskopi

UV-spektrum af indfødte histon H1 viste en karakteristiske top for proteiner ved 277 nm. Histon H1 modificeret med 2,5, 5, 7,5 og 10 mM af methylglyoxal udviste 67,87%, 90,16%, 94,54% og 96,64% hyperchromicities i de spektrale spidser hhv. En pukkel ligesom peak blev fremtrædende ved 340 nm i de modificerede proteiner ved de højere koncentrationer af MG. Resultaterne er vist i figur 1.

Intrinsic Fluorescens

fluorescens maksima for indfødte histon H1 blev opnået ved 305 nm-et karakteristisk træk ved tyrosin emission. Den inkubation af histon H1 med stigende koncentrationer af methylglyoxal førte til et betydeligt fald i fluorescens intensitet. 2,5, 5, 7,5 og 10 mM methylglyoxal modificeret H1 histon udviste et fald på 31,31%, 49.68%, 81,78% og 95,31% i indre fluorescens intensitet sammenlignet med nativt H1 histon. Den voksende methylglyoxal i proteinprøverne førte til et rødt skift af 3, 6, 8 og 10 nm i emissionsbølgelængde. Desuden blev yderligere pukkel ligesom toppe observeret i den modificerede protein ved 440 nm. Resultaterne er vist i figur 2.

elektroforetisk analyse

SIDE Resultaterne viste en øget elektroforetisk mobilitet i de modificerede protein prøver i forhold til den indfødte histon. De modificerede proteiner præsenterede en øget bånd strækker sig så mod den indfødte histon. En ekstra bånd viste sig også i de modificerede proteiner ved en molekylvægt højere end den for nativ histon H1. Resultaterne er vist i figur 3.

PAGE-analyse af nativt og MG modificeret histon H1: 25 ug hver af nativt histon H1 og 2,5, 5, blev 7,5 og 10 mM methylglyoxal modificerede modstykker fyldt i brøndene af 10 % polyacrylamid gel under ikke-denaturerende betingelser (bane 1-5), bane 6 viser molekylvægtmarkøren.

ALDER assay

under identiske betingelser, indfødte histon H1 gav ingen mærkbar AGE fluorescens. De observerede fluorescens intensiteter for indfødte og modificeret histon H1 var 7,886 ved 430 nm og 39,21 ved 446 nm. MG-H1 udstillet 79,88% stigning i AGE fluorescensintensitet. Resultaterne er vist i figur 4.

overfladehydrofobicitet (H

0)

Et signifikant fald i ANS fluorescensintensitet i MG modificeret H1 i forhold til nativt histon var observeret. Native og MG modificeret H1 viste fluorescensintensiteter af 26.12 ved 279 nm og 5,21 ved 276 nm, hvilket svarer til et fald i ANS fluorescensintensitet med 79,97% i tilfælde af det modificerede histon. En blå forskydning af 3 nm blev også set i tilfælde af modificerede protein. Resultaterne er vist i figur 5.

Reaktiv carbonyl indhold

spektrofotometrisk kvantificering af reaktive proteinbundne carbonyler efter omsætning med 2,4-dinitrophenylhydrazin (DNPH) viste absorbansværdier på 0,055 og 0,624 for indfødte og modificeret histon H1 henholdsvis 370 nm. Carbonyl-indholdet var 2,47 nmol /mg af protein i nativ histon H1 og 28,36 nmol /mg af protein i tilfælde af methylglyoxal modificeret histon H1 viser en 11,48 gange stigning i reaktive carbonyler. Resultaterne er vist i figur 6.

Cirkulær dichroisme-spektre

CD spektralanalyse viste synlig forskel i molære ellipticities af nativ og modificeret histon ved tre bølgelængder nemlig., 190 nm, 201 nm og 222 nm. Vi observerede en stigning i positiv ellipticitet ved 190 nm, et fald i negativ ellipticitet ved 200 nm og en stigning i den negative ellipticitet ved 222 nm. Den observerede ellipticitet ved 190 nm for native histon og methylglyoxal modificeret H1 var 0,909 mdeg og 1,249 mdeg hhv. Den negative ellipticitet blev opnået ved 200 nm og 222 nm. Ved 200 nm CD (θ) værdier for indfødte histon og methylglyoxal modificeret H1 var – 33,615 mdeg og – 33,132 mdeg og 222 nm værdierne var -8,39 og -10,2 henholdsvis. Resultaterne er vist i figur 7.

termiske denaturering Studies (Tm) ved Far-UV CD

Ændringerne i de sekundære strukturelle træk opnået ved smeltning temperaturstudier ved at følge udfoldningen mønstre af proteinerne gennem tab i ellipticitet ved 222 nm, viste tidligt helix åbning i det native histon sammenlignet med MG modificerede histon. Midtpunktet smeltetemperatur (Tm) af nativt og MG modificeret histon H1 kom ud for at være 53 ° C og 64 ° C. Resultaterne er vist på figur 8.

FTIR-ATR spektroskopisk analyse

FTIR resultater af nativt histon H1 viste vibrationelle strækning af C = O, en karakteristisk amid I bånd ved 1635 cm

-1. Men efter modifikation, fik amid I bandet flyttet til 1640 cm

-1. Selvom der optrådte ingen dybe bånd i amid II-region, men forskellen i procent transmittans i denne region var synlig. Vi indspillede mindre transmittans for indfødte histon i forhold til sin ændrede form. Endvidere observerede vi en yderligere gruppe i det modificerede protein, som viste en strækning bånd ved 1731 cm

-1. Dette strækker blev ikke observeret i den native form. Den modificerede histon udviste også et yderligere bånd ved 1066 cm

-1, som var til stede i den native form i denne region. Store bånd blev observeret i regionen med bølgetal mellem 3000 cm

-1 til 3500 cm

-1. Denne region var bredere for modificeret histon end for det native protein. Resultaterne er vist i figur 9.

Væskekromatografisk massespektrometri

Massespektre af standard CEL blev taget for at undersøge tilstedeværelsen af ​​CEL og dets kollision-induceret nedbrudte former i det native og modificerede histoner. blev observeret Basen peak og to produkt-ion masse spektre af standard CEL ved m /z værdier 219.0145, 84,1024 og 130,1032 (fig 10A). Ingen af ​​disse toppe som observeret i standard CEL blev fundet i tilfælde af nativt histon H1 (figur 10B); det modificerede histon H1 gav den mest fremtrædende ion produkt ved m /z på 84,1086. De mindre intense toppe blev observeret ved m /z af 130.1208 og 219.1432 (figur 10C).

Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning Electron Microscopy har været meget anvendt til at afsløre høj -Opløsning strukturelle detaljer af proteiner. Som observeret i SEM billeder, aggregatdannelse er klart på grund af ændring af histon H1 af MG (Fig 11A). Native histon fremgår helt forskellig fra sin ændrede form (Fig 11B).

CD resultater af DNA-protein interaktioner

Den cirkulære dikroiske analyse af samspillet mellem histon H1 og DNA viste markante variationer i spektrale egenskaber af nativt histon, sin ændrede form og den native DNA. Native DNA viste en positiv bånd ved 277 nm (θ = 8,542) og en negativ band ved 243nm (θ = 5,851). Samspillet mellem histon H1 med DNA bly at falde i positiv spids ved 276 (θ = 4,9123) og en stigning i den negative top ved 245 (θ = 5,092). Resultaterne af MG modificerede histon og DNA var forskellige fra DNA og H1-DNA som det gav mellemliggende top ved 277 (θ = 5,882) og en forøgelse af den negative top ved 243 (θ = 4,394) henholdsvis. Resultaterne er vist i figur 12.

Western blotting studier

25 ug af indfødte og MG-H1 optrådte som klare bånd på polyacrylamid gel efter sølvfarvning. Det modificerede protein viste bånd strækning, dannelsen af ​​højere molekylvægt enhed og en forøget lysstyrke i forhold til det native modstykke. I imunoblot analyse, antistoffer induceret mod MG-H1 udviste specifik binding til immunogenet med ringe erkendelse for epitoper på det umodificerede histon H1. Dette gentager vores Elsia resultater. Resultatet er givet i fig 13.

A1 og A2 representSDS PAGE af native og MG-H1 hhv. B1 og B2 er immunoblots skildrer binding af anti-MG-H1 antistoffer mod indfødte H1 og MG-H1 hhv.

Binding af serum autoantistoffer i kræftpatienter til indfødte H1 og MG modificerede histon H1

Betydeligt højere procentdel af serum-autoantistoffer fra alle typer cancer udviste forøget binding med methylglyoxal modificeret H1 sammenlignet med den native form i de direkte bindende ELISA-forsøg. Ud af de samlede 83 serumprøver, 54 prøver (65.06%) udviste væsentlig højere binding til MG-H1as mod dets native modstykke, hvilket viser bedre anerkendelse for det modificerede histon H1. Disse omfatter 19 prøver af lungekræft, 12 prøver af prostatakræft, 15 prøver af brystkræft og 8 prøver ofhead og halscancer. Resultaterne er vist i figur 14A-14D.

(A) Binding af serum-autoantistoffer i lungekræftpatienter (sera nr. 1-27) til nativt (□) og MG modificeret histon H1 (■). Normalt humant sera (NHS) tjente som negativ kontrol. Histogrammet viser gennemsnitlige absorbansværdier. (B) Binding af serum-autoantistoffer i prostatacancerpatienter (sera nr. 28-46) til nativt (□) og MG modificeret histon H1 (■). Normalt humant sera (NHS) tjente som negativ kontrol. Histogrammet viser gennemsnitlige absorbansværdier. (C) Binding af serum-autoantistoffer hos brystkræftpatienter (sera nr. 47-68) til nativt (□) og MG modificeret histon H1 (■). Normalt humant sera (NHS) tjente som negativ kontrol. De histogram viser betyde absorbansværdier. (D) Binding af serum autoantistoffer i hoved- og halscancer patient (sera nr. 69-83) til native (□) og MG modificeret histon H1 (■). Normalt humant sera (NHS) tjente som negativ kontrol. De histogram viser betyde absorbansværdier.

Binding af IgG fra kræftpatienter til indfødte H1 og MG modificeret histon H1

For yderligere at evaluere den fine specificitet af autoantistoffer i kræftpatienter, IgG isoleret fra serumprøver viser højere binding mod MG modificeret histon H1 og evalueres af hæmning ELISA. IgG blev blandet med varierende mængder af nativt og MG-H1 (0-20 ug /ml) og inkuberet i 2 timer ved 37 ° C og natten over ved 4 ° C. Den observerede antistof inhibering fornative H1 og MG-H1 histoner var i området fra 19,4% -36,2% og 49,2% -76,5% respectively.The gennemsnitlige procentvise hæmning af native H1 i bindingen af ​​autoantistoffer fra lunge-, prostata-, bryst- og hoved