PLoS ONE: Effekt af Single aminosyresubstitution Observeret i Cancer på Pim-1 kinase Termodynamisk Stabilitet og Structure

Abstrakt

Pim-1-kinase, en serin /threoninproteinkinase kodet af

pim

proto-onkogen, er involveret i flere signalveje såsom reguleringen af ​​cellecyklusprogression og apoptose. Mange cancertyper viser høje ekspressionsniveauer af Pim kinaser og særligt Pim-1 er blevet forbundet med initieringen og progressionen af ​​den maligne fænotype. I flere cancer væv er blevet identificeret somatiske Pim-1-mutanter. Disse naturlige varianter er ikke-synonyme single-polymorfismer, variationer af et enkelt nukleotid der forekommer i den kodende region og fører til aminosyresubstitutioner. I dette studie undersøgte vi effekten af ​​aminosyresubstitutioner på den strukturelle stabilitet og på aktiviteten af ​​Pim-1-kinase. Vi udtrykte og renset nogle af mutanter af Pim-1-kinase, som udtrykkes i kræft væv og rapporteret i den enkelt-nukleotid polymorfier database. De punktmutationer i varianterne påvirke konformationen af ​​den native tilstand af Pim-1 betydeligt. Alle mutanterne, udtrykt som opløselige rekombinante proteiner, viser en nedsat termisk og termodynamisk stabilitet og en nedre aktiveringsenergi værdier for kinaseaktivitet. Den nedsatte stabilitet ledsaget af en øget fleksibilitet antyder, at Pim-1-varianter kan være involveret i et større netværk proteininteraktioner. Alle mutanter bundet ATP og ATP mimetiske inhibitorer med sammenlignelige IC50-værdier antyder, at de undersøgte Pim-1 kinase mutanter kan effektivt målrettes med inhibitorer udviklet til vildtypeproteinet

Henvisning:. Lori C, Lantella A, Pasquo A , Alexander LT, Knapp S, Chiaraluce R, et al. (2013) Effekt af Single aminosyresubstitution Observeret i Cancer på Pim-1 kinase Termodynamisk Stabilitet og struktur. PLoS ONE 8 (6): e64824. doi: 10,1371 /journal.pone.0064824

Redaktør: Annalisa Pastore, National Institute for Medical Research, Medical Research Council, London, England

Modtaget: Januar 23, 2013; Accepteret: April 18, 2013; Udgivet: 5 juni 2013

Copyright: © 2013 Lori et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pim-1-kinase tilhører en familie af serin /threoninproteinkinaser (EC 2.7.11.1), der er kodet af

pim

proto-onkogener [1] – [3]. Pim-1-locuset er blevet oprindeligt identificeret som en fælles Proviral insertionssted i murine Moloney-leukæmivirus-induceret T-celle-lymfomer i mus [4]. Det kodede protein kinase er involveret i adskillige signalveje, såsom reguleringen af ​​cellecyklusprogression og apoptose. De tre Pim familiemedlemmer Pim-1, Pim-2 og Pim-3 er identificeret hos mennesker er blevet rapporteret som signalering proteinkinaser spiller en vigtig rolle i tumor biologi [5], [6]. Desuden er mange cancertyper viser høje ekspressionsniveauer af Pim kinaser. For eksempel Pim-1 og Pim-2 er blevet rapporteret at være stærkt udtrykt i leukæmi, lymfom, prostatakræft og myelomatose og anses for at være involveret i initiering og progression af den maligne fænotype [7]. Desuden har Pim-1 blevet identificeret som en vigtig cofaktor regulering af ekspressionen af ​​den onkogene transkriptionsfaktor c-Myc ved phosphorylering serin 10 i histon H3 i enhancer-regionen af ​​Myc locus og dets målgener [8].

Ekspression af Pim-1-kinase kan induceres ved en række forskellige vækstfaktorer. Pim-1 homøostase er vigtig for normal cellefunktion. Pim-1-aktivitet er derfor tæt reguleret på flere niveauer, herunder transkriptionelle, post-transkriptionel, translational og posttranslationel. Adskillige signaltransduktionsveje har været forbundet med reguleringen af ​​Pim-1-ekspression. For eksempel Pim-1-ekspression stimuleres ved aktivering af JAK /STAT pathway, som også regulerer dens nedbrydning via negativ feedback loop. Pim-1 overudtrykkes i mange hæmatologiske maligniteter og nyere undersøgelser på Pim familie kinaser tyder på, at spille vigtige roller også uden for det hæmatopoietiske system, som i cellerne i adskillige faste tumorer [6]. Især i flere cancer væv er blevet identificeret somatiske Pim-1-mutanter [9] – [12]. Mange af disse varianter er ikke-synonyme single-polymorfier (nsSNPs), single nucleotide variationer, der forekommer i den kodende region og fører til en polypeptidsekvens med aminosyresubstitutioner [13]. Vigtigere er det, efter vækstfaktorstimulering Pim-1 proteinniveauer er forbigående og proteinet har en kort halveringstid i celler, der hurtigt nedbrydes af ubiquitin-systemet.

En række undersøgelser har behandlet virkningen af ​​nsSNPs på protein stabilitet, protein-protein interaktioner og proteinfunktioner [14]. På samme tid har naturlige varianter blevet katalogiseret med det formål at skelne mellem naturligt forekommende genetiske forskelle, formentlig uden funktionelle konsekvenser (personbiler mutationer) som dem samlet i SNP database, og sådanne associeret med udviklingen af ​​sygdomme (driver mutationer) [15], som OMIM databasen [16], den human Gene Mutation database [17], særlig dem, der findes at være forbundet med cancer (COSMIC) [11].

Computational analyse af identificerede mutanter har forudsagt at ca. 30% af proteinvarianter følge af nsSNPs er mindre stabile end vildtype varianten [18] er imidlertid en eksperimentel vurdering af stabiliteten af ​​almindelige varianter stadig behov for at bestemme virkningen af ​​mutationer på proteinstruktur og funktion [19].

i denne undersøgelse udvalgte vi nsSNPs resulterer i Pim-1-varianter, der er udtrykt i cancer væv og rapporteret i SNP database [9], [11], [20]. Disse Pim-1-varianter er blevet omfattende karakteriseret for at undersøge effekten af ​​enkelt aminosyresubstitution på Pim-1 termisk og termodynamisk stabilitet og struktur i opløsning. Vores undersøgelse viste, at alle mutanter studerede føre til betydelig destabilisering af Pim-1-kinase.

Resultater

Spektroskopiske Karakterisering af Pim-1 Wild Type og mutanter Fundet i Cancer

I denne undersøgelse udvalgte vi fire mutationer (Y53H, E124Q, E135K og E142D), som alle er blevet detekteret i kræft for en detaljeret stabilitet protein og strukturel analyse ved hjælp spektroskopiske teknikker (fig. 1). Mutanterne er placeret i det katalytiske domæne af Pim-1-kinase (fig. 1A). Y53 ligger i den N-terminale kinase lap i den centrale β-sheet vugge og dens amidnitrogenet danner en hydrogenbinding med i66 carbonylgruppe på beta-streng 3 (fig. 1B). Remanensen E124 er beliggende i kinase hængselsregionen og danner en saltbro med R122 (fig. 1C). Hængslet region er et centralt element regulerer den C-terminale lap bevægelse, som kan blive påvirket af E124Q mutation. E135 ligger i helix aD danner en hydrogenbinding med Q127, som sandsynligvis vil være vigtig for stabiliseringen denne helix (Fig. 1C). Endelig E142 er en overflade eksponeret rest og den konservative substitution med og aspartat er ikke forventes at have en betydelig effekt på protein stabilitet, dynamik og struktur

(A) Struktur af Pim-1 (PDB-kode:. 1XWS ) vist som et bånd diagram. Muterede rester er fremhævet, og de vigtigste sekundære strukturelementer er vist. ATP mimetisk inhibitor cokrystalliserede i denne struktur er vist i pasning og Stavafbildning. (B) Detaljeret visning af den lokale strukturelle miljø omkring den muterede rest Y53. (C) Detaljeret visning af den lokale strukturelle miljø omkring den muterede rest E135. (D) Near-UV CD-spektre blev registreret i en 1,0-cm kvarts kuvette ved 1,4 mg /koncentration ml protein i 20 mM Tris /HCl, pH 7,5 indeholdende 0,2 M NaCl og 2 mM DTT. (E) iboende fluorescens emission spektre blev registreret ved 0,04 mg /ml proteinkoncentration (295 nm excitationsbølgelængde) ved 10 ° C i 20 mM Tris /HCl, pH 7,5 indeholdende 0,2 M NaCl og 200 pM DTT. (F) Far-UV CD-spektre blev registreret i en 0,1-cm kvarts kuvette ved 0,2 mg /ml i 20 mM Tris /HCl, pH 7,5 indeholdende 0,2 M NaCl og 0,4 mM DTT.

nær-UV CD spektrum af vildtype Pim-1 viser den spektrale bidrag fra alle aromatiske rester og er kendetegnet ved to stærke negative toppe centreret ved 290 nm og ved 269 nm ledsaget af fin struktur faciliteter, 275-280 nm (fig. 1D) . Den E124Q mutanten viser en nær-UV CD spektrum nøje svarer til den for vildtype bortset fra en beskeden nedgang i den fine struktur ved 275-280 nm. E142D viser en nær-UV CD spektrum som overraskende adskiller sig fra vildtype spektrum i 275-280 nm. CD spektrum nær-UV af Y53H er dramatisk forskellig fra vildtype spektrum og de andre mutanter: den fine struktur på 275-280 nm er tabt, bidraget ved 290 nm er faldet betydeligt, og den negative ellipticitet på omkring 269 nm er markant ændret. E135K nær-UV CD spektrum ligner Y53H med en markant nedsat dichroic aktivitet i 290-275 nm og med et positivt bidrag i området under 275 nm. Den fluorescensemissionsspektrer af vildtype og mutanter er alle centreret på samme maksimale emission bølgelængde omkring 345 nm og vise forskelle i emission fluorescensintensiteter (Fig. 1E). Fjern-UV CD spektre for alle mutanterne er næsten overlejres med den for Pim-1 vildtype og typiske for en alfa og beta-protein, der viser et lokalt minimum ved omkring 208 nm, en 200 nm gennem nulpunktet og et 1,52 forhold mellem 208 /222 bands (fig. 1F).

temperaturafhængighed kinase aktivitet

temperaturafhængighed kinase aktivitet af Pim-1 vildtype og dens mutanter blev undersøgt over temperaturområdet 10- 42 ° C (fig. 2A). De optimale temperaturer til katalyse, ved konstant ATP-koncentration, blev anslået til at være på 37 ° C i vildtype og E142D, ved omkring 35 ° C i E124Q og Y53H, og på omkring 30 ° C i E135K (tabel 1 og fig. 2A). Især er kinaseaktiviteten ved 37 ° C på alle Pim-1-mutanter væsentligt reduceret og svarer til 57, 37, 16 og 3% af den for vildtypeproteinet for E142D, E124Q, Y53H og E135K hhv. Aktiveringsenergien,

E

en

‡, bestemt ved Arrhenius ligning (1) i temperaturområdet mellem 10 ° C og den optimale temperatur af hvert protein er lavere end den for vildtype type (tabel 1 og fig. 2B). Dette resultat antyder en øget fleksibilitet i alle varianter i forhold til vildtype, særlig tydeligt for E135K. Sammenligningen af ​​temperaturafhængighed kinaseaktivitet med den strukturelle termiske udfoldningskurve overvåget ved 209 nm (fig. 3A) viser klart, at alle varianter er betydeligt mindre termisk resistente og mere fleksibel end vildtypen.

(A) temperaturafhængigheden af ​​kinaseaktiviteten af ​​Pim-1 vildtype og mutanter. (B) ikke-lineær tilpasning af temperaturafhængighed kinaseaktivitet til Arrhenius-ligningen (Eqn. 1); det indsatte viser den lineære Arrhenius plot for de samme data. Assays blev udført under betingelserne beskrevet i Materialer og metoder under anvendelse af 2,7 uM enzym.

(A) Pim-1 vildtype og mutanter blev opvarmet fra 10 ° C til 72 ° C i en 0,1- cm kvarts kuvette ved 0,2 mg /ml i 20 mM Tris /HCl, pH 7,5 indeholdende 0,2 M NaCl og 0,4 mM DTT. Den dikroiske aktivitet ved 209 nm blev overvåget kontinuerligt hver 0,5 ° C. (B) første afledte af de samme data som i (A). (C) PMTV data registreret i de samme forsøg er vist i (A).

Termisk Unfolding

Den termiske stabilitet Y53H, E124Q, E135K og E142D blev undersøgt ved kontinuerlig overvågning ellipticiteten ændringer på 209 nm i temperaturområdet mellem 10 og 72 ° C. Data for mutanter blev sammenlignet med den for vildtypeproteinet (fig. 3A). Den valgte at sammenligne overgangskurver med Pim-1 vildtype og mutanter parameter er smeltetemperaturen (T

m) defineret som midtpunktet af denatureringsprocessen som beregnet ved at afbilde den første afledede af de molære ellipticitet værdier som en funktion af temperaturen (fig. 3B). Temperaturen-induceret ellipseform ændringer på 209 nm, hvor der blev observeret den vigtigste amplitude, forekommer i en tilsyneladende kooperativ overgang for E124Q og E142D, med T

m værdier på 40,0 for E124Q og 44,0 ° C i E142D. For E135K overgangen forekommer mindre kooperativ med en T

Km-værdi på 45,0 ° C og ingen påviselig akkumulering af udfoldning mellemprodukt (er), hvilket antyder, at udskiftningen af ​​E135 med en lysinrest kan inducere en delvis lokal udfoldning og /eller at denne variant kan eksistere som en heterogen population af foldede tilstande. For vildtype og Y53H, de tilsyneladende tre-state termiske overgange tyder ophobning af udfoldelsen mellemprodukter med to T

m værdier. Den første overgang sker med T

m-værdier (T

m1) ved 40,5 og 40,0 ° C, den anden (T

m2) på 54,0, 52,0 ° C for vildtype og Y53H henholdsvis (tabel 2 ). Temperatur–induceret ellipseform ændringer for vildtype og mutanter er alle sammenfaldende med varmeinduceret forøgelse af fotomultiplikatorrøret spænding (PMTV) over 370 V (fig. 3C), hvilket tyder på, at temperaturen-inducerede udfoldning ledsages af proteinaggregering [ ,,,0],21]. Aggregering forekom også når termiske scanninger blev udført ved en lavere opvarmning sats med en forskydning af den tilsyneladende T

m til lavere temperaturer; forskellene mellem den tilsyneladende T

m af vildtype og varianter var de samme som dem, der måles ved højere opvarmningshastighed (data ikke vist). De observerede overgange er irreversible, som angivet ved spektre målt ved afslutningen af ​​køle fasen, der er forskellige fra dem af de native proteiner måles ved begyndelsen af ​​de termiske overgange. Endvidere inspektion af kuvetten ved slutningen af ​​køle fasen afslørede tilstedeværelsen af ​​en stor mængde bundfald i alle prøverne.

Virkninger af pim-1 mutationer på ATP og inhibitorbindende

Mutationer identificeret i kræft er en hyppig årsag til resistens. Vi var derfor interesseret, hvis inhibitor binding ville blive påvirket af de undersøgte mutationer. For at løse dette screenede vi adskillige kendte Pim-1 inhibitorer af beta-carbolin og imidazopyridazole klasse [22], [23] af temperatur ændring-assays [24]. Screening mod en række inhibitorkoncentrationer derivater afslørede ingen signifikante forskelle i temperatur skiftværdier antyder, at alle mutanter binder disse inhibitorer med tilsvarende bindingskonstant (tabel S1 og tabel S2). For at bekræfte dette målte vi enzymkinetiske data på en delmængde af inhibitorer. IC50-værdier af Pim-1 hæmmere K00487, K018444a og K00207a var 0,048, 0,010 og 0,007 mM, henholdsvis for Pim-1 vildtype. Disse værdier var tæt ens for de Pim-1-varianter med undtagelse af de IC50-værdierne for K00487 og K00207a der var 1.8- og 1.4 gange øget for Y53H. Vi konkluderede derfor, at specifik hæmmer binding er ikke væsentligt påvirket af de undersøgte mutationer.

Urea-induceret Equilibrium Unfolding Overgange

Pim-1 vildtype og varianter reversibelt udfolde sig i urea ved 10 ° C i 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, indeholdende 200 pM dithiothreitol (DTT) og 0,2 M NaCl. Virkningen af ​​stigende urinstof koncentrationer (0-8 M) af strukturen af ​​Pim-1-mutanter blev analyseret ved fjern-UV CD og fluorescens spektroskopi og sammenlignet med virkningen udøves på vildtypen. Den iboende fluorescens emissionsintensiteten ved 345 nm af Pim-1 vildtype og varianter ændringer efter 30 minutters inkubation ved 10 ° C, et tilstrækkeligt tidsrum til at nå ligevægt (fig. 4). Plottet af de relative ændringer fluorescensintensitet versus stigende denatureringskoncentration viser komplekse profiler for vildtype og alle mutanter (fig. 4), hvilket tyder på en ikke to-stats udfoldning proces og populationen af ​​denaturering mellemprodukt (er). Kompleksiteten af ​​de udfolder profiler kan tilskrives den multi-domænet arkitektur Pim-1 indeholder tryptophan rester i både N-terminale og C-terminale lapper af proteinet. Ved afslutningen af ​​overgangen, over 7 M urinstof, er den iboende fluorescensemission intensitet ved 345 nm faldt ca. 1,3 fold (fig. 4) og maksimal fluorescens emissionsbølgelængde skifter til omkring 357 nm hverken for vildtype og alle varianter (data ikke vist). De samme prøver anvendt til at overvåge ændringer fluorescensemissionen (fig. 4) under udfoldningsovergangen blev anvendt til at overvåge fjern-UV cirkulære dikroisme ellipseform (fig. 5) for at tillade en direkte sammenligning med fluorescensdata. De urinstof-inducerede ændringer i 222 nm ellipseform af alle mutanterne er magen til den for vildtype, viser en S-formet afhængighed ureakoncentration og følge en tilsyneladende to-tilstandsovergang uden nogen påviselig mellemprodukt (fig. 5). Udfoldningsprocessen er fuldt reversibel ved fortynding af denatureringsmidlet enten vildtype eller samtlige mutanter (fig. 5) med overgangsmetaller midtpunkter mellem 4,23 og 5,34 M urinstof (tabel 2). Tabel 2 viser de termodynamiske parametre værdier opnået for vildtype og mutant former af Pim-1 fra CD overgangen data langt-UV. Pim-1 vildtype er betydeligt mere stabil end alle de varianter, som indikeret ved sammenligning af Δ

G

værdier, der i tilfælde af E135K er ca. 3,5 gange lavere end den for vildtype (tabel 2) . Faldet i Δ

G

kan primært henvist til de lavere

m

værdier observeret for alle varianter med hensyn til vildtype. Disse resultater indikerer, at ændringen i opløsningsmidlet eksponerede overfladeareal ved udfoldning er mindre for alle Pim-1-varianter end for vildtype-proteinet. Især de

m

værdier bestemt for Pim-1 vildtype og dens varianter (tabel 2) er fem gange lavere end forudsagt for en monomer protein af 272 aminosyrerester udfoldet i urea [25]. De lave værdier af

m

kan være relateret til flere tilstande ligevægt udfoldning, på linje med de opnåede resultater overvågning udfoldningsprocessen ved iboende fluorescens emissionsintensitet (Fig. 4).

normaliseret i forhold fluorescensintensiteter ved 345 nm; de kontinuerlige linjer repræsenterer ikke-lineær regression fit af de relative fluorescensintensiteter ved 345 nm til Eqn. 5 beregnet som beskrevet i Materialer og Metoder. Reversibiliteten punkter er vist som tomme cirkler, og blev ikke inkluderet i den ikke-lineære regressionsanalyse. Alle spektre blev optaget ved 10 ° C som beskrevet i Materialer og Metoder. (A-C) den del af den native (

f

N), første mellemprodukt (

f

I1), andet mellemprodukt (

f

I2) og udfoldet (

f

U) stater, beregnet som beskrevet i Materialer og metoder ved hjælp af de termodynamiske parametre opnået fra anfald af ligevægten udfolder overgange til Eqn. 5, er vist for den vilde type (A), E124Q (grøn) (B) og E135K (lyserød) (C).

Molar ellipticitet ved 222 nm ([Θ]

222 ) rapporteret efter fjernelse af højfrekvent støj og den lavfrekvente tilfældige fejl ved SVD. Kontinuerlig linjer er den ikke-lineær regression til Eqn. 3 af de data på varierende denaturerende koncentrationer, som beskrevet i Materialer og Metoder. Reversibiliteten punkter (tomme symboler) er vist for klarhedens skyld kun for vildtype og blev ikke inkluderet i den ikke-lineære regressionsanalyse. Alle spektre blev optaget ved 10 ° C som beskrevet i Materialer og Metoder.

urinstof-inducerede udfoldning overgange overvåges af relative ændringer fluorescensintensitet (fig. 4) blev analyseret ved anvendelse af en fire-tilstandsovergang model til ligning 5 som rapporteret i Materialer og Metoder. De termodynamiske parametre i forhold til udfoldningsprocessen er angivet i tabel 3. Dataene viser, at den første overgang fra den native tilstand (N) til det første mellemprodukt (I

1) opstår Pim-1 vildtype og alle mutanterne under 1 M urea med et større Δ

G

værdi for E124Q og en lavere Δ

G

værdi for E135K. Den anden overgang fra I

1 til det andet mellemprodukt (I

2) forekommer i en meget lignende urinstof koncentrationsområde for alle Pim-1 mutanter undersøgt og Δ

G

værdier for E142D og Y53H foreslå en stabilisering af mellemproduktet for disse to varianter (tabel 3). Den Δ

G Drømmeholdet værdi i forhold til den sidste overgang til den denaturerede tilstand (U) er betydeligt større for vildtype i forhold til varianterne. I overensstemmelse med de opnåede resultater fra fjern-UV CD sigmoidale overgange (tabel 2), summen af ​​Δ

G

værdier for de tre overgange er større for vildtype, sammenlignet med de andre mutanter, med undtagelse af E142D hvis Δ

G

tot svarer til den for vildtype. Navnlig Δ

G

tot af E135K er betydeligt lavere end for alle de andre varianter. Forskellen mellem de termodynamiske parametre opnået langt-UV CD og fluorescensintensitet støtter kraftigt tilstedeværelsen af ​​udfolder mellemprodukter. Manglen på en detekterbar mellemprodukt ved fjern-UV CD kan indikere, at de mellemliggende tilstande påvises ved fluorescens repræsenterer konformationelle ændringer, der sker i nærheden af ​​hver af de tryptophanrester, med alternative tertiære ordninger. Det er velkendt, at fluorescensintensitet er yderst følsom over for omgivelserne af en fluorofor og betragtes som en af ​​de mest direkte signaler, der kan bruges til at overvåge termodynamik udfolde overgange [26]. For at evaluere den fraktionerede akkumulering af de forskellige arter upon urea-induceret udfoldning, ligevægt fordeling af de fire arter, N, I

1, I

2 og U som funktion af denatureringsmiddel fusion kan rekonstitueres ved hjælp af udstyret værdier af Δ

G

1, Δ

G

2, Δ

G

3,

m

1,

m

2 og

m

3 i tabel 3. ligevægt fordeling af N, i

1, i

2 og U er ens for vildtype (fig. 4A) og alle varianter kan imidlertid visse forskelle observeres (fig. 4B-C). Fraktionen af ​​N (

f

N) forøges for E124Q (fig. 4B) og signifikant mindre for E135K (fig. 4C), og svarer til den for vild-type (Fig. 4A ) for alle de andre Pim-1-varianter (data ikke vist). Fraktionen af ​​I

1 (

f

I1), der akkumuleres på 1,0 M urea for alle arter, er lidt større for E135K og mindre for E124Q. Den fraktionelle fordeling af den anden denaturering mellemprodukt I

2 (

f

I2), som akkumulerer ved ca. 4,0 M urinstof, forekommer let øget for Y53H, E124Q og E135K, sammenlignet med vildtype (data ikke vist). Især for den vilde type og alle varianter de udfolder mellemprodukter I

1 viser den samme maksimale emission bølgelængde N centreret på omkring 345 nm, mens den for I

2 er flyttet til omkring 348 nm. Den detaljerede analyse af Pim-1 udfolder overgange tyder på, at betydelige forskelle i domænet plasticitet og udfoldning forekomme i Pim-1 mutanter sammenlignet med vildtype protein.

Diskussion

Denne undersøgelse repræsenterer, så vidt vi ved, den første spektroskopiske og termodynamisk karakterisering af human kinase Pim-1 og nogle af dens sygdomstilstande relevante mutanter fundet i cancer. Vi undersøgte virkningen af ​​aminosyresubstitutioner på den termiske og termodynamiske stabilitet af vildtype Pim-1 og sammenlignet disse resultater med fire Pim-1-varianter, Y53H, E124Q, E135K og E142D, rapporteret i SNP’er database [9] – [12] , [15], [20]. Undersøgelse af Pim-1 krystalstruktur viste, at de fleste mutationer er placeret tæt på strukturelle elementer er vigtige for kinase funktion, og at formen polære interaktioner med tilstødende rester.

punktmutationer i varianterne signifikant påvirker konformationen af ​​den native tilstand af Pim-1. Forskellene i nær-UV CD mellem mutanter og vildtype tyder på, at de tertiære kontakter er væsentligt ændret for alle mutanterne, og at den enkelte aminosyre substitution påvirker Pim-1 tertiær struktur og føre til gennemgribende ændringer i den overordnede protein tertiære fold. Især substitution af Y53 med histidin fører til dramatiske tertiære struktur ændringer, som åbenbaret fra tabet af den fine struktur på 260-280 nm (fig. 1D). Den N-terminale lap mutant Y53H viser de væsentligste ændringer i tertiære kontakter, som bedømt på grundlag af nær-UV CD spektrum. Især synes mere svarer til den for vildtype nær-UV CD spektret for E124Q mutanten, sandsynligvis fordi ændringen af ​​en ladet polær Glu-rest i den uladede polære Gin-rest har kun en mindre virkning på den tertiære struktur og dens stabilitet .

Tyr53 rest er placeret i midten af ​​beta-streng 2 og dens amidnitrogenet er hydrogenbundet til i66 carbonyl på beta-streng 3. i Y53H, udskiftningen af ​​Y53 med et polært histidin kan føre til en ny hydrogenbinding med H68 (fig. 1). Desuden, nærhed af Y53 til phosphatbindende P-loop, en region, som spiller en vigtig rolle i specificitet og affinitet af inhibitorer [27], tyder på, at mutation af denne rest kan påvirke inhibitor binding.

den anden mutation fundet i cancer, E124Q, vedrører en rest placeret i hængselsregionen (121-126). Den OE2 af E124 danner et salt bro med H11 i nabolandet R122 (fig. 1). Substitutionen af ​​E124 for glutamin (E124Q) ødelægger saltbro i hængselsregionen, som kan bestemme mobiliteten af ​​den N-terminale (33-121) og C-terminal (128-305) lapper. Især eftersom lapperne ofte rotere eller lukke omkring hængslet på inhibitorer binder mutationen af ​​E124 i væsentlig grad ændrer de dynamiske egenskaber af Pim-1 og kan ændre inhibitorer affinitet. Interessant, dette glutamat-arginin salt broen er ikke til stede i Pim-2 isoform muligvis bidrage til lavere stabilitet af dette protein [28].

reversibilitet urinstof inducerede ligevægt udfolder ved lav temperatur giver en kvantitativ bestemmelse af effekten af ​​mutationer på termodynamik Pim-1 udfoldning. Alle mutanterne, udtrykt som opløselige rekombinante proteiner, viser en nedsat termisk og termodynamisk stabilitet (tabel 2 og 3). Den destabiliserende effekt af alle aminosyresubstitutionerne er særligt tydeligt fra faldet i smeltetemperatur overvåget ved sekundær struktur ændringer, der tyder på en højere fleksibilitet af varianterne med hensyn til vildtype. Faldet i smeltetemperatur alle Pim-1-varianter studeret der parallelt med et signifikant fald i Δ

G

H

2

O i forhold til urinstof-inducerede udfoldning i forhold til vildtypen. Disse resultater er overraskende, eftersom alle mutanterne er mindre stabile end vildtype og Pim-1 er et proto-onkogen, således kan man konkludere, at Pim-1-varianter er mindre effektive som onkogener end vildtypen. Imidlertid er den nedsatte stabilitet ledsaget af en øget fleksibilitet, som angivet ved de lavere aktiveringsenergi værdier for kinaseaktivitet observeret i alle de varianter i forhold til den for vildtype, hvilket antyder, at Pim-1-varianter kan være involveret i et bredere netværk af protein-interaktioner

Især overgangen midtpunkter for de spektrale ændringer for alle mutanter er ikke ændret væsentligt i forhold til vildtype.; dermed, faldt Δ

G

H

2

O værdier skyldes primært et fald i

m

værdier. Således virkningen af ​​aminosyresubstitution på Pim-1 stabilitet kan primært henvist til et fald i ændringen af ​​opløsningsmidlet eksponerede overfladeareal ved udfoldning for alle Pim-1-varianter.

Som konklusion vores resultater viser, at virkningen af ​​mutationen observeret i cancervæv er rettet mod lokale ændringer i tertiær struktur, som imidlertid ikke påvirker binding til type i-kinaseinhibitorer undersøgt.

Materialer og metoder Salg

stedorienteret mutagenese

Pim-1 vildtypeenzymet plasmid blev opnået ved SGC (Oxford). Quick Change mutagenese kit (Stratagene) blev anvendt til at indføre de enkelte mutationer på vildtype Pim1 plasmid anvendt som skabelon. De mutagene oligonukleotider anvendt, er anført i tabel 4.

Protein Expression and Purification

Rekombinant Pim-1-protein er blevet udtrykt og oprenset som beskrevet i [29] med mindre modifikationer. Pim-1

vildtype og mutanter blev udtrykt i

E. coli

stammen BL21 (DE3). 10 ml overnatskultur blev dyrket ved 37 ° C i 1 l LB medium indeholdende ampicillin antibiotisk i en slutkoncentration på 50 ug /ml, indtil den optiske densitet OD nåede

600 0.6. Kulturen blev afkølet på is i 20 minutter, hvorefter proteinet blev induceret natten over ved tilsætning af 0,5 mM isopropyl-β-D-thiogalactosid (Sigma-Aldrich) og dyrket natten over ved 15 ° C med energic omrystning. Kulturen blev høstet ved centrifugering og resuspenderet i 50 ml bindingspuffer (50 mM Hepes, 500 mM NaCl, 5 mM imidazol, 5% glycerol, pH 7,5) indeholdende 0,5 mM

tris

(2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. Cellerne blev optøet på is suppleret med proteasehæmmere (Complete, Roche) og sprængt ved sonikering. Lysatet blev klaret ved centrifugering og supernatanten blev fyldt på en DE52-søjle (GE Healthcare), forinden ækvilibreret med bindingsbuffer og 0,5 mM TCEP, for at fjerne nukleinsyrer. Gennemløbet blev fyldt på en Ni-NTA (Ni

2 + – nitriltriacetate) affinitetssøjle (GE Healthcare) præækvilibreret med bindingsbuffer. Søjlen blev vasket med bindingsbuffer til eluering svagt bundne forureninger. Det rekombinante protein blev elueret ved at passere over kolonnen bindende bufferopløsninger indeholdende stigende imidazol koncentrationer (50 mM, 100 mM, 150 mM og 250 mM). De opsamlede eluater blev suppleret med en endelig koncentration på 10 mM DTT og testet for renhed på SDS-gel under anvendelse precasted gel-system (Invitrogen). De rene fraktioner blev inkuberet natten over med tobak etch virus protease (Pro-TEV), til fjernelse af hexahistidin tag. Efter fordøjelse blev proteinet koncentreret til 2 ml ved anvendelse af Millipore koncentratorer og sat på en Superdex 200 300/10 gelfiltreringssøjle på AKTA FPLC-system i forvejen var ækvilibreret med 50 mM Tris /HCl, 0,25 M NaCl, 10 mM DTT, pH 7,5 ved en strømningshastighed på 1,0 ml /min. 2 ml fraktioner blev opsamlet, og det rene protein blev identificeret ved SDS PAGE. Proteinkoncentrationen blev bestemt spektrofotometrisk ved hjælp af en molær absorptionsevne på 48930 M

-.

1 cm

-1at 280 nm baseret på en molekylmasse på 35,685 kDa

Spektroskopiske