PLoS ONE: Forbedret antitumorvirkning og til nedsat systemiske toksicitet sulfatid-indeholdende Nanoliposomal doxorubicin i en xenotransplantationsmodel af kolorektal Cancer

Abstrakt

sulfatid er en glycosphingolipid kendt for at interagere med flere ekstracellulære matrix proteiner, såsom tenascin- C, som overudtrykkes i mange typer cancer, herunder om den i tyktarmen. I betragtning af den begrænsede succes med kemoterapi i colorektal cancer og høj toksicitet af doxorubicin (DOX), blev taget et sulfatid-indeholdende liposom (SCL) indkapsling fremgangsmåde for at eliminere disse barrierer. Denne undersøgelse vurderede in vitro cytotoksicitet, biofordeling, terapeutisk virkning og systemisk toksicitet in vivo af sulfatid-holdige liposomal doxorubicin (SCL-DOX) under anvendelse af humant colon adenocarcinom HT-29 xenograft som forsøgsmodel. In vitro blev SCL-DOX vist skal afgives til kernerne og vises forlænget retention sammenlignet med det frie DOX. Anvendelsen af ​​denne nanodrug leveringssystem at levere DOX til behandling af tumorbærende mus frembragte en meget forbedret terapeutisk virkning med hensyn til tumorvækst undertrykkelse og forlænget overlevelse i modsætning til det frie lægemiddel. Endvidere behandling af tumorbærende mus med SCL-DOX resulterede i en lavere DOX optagelse i de vigtigste steder af toksiciteten af ​​frit lægemiddel, nemlig hjerte og hud, samt nedsat myelosuppression og formindsket kardiotoksicitet. Sådanne naturlige lipid-styrede nanodrug leveringssystemer kan repræsentere en ny strategi for udvikling af effektive anticancer kemoterapeutika rettet mod tumor mikromiljø for både primær tumor og mikrometastaser

Henvisning:. Lin J, Yu Y, Shigdar S, Fang DZ , Du JR, Wei MQ, et al. (2012) Forbedret antitumorvirkning og til nedsat systemiske toksicitet sulfatid-indeholdende Nanoliposomal doxorubicin i en xenotransplantationsmodel af kolorektal cancer. PLoS ONE 7 (11): e49277. doi: 10,1371 /journal.pone.0049277

Redaktør: Maurilio Sampaolesi, Stem Cell Research Institute, Belgien

Modtaget: Juli 22, 2012; Accepteret: 8 oktober 2012; Udgivet: November 7, 2012 |

Copyright: © 2012 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Health og Medical Research Council (# 479.505); Australien og Indien Strategic Research Fund, (ST01-0013). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer er den tredje mest almindelige årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan [1], [2], med op til 25% af patienter med metastatisk sygdom. Trods kirurgi og kemoterapi, mange af disse patienter til sidst bukke under for metastatiske sygdomme. Adjuvans-terapier, herunder strålebehandling og kemoterapi, er designet til at målrette tilbageværende tumorceller. I fase III-patienter med kolorektal cancer, kemoterapi fortsat den vigtigste behandling strategi [3]. Imidlertid er effektiviteten af ​​disse behandlinger begrænses af fremkomsten af ​​terapi-resistent cancerceller samt dosisbegrænsende toksiciteter [4]. I løbet af de seneste årtier, har nanoskala terapeutiske systemer dukket op som nye terapeutiske modaliteter til bekæmpelse af kræft [4]. Nanopartikel formuleringer af traditionelle frie anticancer lægemidler kan have forbedret farmakokinetik og biofordeling profiler, forbedret antitumor effekt, samt reduceret toksicitet til raske væv.

Liposomale narkotika var de første godkendt og udbredt sådan nanomedicin til behandling af kræftformer [5], [6]. Liposomer er mikroskopiske phospholipidvesikler med et dobbeltlagede membran struktur. Prækliniske og kliniske undersøgelser har vist, at de farmakokinetiske profiler, samt de særlige målretning af liposomer kan kontrolleres og modificeret til at reducere bivirkninger af indkapslede lægemidler og forbedre deres effektivitet [7], [8], [9].

Vi har for nylig udviklet en ny liposomal bærer system, der er sammensat af to lipider fundet i mennesker, sulfatid og 1,2-dioleoyl-

sn

glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE) [12 ], [13]. Under fysiologisk pH, DOPE bibringer stabilitet til sulfatid-holdige liposomer (SCL) via dens inhiberende virkninger på liposomfusion, som inkorporering af sulfatid i DOPE vesikler spænder forøger stabiliteten af ​​liposomerne dannet, selv i nærvær af plasma, formodentlig på grund af hydreringen af ​​den negativt ladede sulfat- hoved-gruppe med glycosphingolipid [10]. Vi har også påvist, at samspillet mellem sulfatid og tenascin medierer bindingen af ​​SCL til ECM og endocytiske optagelse af liposomer ved tumorceller mindst in vitro [10], [11].

Den målrettede levering af anticancermidler til tumormikromiljøet er en lovende vej til terapi af metastatisk colorectal cancer. Tenascin-C, en stor ekstracellulær matrix hexabracchion glycoprotein, er overudtrykt i mikromiljø fleste faste tumorer, herunder kolorektal kræft, men er fraværende eller stærkt reduceret i de fleste voksne væv [14]. Vores sulfatid-holdige liposomale bærersystemet repræsenterer således en ny klasse af naturlige lipid-styret intracellulær leveringssystem målretning tumormikromiljøet. I at udforske sådan ny retning for udviklingen af ​​mere effektive kemoterapeutika, er det vigtigt at forstå in vivo opførsel af Nanobærer, som den unikke fordeling reguleres af egenskaberne af Nanobærer kan ændre den terapeutiske virkning samt ændre toksiciteten profil af det indkapslede lægemiddel. I denne undersøgelse anvender vi en mus xenograft model af human colorektal adenocarcinom (HT-29), der er kendt for at udtrykke tenascin-C [15], [16] og en meget anvendt kemoterapi stof, doxorubicin (DOX), som model nyttelast at studere biodistribution, antitumor effekt og toksicitet af sulfatid-holdige liposomal carrier system.

Materialer og metoder

Etik Statement

Deakin University Animal Welfare har godkendt alle dyr protokoller, der anvendes i denne forskning.

Cell Culture

Den humane kolorektal adenocarcinom cellelinie HT-29 blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). McCoys 5A (modificeret) medium blev købt hos Invitrogen ™ (Australien). Føtalt bovint serum (FBS) blev indkøbt fra Hyclone (Canada). Trypsin blev købt hos Invitrogen ™ (Australien). Vævskulturkolber blev indkøbt fra BD Falcon ™ (Australien). Glasbund retter blev købt fra Mattek Corporation (Ashalnd, MA, USA). HT-29 celler blev dyrket i McCoys 5A-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, penicillin (50 U /ml) og streptomycin (50 ug /ml) i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 og 95% luft ved 37 ° C.

Fremstilling af SCL-DOX

Liposomer blev fremstillet ifølge en tidligere publiceret metode med visse ændringer [10]. Kort fortalt blev DOPE unilamellare vesikler indeholdende 30% (molforhold) sulfatid fremstillet ved en hydrering metode efterfulgt af polycarbonatmembran ekstrudering. DOPE (13,35 mM) og sulfatid (6 mM, Avanti Polar Lipids, Inc.) blev opløst i en blanding af chloroform og methanol (02:01, v /v), og lipidblandingen, sammensat af DOPE /sulfatid (3: 7, mol /mol), blev overført til glasrør. Prøver blev derefter reduceret til et minimalt volumen under en nitrogenstrøm, og opbevaret under vakuum i 24 timer ved 4 ° C til fuldstændig afdampe det organiske opløsningsmiddel. De tynde lipidfilm blev hydratiseret ved tilsætning af 1 ml 250 mM ammoniumsulfat (pH 8,5). Prøverne blev derefter placeret i et is-vandbad og sonikeret under nitrogen i 2,5 min med 50% amplitude under anvendelse af en sonikator (Sonics Materials, Inc). Efter sonikering blev liposomerne dannes via ekstrudering gennem polycarbonatmembraner (Avanti Polar Lipids, Inc.) med konsekutive porestørrelser på 400 nm til 14 gange, 200 nm for 14 gange og 100 nm for 19 gange ved stuetemperatur. At etablere en trans-dobbeltlag ammoniumsulfatgradient blev de ekstruderede liposomer dialyseret mod en 250-folds volumen af ​​10% saccharose i 25 mM Trizma ved pH 8,5 ved 4 ° C i 24 timer. Den eksterne puffer blev skiftet tre gange under dialyse. Efter dialyse af liposomerne, DOX, i 10% saccharose ved en endelig koncentration på 5 mg /ml, blev tilsat til liposomerne ved en lægemiddel-til-lipid-forhold på 0.3:1 (vægt /vægt), efterfulgt af inkubation i en vandbad ved 60 ° C i 1 time. Ikke-indkapslet DOX blev fjernet ved størrelsesudelukkelseskromatografi under anvendelse af en Sephadex G-50-søjle. Koncentrationen af ​​phospholipider (DOPE) i liposomerne blev bestemt som tidligere beskrevet [17]. Vesiklen størrelse og zetapotentialet af SCL blev målt under anvendelse Zetasizer Nano ZS Particle Karakterisering System fra Malvern? Instrumenter (Malvern, UK). Den DOX indlæst i SCL blev kvantificeret ved anvendelse af en fluorescensdetektor i High Performance Liquid Chromatography (HPLC).

Kromatografisk instrumentering blev anvendt baseret på en tidligere publiceret metode med visse ændringer [18], [19]. Kort fortalt, HPLC-systemet (Milford, MA, USA) anvendt i dette studie består af en Waters e2695 Separation Module og en Waters 2475 Multi λ fluorescensdetektor. De excitation og emissionsbølgelængder blev fastsat til 470 nm og 585 nm. Kromatografisk separation udførtes under anvendelse af en Nova-Pak® C18-søjle (3,9 x 150 mm i.d., 4 um, Waters, USA) med en Nova-Pak® C18 guard-søjle (3,9 x 20 mm i.d., 4 um, Waters, USA). En blanding af methanol og 10 mM phosphatbuffer (pH = 3,0) blev anvendt som den mobile fase. Strømningshastigheden anvendes i assayet var 1 ml /min, og søjlen blev holdt ved 40 ± 5 ° C under hele den kromatografiske proces.

Analyse af cytotoksicitet

Virkningen af ​​fri DOX eller SCL-DOX på HT-29 cytotoksicitet blev bestemt ved anvendelse af MTT-celleproliferationsassay [20], [21]. HT-29-celler blev podet ved en densitet på 2 x 10

3 celler per brønd i en plade med 96 brønde i 100 pi McCoys 5A medium indeholdende 10% FBS. Fri DOX opløsning og SCL-DOX blev tilsat til hver brønd 24 timer efter udpladning (slutkoncentration 0-100 pg /ml). Efter 48 timers inkubation ved 37 ° C, 5% CO

2, absorbansen blev målt ved en bølgelængde på 570 nm under anvendelse af en Victor-TM X5 Multilabel HTS Plate Reader (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Cytotoksicitet blev udtrykt som en procentdel af kontrolceller. Inhiberingen koncentration 50% (IC

50), defineret som den dosis af midler, som inhiberede 50% af cellevækst, blev interpoleret fra vækstkurverne vha SPSS 13.0 [18], [19]. Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer og gentaget tre gange.

konfokalmikroskopi Analyse for Cellulær Optagelse og Tilbageholdelse af SCL-DOX

HT-29-celler (1 x 10

5 celler /brønd) blev podet i 35 mm glasbund skåle og inkuberet ved 37 ° C i 5% CO

2 i 24 timer. Mediet blev derefter erstattet med fuld dyrkningsmedium indeholdende 2 pg /mL free DOX eller SCL-DOX. Fireogtyve timer senere blev cellerne vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS) og afbildes for cellulær optagelse studier. For tilbageholdelser undersøgelser blev celler først eksponeret for 2 ug /ml fri DOX eller SCL-DOX i fuld celledyrkningsmedium i 24 timer og derefter vasket to gange med PBS. Celler blev derefter inkuberet med frisk celledyrkningsmedium og serielt afbildet ved 1 time, 2 timer, 4 timer, og 24 timer under anvendelse af en FluoView FV10i fluorescens laser scanning konfokal mikroskopi (Olympus, Japan).

Analyse af farmakokinetiske egenskaber in vivo

Sprague-Dawley (SD) rotter (200 til 250 g) blev holdt i et temperaturreguleret rum (25 ± 1 ° C) med en 12-timers lys-mørke cyklus. Rotter blev fodret

ad libitum

med en standard kost, men blev fastet natten over, før fri DOX eller SCL-DOX administration. Alle procedurer, der involverer dyreforsøg blev godkendt af Deakin University Animal Welfare Udvalg.

For at undersøge farmakokinetik (PK) egenskaber af SCL-DOX in vivo blev rotter sunde SD injiceret intravenøst ​​med gratis DOX eller SCL-DOX via halevenen med en enkelt dosis på 5 mg DOX /kg. Blod blev serielt indsamlet fra det samme dyr i heparinbehandlede rør fra halen ved 2 min, 0,5 time, 2 timer, 6 timer, 24 timer og 48 timer. Efter indsamling blev prøverne centrifugeret ved 3.000 x

g

ved 4 ° C i 10 minutter for at separere plasmaet. For at bestemme DOX i plasma, 495 pi methanol og 405 pi phosphatbuffer blev derefter tilsat til 100 pi plasma, hvirvelbehandlet i 1 min, og centrifugeret ved 21.000 x

g

i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev overført til et andet rør efterfulgt af tilsætning af 2 pi af perchlorsyre (35%, v /v). Prøverne blev vortexet i 1 min, og centrifugeret ved 21.000 ×

g

i 10 minutter ved 4 ° C, efterfulgt af måling af DOX koncentration ved anvendelse af HPLC.

tumorimplantation, behandling og evaluering

xenotransplantattumorer blev etableret i 6 uger gamle BALB /c-Foxn1

nu mus, der blev købt fra The Animal Resources Centre (Perth, Australien). Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i institutionelle dyrevelfærd Komité Deakin University. Mus blev holdt under patogenfrie betingelser i TECNIPLAST Sealsafe ™ Individuelt Ventilerede bure (Buguggiate, Italien) ved (25 ± 1 ° C) og en 12-timers lys /12-timers mørke-cyklus. De blev fodret

ad libitum

med en standard kost.

HT-29 celler til xenotransplantattumorer fremstilles ved trypsinisering. Cellerne blev vasket og resuspenderet ved en koncentration på 3 × 10

7 celler /ml i PBS, som derefter blev inokuleret subkutant (s. C.) I den højre flanke af musene. Tumor størrelse blev vurderet ved hjælp af en digital skydelære hver anden dag efter implantation og omtrentlige tumorbyrde (mm

3) blev beregnet som længde × bredde

2/2 (

V

=

lw

2/2), hvor længde og bredde er den længste og korteste akse i millimeter [22].

for tumoren optagelse undersøgelsen, mus med tumorer -150 mm

3 var behandlet med fri DOX eller SCL-DOX (5 mg /kg DOX eller tilsvarende) via injektion i halevenen. Fireogtyve timer efter injektion blev mus aflivet ved injektion af Lethabarb R (100 mg /kg) og tumorer blev behandlet som tidligere beskrevet [23], [24]. DOX koncentration i væv blev bestemt ved anvendelse af HPLC.

Til terapeutiske eksperimenter blev mus behandlet når xenotransplantattumorer nåede 35 mm

3. Mus modtog en injektion af saltopløsning, fri DOX (5 mg /kg), SCL-DOX (5 mg /kg i DOX) eller blank SCL via halevenen to gange om ugen i 3 uger. Tumorvækst blev overvåget ved måling af tumordiametre hver anden dag med en passer og animalske vægte blev overvåget på samme tid. Endepunktet for denne undersøgelse blev defineret som tumor belastning nå 1700 mm

3.

Analyse af systemisk toksicitet

For at vurdere den generelle toksicitet fri DOX og SCL-DOX, blod blev opsamlet når musene for terapeutiske eksperimenter blev ofret. Blodlegemer tæller og troponin blev analyseret af en veterinær patologi laboratorium (Gribbles Veterinary Pathology, Clayton, Victoria, Australien). Blodudstrygninger blev opnået for hvert dyr til opnåelse af en relativ hvide blodlegemer tilpasset fra Fonio fremgangsmåde til blodplade tælling [25], [26], med mindre modifikationer. Objektglas blev farvet med Giesma og et område af blodudstrygninger blev valgt hvor de røde blodlegemer an hinanden, men ikke overlapper, med konsekutive felter valgt at eliminere bias. Det totale antal hvide blodlegemer pr 1500 røde celler blev talt (n = 3 for hvert objektglas) og sammenlignes for hver gruppe.

Dataanalyse

Alle resultaterne præsenteres som midler og standardafvigelse (gennemsnit ± SE). De farmakokinetiske parametre blev beregnet ud fra de gennemsnitlige plasmakoncentrationer ved hjælp af farmakokinetiske software DAS 2.0 software (Matematisk Pharmacology Faglige Udvalg for Kina, Shanghai, Kina). Forskellene i middelværdierne mellem forskellige grupper blev bestemt ved en envejs variansanalyse (ANOVA) under anvendelse af SPSS 13.0 program. Signifikans blev behandlet på værdier af

s

. 0,05

Resultater

Karakterisering af SCL

Diameteren af ​​SCL indarbejde DOX blev fundet at ligge inden for 92,3 ± 1,3 nm (gennemsnit ± SE; n = 10) med polydispergeringsindeks (PDI) på 0,15 ± 0,01 (gennemsnit ± SE). Ved et indledende vægtforhold mellem DOX til DOPE af 0.3:1, SCL havde en gennemsnitlig DOX indkapslingseffektivitet af 94,11 ± 2,27% (middelværdi ± S.E.). Zeta potentielle værdi af SCL var -26,38 ± 2,20 mV (gennemsnit ± S.E.). Den DOX til DOPE vægtforhold efter DOX indkapsling i SCL var 0.5:1.

intracellulære optagelse og fastholdelse af SCL-DOX i HT-29 Cells

Ved at udnytte den naturlige fluorescerende egenskab af DOX , den cellulære optagelse og fastholdelse af fri DOX eller SCL-DOX blev undersøgt under anvendelse laserscanning konfokal mikroskopi. HT-29-celler blev inkuberet med 2 ug /ml DOX eller SCL-DOX i 24 timer. Efter vask blev den cellulære optagelse af forskellige formuleringer af DOX undersøgt. Som vist i figur S1 (lav forstørrelse) og figur 1 (høj forstørrelse), både fri DOX og SCL-DOX blev taget op af kolorektal adenocarcinomceller og der var ophobninger af DOX i kernen i begge grupper (figur 1), omend celler behandlet med gratis DOX viste lidt stærkere rød fluorescens (DOX) end dem behandlet med SCL-DOX efter 24 timers inkubation. Interessant, opbevaring af SCL-DOX i HT-29 celler var bedre end gratis DOX. Som vist i figur S2A (lav forstørrelse) og figur 2A (høj forstørrelse), efter vask med PBS og inkubering i frisk medium i 4 timer, den DOX fluorescens i fri DOX gruppen faldt betydeligt. Desuden celler behandlet med fri DOX viste formindsket rød fluorescens 24 timer efter vask. Omvendt er den røde fluorescens til SCL-DOX var mere stabil sammenlignet med den af ​​den frie DOX gruppen. Selv 24 timer efter vask, kan DOX fluorescens let observeres i kernerne i celler behandlet med SCL-DOX (fig S2B og figur 2B). Den forøgede retention af SCL-DOX in vitro tyder på, at SCL formulering af DOX kan udvise bedre behandling effektivitet in vivo.

HT-29-celler blev inkuberet med 2 ug /ml fri DOX eller tilsvarende SCL-DOX i 24 h. Efter to gange vask med PBS blev cellerne afbildet med et konfokalt fluorescensmikroskop. (A) Celler behandlet med gratis DOX. (B) Celler behandlet med SLC-DOX. Rød: fluorescens fra DOX; blå: kerner farvet med Hoechst 33342. Scale barer: 10 um

HT-29 celler blev først inkuberet med 2 mg /ml fri DOX eller tilsvarende SCL-DOX i 24 timer.. Efter to gange vask med PBS for at fjerne lægemidlerne blev celler dyrket i frisk fuld dyrkningsmedium efterfulgt af imaging serielt på 1 time, 2 timer, 4 timer og 24 timer under anvendelse af fluorescens konfokal mikroskopi. (A) Celler behandlet med gratis DOX. (B) Celler behandlet med SLC-DOX. Rød: fluorescens fra DOX; blå: kerner farvet med Hoechst 33342. Scale barer:. 10 um

In vitro Cytotoksicitet

For at undersøge in vitro cytotoksicitet, blev HT-29 celler udsat for forskellige koncentrationer af frit DOX eller SCL-DOX i 48 timer, og cellelevedygtigheden blev målt under anvendelse af MTT-assayet. Som vist i tabel 1, IC

50 af DOX for HT-29-celler var 1,74 ± 0,10 ug /ml, mens IC

50 af SCL-DOX var 2,77 ± 0,06. Således under in vitro betingelser, hvor celler blev udsat for en konstant koncentration af midlerne gennem hele prøveperioden, fri DOX var mere toksisk end SCL-DOX. Tom SCL viste ingen effekt på celle overlevelse (data ikke vist).

Forbedret farmakokinetiske egenskaber af SCL i Sund SD Rotter

De farmakokinetiske egenskaber af både fri DOX og SCL- DOX blev undersøgt hos raske SD hanrotter. De serum clearance kinetik fri DOX og SCL-DOX blev sammenlignet som vist i tabel 2. I vores undersøgelse, udskillelseshastigheden af ​​DOX indkapslet af SCL-DOX (1,39 l /t /kg) var signifikant lavere end den af ​​DOX-opløsning ( 2.68 l /t /kg,

s

0,01), hvilket tyder på en anden sats af clearance af SCL-DOX i forhold til frit lægemiddel. Desuden arealet under plasma koncentration-tid kurver under studieopholdet (AUC

0-48 h), i DOX leveret gennem SCL var 2,37 gange højere end fri DOX (

s

0,01) . Således kunne DOX viser en betydeligt reduceret clearance rate samt forøget biotilgængelighed, når de administreres indfanget i SCL.

biofordeling og tumoroptag Fordele ved SCL-DOX

Undersøgelser sammenligne ophobning af fri DOX eller SCL-DOX i tumorer og organer blev udført i en BALB /c nøgne mus HT-29 tumor xenograft model. Dyr blev injiceret i.v. med en enkelt dosis af frit DOX eller SCL-DOX (5 mg /kg), og der var ingen statistisk signifikant forskel i DOX koncentration i nyrerne mellem to behandlingsgrupper 24 timer efter administration. Lungerne og leveren udviste højere DOX akkumulering (4,74 gange og 12,94 gange, respektivt) med SCL-DOX behandling (figur 3A), og milten, et hovedorgan af det reticuloendotheliale system, viste en 17 gange højere DOX akkumulering med SCL-DOX behandling. Imidlertid SCL-DOX behandling i de to hovedorganer, der viser dosisbegrænsende toksiciteter af DOX klinisk, nemlig hud og hjerte, faldt DOX akkumulering til 59,0% (0,039 ± 0,001 ug /g versus 0,066 ± 0,003 ug /g) og 77,4% (0,956 ± 0,073 ug /g versus 1,235 ± 0,083 ug /g) i forhold til den frie DOX henholdsvis (figur 3A og 2B). Desuden SCL indkapsling signifikant forøget DOX akkumulering (1,3-fold; 0.060 ± 0,005 ug /g versus 0.047 ± 0,003 ug /g) i xenograft tumor sammenlignet med den frie DOX (figur 3D), klart bekræfter den forbedrede intratumoral DOX levering ved SCL -DOX in vivo.

nøgne mus med humane kolorektal cancer HT-29 xenotransplantater blev behandlet med 5 mg /kg fri DOX eller SCL-DOX iv Mus blev aflivet 24 timer senere. Organer og væv blev høstet, vasket, vejet, og DOX blev ekstraheret og kvantificeret. Data er vist som middelværdi ± S.E. (N = 5~6). *,

P

0,05 sammenlignet med fri DOX; **,

P

. 0,01 i forhold til fri DOX

Forbedret terapeutiske effekt af SCL-DOX

Vi evaluerede antitumoraktivitet SCL-DOX hjælp BALB /c nøgne mus HT-29 tumor xenograft model. Når tumoren var vokset til ca. 35 mm

3, vi delt dyrene tilfældigt i fire grupper (n = 5~10) for at minimere forskellen i vægt og tumorstørrelse blandt grupperne. Følgende regimer blev administreret intravenøst to gange om ugen i 3 uger: (

i

) saltvand; (

ii

) tomme SCL; (

iii

) gratis DOX (5 mg /kg) og (

iv

) SCL-DOX (5 mg /kg). Kropsvægten af ​​dyrene og tumorstørrelsen blev derefter overvåget indtil størrelsen af ​​tumoren hos kontroldyrene nået slutpunktet for undersøgelsen. Som vist i figur 4, for kontrolgrupperne af mus, der fik saltvand eller tomme SCL, har behandlingen ikke nogen effekt, og de gennemsnitlige tumor størrelser i slutningen af ​​studiet var 1129.03 ± 55,06 mm

3, og 1188,63 ± 137.54 mm

3, henholdsvis (gennemsnit ± SE n = 5~6). Den SCL-DOX behandlingsgruppen viste overlegen effekt, med en endelig gennemsnitlig tumor belastning på 586.52 ± 29,63 mm

3, i forhold til 809.13 ± 43,75 mm

3 i den frie DOX gruppen. Således sammenlignet med saltopløsning eller frit DOX behandling, effektiviteten af ​​SCL-DOX til at undertrykke tumorvækst i en dosis på 5 mg /kg var signifikant forbedret ved ~1.9 gange og ~1.4 gange, respektivt.

mus med HT-29 xenotransplantater blev injiceret iv med saltvand, 5 mg /kg af fri DOX, SCL-DOX eller tomme SCL to gange om ugen i 3 uger som angivet, begynder på den dag, hvor tumor volumen nåede ~35 mm

3. De viste data er middel ± S.E. (N = 5~6). *,

P

0,05 sammenlignet med saltvand; **,

P

0,01 sammenlignet med saltvand; #,

P

0,05 sammenlignet med fri DOX; ,

P

0,01 sammenlignet med blank SCL; ,

P

. 0,001 sammenlignet med blank SCL

Næste, vi sammenlignede overlevelsesrater for tumor-bærende mus efter de fire forskellige behandlingsregimer. Som vist i figur 5, median overlevelse for de fire forskellige grupper var 26 dage (saltvand), 33 dage (fri DOX), 36 dage (SCL-DOX) og 32 dage (blank SCL) henholdsvis. Således SCL-DOX behandling forøgede medium levetid med 38,5% i forhold til saltvandkontrolgruppen, med 12,5% i forhold til blindprøven SCL gruppe og med 9,1% i forhold til den frie DOX gruppen. Disse forsøg viste, at administrationen af ​​SCL-DOX i 6 doser over en periode på tre uger ikke kun ydes bedre hæmning af tumorvækst, men også forbedret overlevelse xenograft-bærende dyr.

Kaplan-Meier overlevelse kurve viser en forbedring af levetiden for xenograft-bærende mus behandlet med SCL-DOX (n = 9~10 per gruppe). Mus blev behandlet som angivet i figur 3 og blev ofret i hele undersøgelsesperioden efter at have nået vores undersøgelse slutpunkt.

Reduceret systemisk toksicitet af SCL-DOX

DOX-induceret kardiomyopati er en af de vigtigste dosisbegrænsende toksiciteter af lægemidlet [27]. Kardial troponin-T frigives fra DOX-beskadigede myocytter [28], således, måling af serumniveauer af dette protein giver en følsom vurdering af tidlig kardiotoksicitet af DOX. Den anvendte metode i den foreliggende undersøgelse har en cut-off grænse på 0,01 mg /L for normale individer [29]. Som vist i tabel-3, den frie DOX behandling resulterede i en 75-fold højere troponin serumniveau sammenlignet med kontrollerne, hvilket bekræfter den kendte kardiotoksicitet af det frie lægemiddel. Der blev imidlertid ikke forhøjelse af serum troponin observeret for SCL-DOX behandlingsgruppe, som forblev under cut-off niveauer, som med kontrolgrupperne, hvilket indikerer, at behandling af xenograft-bærende mus med 6 doser af SCL-DOX over en periode på fire uge havde minimal kardiotoksicitet. For at undersøge om indkapsling af DOX i SCL havde nogen indvirkning på sværhedsgraden af ​​knoglemarvssuppression (myelosuppression), den mest almindelige bivirkning ved DOX kemoterapi [27], studerede vi ændringerne i perifere hvide blodlegemer. Som vist i figur 6, var der ingen statistisk signifikant forskel i det samlede antal hvide blodlegemer mellem saltvandsbehandlede eller SCL-DOX-behandlede grupper. Endvidere sammenlignet med mus behandlet med frit DOX, der blev behandlet med SCL-DOX havde en 2,0-fold og en 3,3 gange højere tæller for lymfocytter og monocytter, hhv. Således er vores data antyder, at SCL-DOX har minimal kardiotoksicitet og væsentligt reduceret myelosuppression.

HT-29 xenograft-bærende mus blev behandlet som vist i figur 3. Blod blev opsamlet umiddelbart efter musene blev aflivet efter at have nået den slutpunkt. De viste data er middel ± S.E. (N = 3~5). *,

P

0,05 sammenlignet med saltvand; ***,

P

0,001 sammenlignet med saltvand; #,

P

0,05 sammenlignet med fri DOX; ##,

P

. 0,01 i forhold til fri DOX

Diskussion

Denne undersøgelse er den første til at vurdere vævsfordelingen in vivo anticancer aktiviteter og toksikologiske profil af SCL-DOX i en xenograft musemodel af human colorectal adenocarcinom. Vi har vist flere vigtige punkter: (a) SCL-DOX blev let optages af kolon kræftceller og vises forlænget tilbageholdelsen, (B) indkapsling af DOX i SCL resulterede i et fald fordeling af lægemidlet til de vigtigste steder af akut og kronisk toksicitet af frit DOX, nemlig hjerte og huden, samt markant sænket kardiotoksicitet og myelosuppression; (C) sulfatid-holdige liposomal lægemiddel udviste en forøget terapeutisk virkningsfuldhed i en musemodel af human colorektal adenocarcinom.

intracellulære optagelse af SCL i gliomceller blev vist at være et resultat af endocytisk optagelse af liposomerne i forrige arbejde [11]. I denne undersøgelse bekræftede vi den intracellulære optagelse af SCL-DOX med humane colorektale adenocarcinom celler, HT-29, under anvendelse af konfokal mikroskopi. Vigtigt er det, vi påvist, at det indkapslede kemoterapi lægemiddel blev leveret intracellulært til virkningsstedet, kernerne, af HT-29-celler (figur 1 og 2). Endvidere blev leveret liposomale lægemiddel tilbageholdt af tumorcellerne selv 24 timer efter vask. Vores in vitro-cytotoksicitet undersøgelse sammenlignede levedygtigheden af ​​kolorektal cancer celler behandlet med SCL-DOX og gratis DOX ved hjælp af MTT-analysen og viste, at begge former besidder åbenlys cytotoksicitet. Interessant nok SCL-DOX har en IC

50 59% højere end for frit DOX (Tabel 1). Dette stemmer overens med observationer fra andre, at IC

50 af det frie og liposomale lægemiddel, når de analyseres in vitro, varierer afhængig af de anvendte cellelinier og arten af ​​liposomerne. Fx Wang et al. fundet i rotte prostatacancer-cellelinie MLLB2, IC

50 i den liposomale formulering var signifikant lavere end fri DOX [30]. I en undersøgelse af resistente MCF-7 /ADR celler, den liposomale DOX viste en 30 gange lavere IC

50 i forhold til fri DOX [31]. i andre undersøgelser fri DOX synes dog at have højere intracellulær optagelse og viser højere cytotoksicitet end liposomalt DOX. For eksempel i hepatocellulært carcinom cellelinie HepG2, fri DOX er angivet at besidde en højere cytotoksicitet sammenlignet med den af ​​DOX-fyldte stealth liposomer [24]. Endvidere polyethylenglycol (PEG) coatet-liposomal DOX er blevet vist at have mindre toksicitet end frit DOX i gliom-cellelinje, U-87-celler [10]. Det er vigtigt at forstå, at de in vivo farmakokinetik er meget forskellige mellem liposomal DOX og gratis DOX. Halveringstiden af ​​liposomal DOX kan være flere dage, mens fri DOX kan elimineres i et par minutter in vivo [32], [33], [34]. I celle dyrkningsskåle cellerne udsat for en konstant lægemiddelkoncentration i hele assayet periode, og ofte tage op frie DOX hurtigere end liposomal formulering [35]. Endvidere celler til MTT-assays er for det meste dyrkes i monolag, som har en rumlig organisation drastisk forskellig fra den in vivo 3-dimensionel vævsarkitektur [36]. Således sammenligning af IC

50 mellem en fri lægemiddel og en nanopartikel-formulering af lægemidlet in vitro tilvejebringer en måling af cytotoksicitet under en konstant koncentration under en valgt assay periode, og derfor kan det ikke være i stand til at tilvejebringe en pålidelig forudsigelse af den terapeutiske virkning in vivo [37]. I den foreliggende undersøgelse, at selv om IC

50 af SCL-DOX var højere end for frit DOX i HT-29 celler in vitro, blev SCL formuleringen vist at vise en meget forbedret tumor-inhiberende virkning til de frie DOX i HT -29 tumorbærende nøgne mus (figur 4 og 5).

Mave tumorer er kendt for at være relativt modstandsdygtige over for kemoterapeutika. I 80% af ubehandlede colontumorer, der er et forhøjet niveau af multiresistent I (MDR I) genet [38]. Sammenligningen af ​​farmakokinetiske egenskaber mellem den frie DOX og SCL-DOX hos raske SD rotter viste den betydelige faldt af clearance på SCL-DOX i forhold til fri DOX (

s

0,01).