PLoS ONE: Non-Invasiv Påvisning af et lille antal Bioluminescent kræftceller i Vivo

Abstrakte

Tidlig påvisning af tumorer kan forbedre resultatet af tumor behandling betydeligt. En af de oftest stillede spørgsmål i kræft imaging er, hvordan kan påvises mange celler ikke-invasivt i et levende dyr. Selv om mange faktorer begrænser en sådan påvisning, øger lysudsendelse fra celler, er en af ​​de mest effektive måder at overvinde disse begrænsninger. Her beskriver vi udvikling og udnyttelse af en lentiviral vektor, der indeholder udvidet ildflueluciferase (

luc2

) gen. De resulterende enkelt celle kloner af muse mælkekirtel tumor (4T1-luc2) viste stabil lysemission i området fra 10.000 fotoner /s /celle. I nogle tilfælde individuelle 4T1-luc2 celler indsættes under huden på en

nu /nu

mus kunne påvises ikke-invasivt ved anvendelse af et afkølet CCD-kamera i nogle tilfælde. Endvidere viste vi, at der kun er behov få celler til at udvikle tumorer i disse mus og tumorprogression kan overvåges lige efter at cellerne er implanteret. Markant højere luciferaseaktivitet i disse celler tilladt os at opdage mikrometastaser i både, syngene Balb /c og

nu /nu

mus

Henvisning:. Kim JB, Urban K, Cochran E, Lee S , Ang A, Rice B, et al. (2010) Ikke-invasiv påvisning af et lille antal Bioluminescent Cancer Cells

In Vivo

. PLoS ONE 5 (2): e9364. doi: 10,1371 /journal.pone.0009364

Redaktør: Alexander Swarbrick, Garvan Institute of Medical Research, Australien

Modtaget: 12. maj 2009; Accepteret: 2 januar 2010; Publiceret: 23 feb 2010

Copyright: © 2010 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret internt på Caliper Life Sciences og Momenta Pharmaceuticals. De finansieringskilder forudsat reagenser, forskning plads og ressourcer til denne undersøgelse. Men forfatterne udelukkende involveret i studiedesign, dataindsamling og analyser, eller forberedelse af manuskriptet. Caliper Life Sciences og Momenta Biopharma enige om at offentliggøre disse data i et videnskabeligt tidsskrift. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Jae-Beom Kim, Konnie Urban, Steve Lee, Bradley Rice, Adam Bata, kenneth Campbell, Richard Kaffe, Alex Gorodinsky, Zhan Lu og Peter Lassota er medarbejdere i Caliper Life Sciences. Han Zhou, Edward Cochran og Takashi Kei Kishimoto er medarbejdere i Momenta Pharmaceuticals Inc. Forfatterne er enige om at PLoS ONE Politik om datadeling politikker. Der er ingen patentansøgning indleveret ved hjælp af data fra dette studie.

Introduktion

Påvisning af tumorer på tidlige stadier er afgørende for effektiv tumor behandling og til at studere tumorigenese [1], [2] , [3]. Traditionelt blev tumorvækst vurderet ved anvendelse af mekaniske eller elektroniske calipre fysisk skal tage målinger af subkutane humane tumorer vokser i immunkompromitterede mus [4]. Denne metode egner sig imidlertid kun til tydelige tumorer vokser under huden af ​​dyrene. Dybere tumormasser, såsom osteosarkomer indkapslet af knoglen, kan ikke gøres til genstand for direkte fysiske målinger. Selv i subkutane modeller, tumorbyrder muligvis ikke nøjagtigt kvantificeres ved hjælp af fysiske målinger, fordi ødemer og nekrotiske centre vil bidrage til stigningen i tumorstørrelse [5]. Ortotopisk solide tumorer modeller omgå disse forhindringer og give temmelig præcis vurdering af tumor byrder ved at veje fjernet, “renset” tumorer efter aflives dyrene. Klassiske ortotopisk modeller er upraktiske til evaluering af forbindelsernes virkningsfuldhed da de kræver et stort antal dyr, der skal aflives ved hvert tidspunkt. Ligeledes identifikation af tumorer og kvantificering af tumor byrde i modeller for metastaser efterspørgsel udtømmende, og kedelige histologiske analyser [6], [7], [8].

Ikke-invasiv hele kroppen bioluminescens imaging (BLI) tillader gentagne realtid

in vivo

overvågning af tumorvækst i forsøgsdyr, uanset tumor steder. I modsætning til fluorescens, BLI udviser minimale baggrundssignaler fra animalske væv [9]. Derfor kan BLI påvise relativt svage signaler med højt signal til baggrund-forhold. På grund af sin alsidighed, har BLI blevet vedtaget at studere prækliniske effekt af lægemiddelkandidater [10], [11], [12], [13] samt forskellige aspekter af pattedyr biologi via reporter analyser [14], [15].

for nylig ildflue (

Photinus pyralis

) luciferase blev re-manipuleret til yderligere at optimere dets ekspression i pattedyrceller. I forhold til tidligere generationer af luciferase, den nye version (

luc2

) leverer mere end en fire-dobling i lyset emission, som blev opnået ved codon optimering og fjernelse af potentielle transcriptionsfaktor bindingssites [16]. Vi postulerede at kunne påvises enkelte kræftceller

in vivo

ved at udnytte den øgede bioluminescens af

luc2

. Til det formål har vi udviklet en lentivirusvektor hvor

luc2

udtryk drives via den menneskelige ubiquitin C-promotor [17]. Konstruktionen blev derefter stabilt transficeret ind i 4T1 muse-brysttumor-cellelinje [18], [19]. Adskillige stabile, single-cellekloner (4T1-luc2) blev efterfølgende isoleret med lysemission i området fra 10.000 fotoner /s /celle. Her rapporterer vi at i det mindste i nogle tilfælde blev påvisning af en enkelt cancercelle

in vivo

hjælp af en af ​​disse Luc-2 mærkede kloner opnået. Vi viser også udvikling af tumorer fra kun få celler implanteret i

nu /nu Salg mus og påvisning af metastaser i syngene Balb /c mus. Til vores bedste viden, dette er den første rapport af påvisning af en enkelt selvlysende celle

in vivo

bruger en ikke-invasiv billeddannelse metode. Sådanne lyse celler kan effektivt anvendes til at overvåge effektiviteten af ​​lægemiddelkandidater i modeller af metastase og ortotopisk tumormodeller, at spore metastatisk migration af cancerceller, og kan også anvendes til nøjagtigt at fastslå, om enhver resterende sygdom er fortsat efter behandlingen.

Resultater

Generering af en lentiviral Vector System og Stabile 4T1-luc2 cellelinier

en lentiviral vektor, der indeholder ildflue

luc2

gen konjugeret til et menneske ubiquitin C-promotor blev bygget til at generere stabile selvlysende kræft cellelinjer [16], [17], [18]. Musebrysttumor 4T1 celler blev derefter transficeret med den lentivirale vektor og stabile kloner blev selekteret under anvendelse af puromycin (4T1-luc2). Otte kloner blev valgt til yderligere analyser og deres luciferaseaktiviteter blev overvåget i fire uger uden selektionsmarkør. Selv om der var forskelle blandt klonerne, de fleste af dem kloner udsendte mere end 3.000 fotoner /s /celle af lys. I betragtning af at de fleste cellelinjer mærket med tidligere generationer af luciferase udleder mindre end 250 fotoner /s /celle, vores luc2 kloner udviste betydeligt højere lysemission [20]. Overraskende, én klon (C26) indledningsvis udsendes så meget som 52.000 fotoner /s /celle, men dens lysemission er faldet til 6.400 fotoner /s /celle efter fire uger (figur S1a). For at bekræfte, at ingen ændringer i cellulær fysiologi opstod under mærkningen /kloning proces, vi sammenlignede kloner til de oprindelige forældre 4T1 celler på flere forskellige niveauer. Først undersøgte vi vækstmønstre. Fra de otte oprindeligt udvalgte kloner, valgte vi to linjer (C27 og C38) og sammenlignet deres vækstmønstre til forældrenes 4T1 celler. Begge linjer havde lignende fordoblingstider til forældrenes celler (12,6 timer fordoblingstid for begge kloner, versus 12,0 timer for de oprindelige 4T1 celler).

Vi undersøgte også andre kritiske parametre for cellulær fysiologi, herunder effekter af ATP-forbrug . Da luciferase benytter et molekyle ATP udarbejde hvert lysfoton kunne høje niveauer af lysemission være til skade for cellens metabolisme på grund af nedbrydningen af ​​dets ATP pool. For at teste, om den høje lysproduktion påvirker celle fysiologi, observerede vi cellevækst i fire dage i nærvær af høje koncentrationer af luciferase-substrat, D-luciferin (150 og 300 pg /ml /dag). Resultaterne viste, at i nærvær af D-luciferin, viste 4T1-luc2 kloner lignende vækstmønstre til dem i celler dyrket uden D-luciferin og til de parentale 4T1 celler (fig S1B, C, D). Dette antyder, at 4T1-luc2 celler kan udholde forbruget af ATP kræves for den høje lysemission uden en signifikant effekt på cellens ATP pool.

Da klon C26 viste faldende luciferaseaktivitet over tid, vi forsøgte anden runde af begrænset fortynding enkelt celle kloning fra den oprindelige blandede population. Fire lyse kloner blev udvalgt og deres luciferaseaktiviteter (lys emission) blev overvåget i seks uger uden selektionspres (figur 1A, B). Alle kloner oprindeligt produceret mere end 40.000 fotoner /sek /celle; derefter lysemissionen faldt til 10.000 fotoner /s /celle, og stabiliseret ved dette niveau. Den var stabil i fire uger i fravær af puromycin (figur 1B). Fra disse kloner blev 1A4 klon (4T1-luc2-1A4) udvalgt til yderligere undersøgelser. Vækstmønster af 4T1-luc2-1A4 var sammenlignelig med de parentale 4T1 celler i nærvær eller fravær af D-luciferin (figur 1C, D, E). For at løse årsagen til den oprindelige fald i lysemission i 4T1-luc2-1A4 klon, udførte vi begrænset fortynding kultur i plader med 96 brønde. Når celler voksede til omkring 25% sammenflydning, vi undersøgte luciferase ekspression ved bioluminescerende billeddannelse. Hver brønd indeholdende celler viste luciferaseaktivitet. Disse resultater indikerer, at den indledende fald i luciferaseaktivitet ikke skyldtes tabet af luciferase ekspression i nogle celler af klonen (figur S2).

(A) Dannelse af 4T1-luc2-1A4 celler. Musebrysttumor 4T1-celler blev transficeret med en lentiviral vektor indeholdende forbedret luciferase 2 under styring af den humane ubiquitin C promoter [16], [18]. Puromycin-resistente kloner blev isoleret og deres luciferase- udtryk blev screenet ved bioluminescens. To runder af kloning genereret 4 enkelt celle kloner af 4T1-luc2. Luciferaseaktiviteter blev målt ved hjælp af en IVIS spektrum (Binning: med, f-stop: 1, eksponeringstid: 1 sek). En typisk bioluminescens billede til test stabilitet af luciferase ekspression er vist. Samlede flux (fotoner /sek) blev kvantificeret ved anvendelse Living Billede software 3.0. Klon 4T1-luc2-1A4 blev udvalgt og anvendt til yderligere undersøgelser. (B) Stabilitet af luciferaseaktivitet af fire 4T1-luc2 kloner. Celler blev dyrket i 6 uger i almindelige medie uden puromycin og deres lysemission blev overvåget ugentligt. Alle kloner viste mere end 7.000 fotoner /s /celle af lys emission i hele testperioden. (C) Vækst kurver af 4T1-luc2-1A4 klon og forældre 4T1 celler. Celler blev dyrket i 4 dage i regelmæssig vækstmedium uden puromycin. Totale antal af celler over tid blev plottet i en logaritmisk skala. Begge cellelinjer viste lignende vækstmønstre og fordobling gange. (D, E) Vækst af 4T1-luc2-1A4 klon og forældrenes 4T1 celler i tilstedeværelse af D-luciferin. Celler blev fodret med D-luciferin gang om dagen (150 pg /ml /dag, D) eller to gange om dagen (300 pg /ml /dag, E), henholdsvis høstet ved hvert tidspunkt og talt. Tilstedeværelse af overskuddet af D-luciferin påvirkede ikke de overordnede vækstmønstre af 4T1-luc2 celler.

Ikke-invasiv detektering af små antal celler i

nu /nu

Mus

Fordi 4T1-luc2 celler viste ekstremt høj lysudsendelse, vi næste forsøgt at detektere små antal af disse celler

in vivo

. Oprindeligt blev de 4T1-luc2-1A4 celler fremstillet under anvendelse af en seriefortynding fremgangsmåde og blev implanteret i begge flanker af den hunlige nu /nu-mus (figur 2). Forskellige antal celler blev implanteret i hvert implantationssteder. Seks implantationer blev udført for hvert antal celler (3, 5, 10, og 50 celler). Bioluminescens billeder blev taget umiddelbart efter implantationer. Ved hjælp af en meget følsom kølet CCD-kamera, var vi i stand til at opdage så få som tre celler i dette eksperiment (figur 2A-D, røde stiplede cirkler). I nogle tilfælde, men vi fandt ikke nogen meningsfulde signaler fra de steder, hvor implantation (Fig 2A-D, gule stiplede cirkler). Dette kunne tilskrives celledød umiddelbart efter implantation eller iboende variabilitet af seriel fortynding metode, når det planlagte antal celler er meget lille (fig 2A-D, gule cirkler). Særskilt, tog vi PC3M-luc-C6 som var en af ​​de lyseste cellelinjer (-250 fotoner /sek /celle), der genereres af os hidtil (ved hjælp af flere runder af transfektioner ved pGL3) og sammenlignet det med 4T1-luc2-1A4 celler , ved at implantere både i SCID-mus (bg Figur S3). Resultaterne illustrerer, at de bioluminescerende signaler fra 10

2 4T1-luc2-1A4 celler i lodne mus var let detekterbar, mens intet signal blev detekteret fra det samme antal PC3M-luc-C6-celler.

( AD) Defineret antal celler blev implanteret subkutant i dorsale flanke regioner af kvindelige nu /nu-mus [1]. Hver mus modtog to implantationer. Mellemværker angiver antallet af celler implanteres. D-luciferin blev injiceret i mus umiddelbart efter implantation og bioluminiscerende billeder blev taget (t = 0) under anvendelse af en IVIS spektrum (FOV, A, binning, små, f-stop, 1, eksponeringstid, 5 min). (E-H) Efter 6 timers implantation alle mus blev re-afbildet med de samme indstillinger i IVIS Spectrum (t = 6h). Røde cirkler repræsenterer implantationssteder der havde bioluminiscerende signaler højere end autoluminescens. Gule cirkler angiver implantationssteder der ikke har resulteret nogen meningsfuld signaler muligvis på grund af øjeblikkelig celledød. (I) Korrelation mellem antallet af implanterede celler og det samlede flux fra implantationssteder. Bioluminescerende signaler blev kvantificeret ved anvendelse Living Billede software 3.0 og afbildet mod antallet af celler. Den målte intensitet af bioluminescens var direkte proportional med antallet af implanterede celler. Stjerner (*) indikerer væv autoluminescens.

Seks timer efter implantationer, vi re-filmede det samme sæt af dyr (fig 2E-H). Som forventet, baseret på den fjendtligt efter implantation miljø, 4 lokaliteter af 10- og 50-celle implantationssteder mistet deres oprindelige bioluminiscerende signaler (fig 2G, H). Imidlertid overraskende var vi i stand til at detektere signaler fra 3- og 5-celle implantationssteder (figur 2E, F). Vores analyser af billeder taget umiddelbart efter implantation (t = 0) indikerer, at samlede flux fra implantationssteder var direkte proportional med antallet af celler implanteret (Fig 2I). Dette er i overensstemmelse med de øvrige data (ikke vist), der viser lineær sammenhæng mellem lys emission og antallet af celler forgyldt

in vitro

. Baseret på disse resultater, vi demonstreret, at bioluminescens måling er en plausibel metode til at opnå ikke-invasiv overvågning af tidlig tumorvækst

in vivo

.

Påvisning af et fælles Bioluminescent 4T1-luc2 Cell

In vivo

efter bekræftelse non-invasiv påvisning af tre celler

in vivo

, vi udfordrede os til at opdage en enkelt 4T1-luc2-1A4 celle efter subkutan implantation. For at eliminere eksperimentelle fejl og tilføje nøjagtighed til bestemmelse af antallet af implanterede celler anvendte vi en mikropipette at implantere en enkelt 4T1-luc-2-1A4 celle. Først blev 4T1-luc2-1A4 celler trypsiniseret og udpladet på en celledyrkningsskål. Derefter blev individuelle celler samlet op og implanteret under anvendelse af en mikropipette til subkutane spalter lavet i flanken regioner af mus. Mus blev opdelt i to grupper: fire mus blev implanteret med enkelte celler, og fire andre mus blev implanteret med 10 celler hver (fig S4C, D). Dyrene blev derefter udsat for bioluminescens billeddannelse umiddelbart efter implantationen. I nogle tilfælde var vi i stand til at opdage en enkelt 4T1-luc2-1A4 celle (figur 3A-C og figur S4A, B). På hver af de tre uafhængige og sekventielle billeder af det samme enkelt celle vi i alt registreret flux i området fra 460 til 528 fotoner /sek. Line profilering analyser af det registrerede flux fra en enkelt celle afslørede et signal til baggrund-forhold på 6 til 1, med signalet tydeligt stammer fra implantationsstedet (figur 3D, E). Vi konkluderede derfor, at den selvlysende signal faktisk stammede fra en enkelt 4T1-luc2-1A4 celle. Den manglende signal fra de andre tre steder i hver gruppe kunne tilskrives hurtig celledød.

(A-C) selvlysende signal af en enkelt 4T1-luc2-1A4 celle

in vivo

. En enkelt celle blev implanteret i ryggen af ​​en

nu /nu

mus. D-luciferin blev injiceret i mus intraperitonealt og bioluminiscerende billeder blev taget under anvendelse af et IVIS spektrum (FOV, C, binning, små, f-stop, 1, eksponeringstid, 5 min). Billeder til før og efter luciferin injektion blev vist i paneler (A) og (B), hhv. Forstørret billede af den stiplede område fra panelet (B) er vist på panelet (C). Den stiplede cirkel repræsenterer det enkelt celle signal. Stjernen (*) angiver baggrundssignalet fra tarmen. (D, E) Linie profilering analyse af enkelt celle signal. Lysemission blev plottet langs linien vises på panelet (D). Peak signal i panelet (E) repræsenterer lysemissionen fra en enkelt 4T1-luc2-1A4 celle. (F) Tumor udvikling fra fem 4T1-luc2-1A4 celler. Celler blev implanteret subkutant (under anvendelse af en mikropipette) i den dorsale flanke region af et

nu /nu

mus. Bioluminiscerende billeder blev først taget før D-luciferin injektion (Pre-luciferin). Dyret blev derefter afbildet på dag 0 til dag 42. (G) Overvågning af tumorvækst fra 5 celler i 4T1-luc2-1A4. Bioluminiscerende signaler blev kvantificeret ved hjælp Living Billede software og plottet mod fysiske målinger tumor volumen med en skydelære. Tumor var ikke håndgribelig indtil dag 27 efter implantation mens bioluminescerende signaler blev detekteret fra dag 0. Bemærk at total flux blev plottet i en logaritmisk skala. (H) Tumor udvikling fra 10 celler i 4T1-luc2-1A4. Celler blev implanteret subkutant (under anvendelse af en mikropipette) på bagsiden af ​​en

nu /nu

mus. Signalet baggrund er vist i pre-D-luciferin injektion billede (Pre-luciferin). Tumorvæksten blev overvåget i 40 dage under anvendelse af en IVIS Spectrum og en passer. (I) Overvågning af tumorvækst fra 10 celler i 4T1-luc2-1A4. Tumorvolumener blev målt ved anvendelse af en skydelære og plottet mod bioluminiscerende signaler, som blev kvantificeret ved anvendelse Living Billede software. Tumor var ikke håndgribelig indtil dag 29 efter implantation. Tværtimod bioluminescerende signaler var forskelligt fra dag 0 af implantation.

Tumor Udvikling fra små bestande af 4T1-luc2 Cells

Efter påvisning af en enkelt celle

in vivo

, musene implanteret med 1-50 celler blev overvåget for forlænget tidsperiode for at opdage eventuelle tumorvækst. Vi antager, at implantation af et større antal celler ville omgå det problem, at fjendtlige efter implantation miljøer stede til mindre antal af celler. I betragtning af at rutinemæssig tumor implantation procedurer anvender 0,5 til 10 millioner af celler i subkutane tumor-modeller, vi ikke forvente, tumorer at hidrøre fra sådanne små antal celler. Til vores overraskelse, to mus, som blev implanteret med 5 og 10 celler udviklede faste tumorer. Vi fortsatte med at billedet disse mus, og når tumorerne blev palpable vi også fysisk målt deres dimensioner ved hjælp af standard kalibre. kunne ikke påvises de tumorer opstået ud fra 5-celle og 10-celle implantationer med passere før dag 27 og dag 29, (figur 3G, I). Men ikke-invasiv synligt lys billeddannelse, tilladt os at påvise og kvantificere tumorbyrder kontinuerligt fra tidspunktet for implantation (figur 3F, H). Disse data viser klart, at tumorvækst kan overvåges ved hjælp af ikke-invasiv bioluminescens billeddannelse, så snart cellerne implanteres i et dyr, selv når så få som fem celler implanteres.

metastaser af 4T1-luc2-1A4 Cells i Balb /c mus fra orthotopisk implantation i brystfedtpuden

for at teste metastatiske egenskaber af 4T1-luc2-1A4 celler, vi orthotopisk implanterede disse celler til yverfedt puder af kvindelig nu /nu-mus ( 5 × 10

5 celler per mus, n = 9). De primære tumorer voksede hurtigt og udviklet metastatiske læsioner, der kunne påvises under anvendelse af bioluminescens billeddannelse ved dag 27 (figur 4). For at bekræfte metastase af tumorceller i lungerne, vi isoleret lungevæv på dag 27 efter implantation og tog

ex vivo Restaurant billeder (figur 4B). Desuden har vi udført histologiske analyser på formalin-bevaret, paraffin sektioneret væv. Resultaterne viste, at lungehinden og subpleurale regioner af lungerne var infiltreret med ark af dårligt differentieret neoplastiske celler der viser, at bioluminescerende billeddannelse effektivt kan detektere mikrometastaser i en mus (figur 4C, D). Men det er svært at spekulere præcist, hvor mange celler bosat i de metastaseret tumormasserne baseret på lysudsendelsen registreret

in vivo

da det udsendte lys dæmpes og spredt afhængigt af vej det udøver gennem væv, og nøjagtige placering af disse tumorer er ikke klarlagt.

(A) Female nu /nu mus blev podet med 5 x 10

5 4T1-luc2-1A4 celler orthotopisk i de abdominale yverfedt pads [1] . Bioluminiscerende billeder blev taget på langs. Ved post-implantation dag 27 blev mikrometastaser påvist i lunger (pile) (B) Lungerne blev isoleret på post-implantation dag 27 og

ex vivo

billedet blev taget. (C, D) Lung væv blev fikseret i formalin og indlejret i paraffin. H Xba I og ligeret ind pUB6-V5-HisB vektoren (Invitrogen, CA). Et fragment genereret ved Bgl II og BstB I fordøjelse af pUB6-luc2 blev ligeret ind i en modificeret pLPCX vektor (Clontech, CA). En lentiviral vector som bærer humant ubiquitin C promoter og luc2 cDNA blev genereret ved at indsætte BglII EcoR I fragment fra oven konstruktion i Bcl I EcoR I i den modificerede pLKO.1 vektoren (Sigma-Aldrich, MO) [18], [19].

Cell Culture

Mus brystkirtel tumorcellelinie 4T1 blev opnået fra ATCC (Manassas, VA). Celler blev dyrket i højglucose RPMI 1640-medium (ATCC). PC-3M-luc-C6-celler blev dyrket i minimalt essentielt medium (ATCC) (for supplerende data) [30]. Alle medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, UT) uden antibiotika. Vækstkurver blev frembragt ved podning 50.000 celler i T25-flasker. På hvert tidspunkt blev celler trypsiniseret og talt under anvendelse af en automatisk celletæller (Nexcelom, MA).