PLoS ONE: reaktion på stress i Early Tumor Colonization modulerer Skift af CD133-positive og CD133-negative undergrupper i en human metastatisk Colon Cancer Cell Line, SW620

Abstrakt

Ifølge kræft stamceller (CSC) model, højere CD133 ekspression i tumorvæv er forbundet med metastase og dårlig prognose i tyktarmskræft. Som sådan er den CD133-positive (CD133

+) subpopulation af cancerceller menes at spille en central rolle i tumorudvikling og metastatisk progression. Selvom CD133

+ celler menes at vise mere CSC-lignende adfærd og være eneansvarlig for tumor kolonisering, nyere forskning tyder på, at CD133

– celler fra metastatisk kolorektal tumorer ikke kun også besidder kolonisering kapacitet, men også fremmer væksten af større tumorer i en musemodel end CD133

+ -celler, tyder på, at en alternativ mekanisme af metastase eksisterer. Dette studie undersøgte denne mulighed ved at undersøge cellelevedygtigheden, tumorigenicitet og proliferation og vækst kapacitet CD133

+ og CD133

– subpopulationer af SW620-cellelinien, en human metastatisk coloncancercellelinie, i både en

in vitro

celle model og en

in vivo

musemodel. Mens både SW620

CD133- og SW620

CD133 + celler viste sig at engagere sig i tovejs celle-typen skift som reaktion på udsættelse for miljømæssige stressfaktorer, herunder hypoxi, en celleadhæsions-frit miljø, og ekstracellulær matrix stimulation, både

in vitro

in vivo

, CD133

– celler viste sig at have en vækstfordel under tidlig kolonisering på grund af deres større modstand mod spredning inhibering. Baseret på disse resultater, er en hypotetisk model, hvor kolon kræftceller engagere sig i celle-typen skift som reaktion på eksponering for miljømæssige stressfaktorer foreslået. En sådan kobling kan give en overlevelse fordel i den tidlige kolonisering, samt at forklare tidligere modstridende observationer

Henvisning:. Hsu CS, Tung CY, Yang CY, Lin CH (2013) reaktion på stress i Early Tumor Colonization modulerer Skift af CD133-positive og CD133-Negative subpopulationer i en human metastatisk Colon Cancer Cell line, SW620. PLoS ONE 8 (4): e61133. doi: 10,1371 /journal.pone.0061133

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: 23. oktober 2012; Accepteret: 5 mar 2013; Udgivet: April 5, 2013 |

Copyright: © 2013 Hsu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger NSC 97-3112-B-075-002, NSC 98-3112-B-010-023-B4, og NSC 97-2320-B-010-024-MY3 fra National Science Rådet og af Sigt efter Top University Plan fra Undervisningsministeriet, Kina. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

fleste dødsfald som følge af tyktarmskræft er korreleret med metastase af den primære tumor snarere end udvikling af den primære tumor. Som sådan kunne opnå forståelse for tyktarmskræft metastase i høj grad øge patientens overlevelsesraten. Opnåelse et sådant mål er særlig vigtig, da den mediane samlede overlevelse varigheden af ​​metastatiske patienter tyktarmskræft er i øjeblikket mindre end 2 år og 5-års overlevelse under 10% [1], [2]. At vinde forståelse af metastaser kunne også i høj grad hjælpe med at vælge den passende terapi strategi

Det er i øjeblikket kendt, at tumor metastase er en multi-trins proces, hvor malignitet af tumorceller progressivt udvikler sig i 3 på hinanden følgende stadier. Intravasation, ekstravasation og kolonisering [3]. I intravasation fase, hvorunder tumorceller undergår cellulære funktionelle ændringer i forberedelse til cellemigrering og ekstracellulær matrix (ECM) fordøjelse, tumorceller begynder at flygte fra det primære site og invadere det cirkulerende system. I ekstravasation scenen, tumorceller cirkulerer i blodkarrene og lymfesystemet, inden de transporteres til fjerne metastatiske steder. Under cancer kolonisering stadium, de transporterede tumorceller tilpasse sig mikromiljøet og begynder at formere sig. I den tidlige kolonisering fase, er tumorceller udfordret af mange miljømæssige stressfaktorer, såsom ECM interaktioner, hypoxiske betingelser, vækst-faktor stimulation og immunsystemet interaktioner, der fører til deres død eller vækstdvale [3]. De få celler, der kan tilpasse sig stressfaktorer og overleve bliver subpopulationen af ​​kræftceller, der er involveret i kræft kolonisering og er ansvarlige for metastaser procession.

For nylig er blevet foreslået en model for kræft stamceller (CSCS) og bredt diskuteret [4]. Denne model er baseret på tidligere forskning, hvor en lille subpopulation af cancerceller isoleret fra den primære tumor, der er kendetegnet ved høj apoptose modstand, lang levetid og høj differentiering og klonal ekspansion kapacitet blev defineret som cancer stamceller [5]. Ifølge CSC-modellen, er alle tumorceller frigivet fra det primære sted formidles, men kun CSCS kan overleve og etablere kolonier på metastatiske steder. Flere undersøgelser har rapporteret, at CSCS deltager i metastase progression [4], [6]. Et antal cellemarkører, herunder CD133, CD166, og CD26, er blevet anvendt til at isolere CSC subpopulation inden colon-cancer-cellepopulationer [7], [8]. Blandt dem, prominin 1 (CD133) er et pentaspan transmembranprotein oprindeligt fundet i hæmatopoietiske stamceller i knoglemarven [9]. Nylige undersøgelser har rapporteret CD133 at være en potentiel biomarkør for metastase og dårlig prognose i kolon kræftpatienter [10] – [12]. I overensstemmelse, immunhistokemiske (IHC) farvning af tyktarmskræft væv har vist høj ekspression af CD133 at være korreleret med levermetastaser og lav overlevelsesrate [12], [13].

CD133-protein har vist sig at være mere rigelige i leveren metastaselæsioner sammenlignet med primære tyktarmskræft læsioner [14]. Ikke desto mindre er CD133 almindeligt anset en CSC markør i tyktarmskræft. Som det er blevet almindeligt observeret nedregulering af CD133 under tumorudvikling, er dets ekspression menes at blive reguleret under celledifferentiering [15]. I en mus xenograft eksperiment undersøger CD133-negative (CD133

-) og CD133-positive (CD133

+) subpopulationer af primær kolon kræftceller, kun CD133

+ delpopulation blev fundet i stand til at inducere tumordannelse [15] – [17]. Disse resultater, ud over den brede og effektiv anvendelse af CD133 som en biomarkør til isolering af stamceller i cancervæv [18], [19], indikerer, at en subpopulation af CD133

+ -celler virker som CSCS i metastase af tyktarmen kræft

Men flere kontroversielle fund er dukket op fra sammenligning af CD133

-. og CD133

+ subpopulationer i celle-linjer og primære kulturer af tyktarmskræft [20] – [23]. Selvom både CD133

– og CD133

+ subpopulationer af HCT-116 celler, en human colon cancer cellelinje, har vist sig at inducere tumorvækst i musemodeller [22], den CD133

– subpopulation af en human metastatisk coloncancer cellelinie LoVo, blev fundet mere resistente over for 5-fluorouracil behandling end CD133

+ subpopulationen [20]. Ligeledes Shmelkov et al. fandt en subpopulation af CD133

– coloncancer celler isoleret fra en lever metastatisk sted i et xenotransplantat musemodel at have en højere grad af tumorigenicitet end subpopulationen af ​​CD133

+ -celler [23]. Disse modstridende resultater kan ikke forklares af CSC-modellen, og at der eksisterer en alternativ mekanisme i metastaser procession.

SW620 er et humant colon-cancer cellelinje, der stammer fra en lymfeknude metastatisk site. Som det besidder både CD133

+ og CD133

– subpopulationer i en generel kultur tilstand (dvs. der opnås i en skål indeholdende en L15 medium og 10% FBS ved 37 ° C), kan SW620 tjene som en glimrende celle line model med at undersøge forskellene mellem CD133

+ og CD133

– subpopulationer inden celler afledt fra den samme genetiske baggrund. Ved hjælp af denne model, denne undersøgelse isoleret på CD133

+ og CD133

– subpopulationer i en SW620 cellelinje til at sammenligne deres tumorgenicitet, celle adfærd og spredning og vækst kapacitet både

in vitro

in vivo

. På baggrund af resultaterne, foreslås en hypotetisk model af kræft kolonisering i metastaser, der forklarer de kontroversielle resultater af de seneste undersøgelser.

Resultater

Den SW620 cellelinje består af 2 subpopulationer med høj og lav CD133 ekspression

Figur 1A viser, at SW620-cellelinien blev opdelt i 2 populationer, det SW620

CD133 + og SW620

CD133- subpopulationer, ifølge CD133-ekspressionsniveau, hvoraf SW620

CD133 + population besatte 75% af SW620-celler i en generel kultur tilstand. At isolere subpopulationer, fluorescerende cellesortering og analyse (FACS) blev udført, og efterfølgende bekræftet ved revers-transkription-polymerase-kædereaktion (RT-PCR) og western blot. De højt og dårligt udtrykte subpopulationer blev derefter identificeret ved at udføre analyser af CD133

høj og CD133

negative zone distribution (figur 1B). Resultaterne viste, at de SW620

CD133 + celler udtrykker mere CD133 mRNA og protein end SW620

CD133- celler (figur 1C og 1D), som udelukkede muligheden for alternativ splejsning eller translokation regulering [24]. Det er velkendt, at SW620 indeholder 2 distinkte morfologiske celletyper, en lille sfærisk (hvid pil, figur 1E, fig S1A og S1B) og en bipolar type (sort pil, figur 1E; pilespids, fig S1A og S1B) [25 ], hvis andel ikke væsentligt forskellige i SW620

CD133 + og SW620

CD133- subpopulationer.

CD133 ekspressionen af ​​SW620 celler blev analyseret, og cellerne blev sorteret ved FACS Canto og FACS Aria, henholdsvis. (A) Måling af CD133 ekspression ved flowcytometri afslørede, at 75% af cellerne var SW620

CD133 + -celler og 25% var SW620

CD133- celler (hvid top angiver farvning kontrol for muse-IgG). (B) Den øverste 5% af CD133 + subpopulationen (CD133

høj) og nederste 5% af CD133- delpopulation (CD133

negativ) blev indsamlet ved hjælp af FACS Aria. (C) Øverste panel viser RT-PCR resultater for CD133 mRNA. Nedre panel viser RT-PCR resultater for GAPDH mRNA anvendt som en kontrol til at udføre normalisering. (D) Øverste panel viser Western blot resultater for CD133 protein i alt celle lyserer. Nedre panel viser resultaterne for alfa tubulin anvendt som en loading kontrol. (E) SW620

CD133 + cellemorfologi under lysmikroskopi (20 ×). (F) SW620

CD133- cellemorfologi under lysmikroskopi (20 ×).

carboxyfluoresceindiacetat diacetat-succinimidyl ester (CFSE) farvning af FACS og MTT-analysen viste, at spredning evne mellem SW620 subpopulationer ligner i en generel kultur tilstand (fig S1c og S1D), mens MTT assay med taxol, cisplatin, actinomycin D og camptothecin behandling afslørede cellelevedygtigheden af ​​subpopulationer at være den samme (figur S2A til S2D). Disse resultater indikerer, at SW620

CD133 + og SW620

CD133- celler har nogen tilsyneladende morfologiske og fysiologiske forskelle i en generel kultur tilstand. Da disse resultater ikke kan forklare de forskellige niveauer af tumorigenicitet mellem de CD133 subpopulationer fundet i tidligere undersøgelser [23], foreslår de, at tilskyndelse af forskellige niveauer af tumorigenicitet kan tilskrives udsættelse for særlige miljøforhold.

SW620

CD133- celler udviser højere kapacitet kolonidannelse end SW620

CD133 + celler i en 3D Matrigel kultur

evne ekstravaserede tumorceller til at vokse på trods af øjeblikkelig udsættelse for microenvironmental stressfaktorer på metastatiske sted er afgørende for metastatiske celler at gå videre til tumor kolonisering [26]. Matrigel, et opløseligt basalmembran proteinekstrakt afledt af Engelbreth-Holm-Swarm muse sarkom, kan tjene som en

ex vivo

mikromiljø, hvor celler udsættes for 3D arkitektur, ECM interaktion, og vækstfaktorstimulering [27 ]. Som sådan har en 3D Matrigel dyrkningsmodel blevet bredt anvendt som en eksperimentel model til måling af tumorigenicitet [28] – [30]. Brug af denne model til at sammenligne kolonidannelse kapacitet SW620

CD133 + og SW620

CD133- celler, 500 SW620

CD133 + og SW620

CD133- celler blev podet på toppen af ​​en tyk Matrigel kultur. Kvantificering af synlige kolonier efter 3 ugers dyrkning afslørede, at SW620

CD133- celler, som havde dannet en middelværdi på 51,8 kolonier (SD = 3,8), havde en højere kolonidannelse kapacitet sammenlignet med SW620

CD133 + celler, som havde dannet en middelværdi på 10,3 kolonier. (SD = 2,2; figur 2A)

Oprenset SW620

CD133 + og SW620

CD133- celler blev podet på toppen af ​​Matrigel for yderligere analyse af celleproliferation og kolonisering. (A) Øverste panel viser hele og forstørrede billede for kolonier morfologi; nedre panel viser kolonier tæller efter 3 ugers inkubering. De SW620

CD133 + celler dannet et gennemsnit af 10 kolonier (SD = 2,2) og SW620

CD133- celler en middelværdi på 50 kolonier (SD = 3,8). Bar = 100 um. (B) celletal efter 3 dages inkubation.

celleproliferation i den tidlige fase blev yderligere undersøgt ved kvantificering af celletallet i hver klon. Når ca. 200 celler blev podet i en lav celletæthed på 3D Matrigel kultur og celleantallet af hver koloni blev talt én efter én under mikroskop efter 3 dages inkubation, og resultaterne viste, at SW620

CD133 + -celler var mindre proliferativ end SW620

CD133- celler (Figur 2B). Konkret kun en lille del af SW620

CD133 + celler (sorte bar) havde været i stand til at fuldføre 2 (celle nummer = 4, 3,4%) eller mere (celle nummer 4, 0,4%) runder af cellecyklus, og mest havde oplevet standset vækst, således at kun 22,5% divideret én gang at blive 2-celler og 67,7% undergik ikke nogen celledeling overhovedet. Den SW620

CD133- celler (grå bar) viste sig at være mere tolerante over for spredning hæmning som følge af eksponering til 3D Matrigel kultur, med 4,7 gange flere SW620

CD133- celler (18%) end SW620

CD133 + celler har været i stand til at fuldføre ≥ 2 runder af cellecyklus. Dette 4,7-fold forskel i stor koloni procentdel (n≥4) mellem de 2-celletyper svarer til 5-fold forskel i antallet af synlige koloni numre tidligere er blevet påpeget. Dette resultat indikerer, at forskellige niveauer af tolerance, specifikt højere SW620

CD133- celler, til spredning hæmning fra mikromiljø fører til forskellige niveauer af tumorigenicitet mellem SW620

CD133 + og SW620

CD133- celler, der giver SW620

CD133- celler med større kapacitet til at engagere sig i tumordannelse på tidlige metastatiske steder.

SW620

CD133- celler har et højere niveau af tumorigenicitet end SW620

CD133 + i en nøgen musemodel

in vivo

tumorgenicitet af SW620

CD133 + og SW620

CD133- celler blev undersøgt i en nøgen (nu /nu) musemodel. Efter podning af 10

5 celler i en subkutan region, tumorstørrelse blev målt hver 3. dag i 4 uger. Den sygdomsfri overlevelse sats er vist i figur 3A. Begge celletyper var i stand til at generere tumorvæv efter 4 ugers podning. Selvom hematoxylin og eosin (H 2 mm (åben cirkel), mens kun 11% af musene inokuleret med SW620

CD133 + celler havde gjort det (udfyldt cirkel). Desuden er den gennemsnitlige diameter af tumorerne, der havde udviklet efter SW620

CD133- podning var 1,9 gange større end den efter SW620

CD133 + inokulering (figur 3B og 3C). Disse resultater, som bekræfter, at SW620

CD133- celler har større tumorigenicitet end SW620

CD133 + celler og overenskomst med de opnåede resultater ved brug af

ex vivo

eksperimentel model, giver den første celle-line dokumentation for, at den CD133

– delpopulation har større potentiale for at initiere tumor progression ved metastatiske steder [23]

Renset SW620

CD133 + og SW620

CD133- celler blev injiceret subkutant i nøgne mus.. (A) Fyldt og ubesatte cirkler refererer til sygdomsfri overlevelse sats af SW620

CD133 + og SW620

CD133- celler, henholdsvis N = 11. (B) Øverste fotografi viser tumordannelse grund SW620

CD133 + celle podning på venstre side og på grund af SW620

CD133- celle podning på højre side. Lavere fotografi viser størrelser af SW620

CD133 + og SW620

CD133- tumorer. (C) Figur der viser de gennemsnitlige diametre af SW620

CD133 + (3,8 mm, SD = 2,1) og SW620

CD133- (8,1 mm, SD = 2,6) tumorer, N = 11, P = 0,0006.

Cell-typen skift mellem SW620

CD133- og SW620

CD133 + subpopulationer induceres ved microenvironmental stimulation

Selvom tilskyndelse af CD133 opregulering ved udsættelse for visse stressorer og former for miljø- stimulering blev observeret i flere tidligere

in vitro

celle eksperimenter [31] – [33], skift af CD133

– delpopulation til CD133

+ delpopulation af hjernesvulst primære dyrkede celler blev observeret i en nylig

in vivo

eksperiment [34]. Tilsvarende switching blev observeret i NANK cellelinien, en primær coloncancer linje. Selvom NANK er en CD133

-. Cellelinie isoleret fra æggestokkene metastatisk tyktarmskræft væv blev CD133

+ celler fundet i en NANK-induceret tumor [21]

I overensstemmelse med disse resultater, skifte mellem SW620

CD133- og SW620

CD133 + celler i en skæv måde, blev observeret i den generelle dyrkningsbetingelser i denne undersøgelse. Specifikt 16,7% af oprenset SW620

CD133- celler skiftede til SW620

CD133 + celler (figur 4, hvid bjælke i højre panel), mens kun 4,7% af SW620

CD133 + celler skiftede til SW620

CD133- celler (hvide bar i venstre panel, figur 4). Dette 3,6-fold forskel i at skifte kapaciteten mellem SW620

CD133- og SW620

CD133 + celler kan forklare den større andel af SW620

CD133 + sammenlignet med SW620

CD133- celler (3:1) i den generelle dyrkningsbetingelser (figur 1). Denne forklaring understøttes af resultaterne af MTT-assayet, som afslørede, at de 2 populationer har en lignende proliferationshastighed, og således udelukket muligheden for konkurrence vækst.

Venstre panel viser SW620

CD133 + -celler og højre panel viser SW620

CD133- celler. Detail beskrivelser blev vist i resultatet.

Undersøgelse af tumorcellerne isolerede løbet af de foregående xenograft eksperimenter (figur 3A) bekræftede disse resultater. Henviser 90,3% af tumorcellerne, der havde prolifereret fra SW620

CD133- celler senere skiftede til SW620

CD133 + celler, kun 4,8% af SW620

CD133 + celler skiftede til SW620

CD133- celler (figur 4, diagonal bar). Disse resultater antyder, at celle-typeskift kan moduleres ved stimulation fra

in vivo

mikromiljø. For at teste denne hypotese, virkningen af ​​eksponering for hypoxi, en celle-vedhæftning-frit miljø, og ECM stimulering, 3 potentielle former for stress i

in vivo

mikromiljø blev undersøgt. At etablere en hypoxisk tilstand, blev oxygenkoncentrationen i dyrkningskammeret reguleret til 1% ved anvendelse af PROOX 110 instrument, og temperaturen holdes ved 37 ° C. Henviser eksponering for hypoxi signifikant forøget kobling af SW620

CD133- celler til SW620

CD133 + celler, specielt fra 16,7% til 40% (p = 0,0064), det resulterede ikke i nogen signifikant ændring i hvilket omfang SW620

CD133 + celler skiftede til SW620

CD133- celler (p = 0,13) efter 4 ugers kultur i hypoxi tilstand.

for at teste eksponering til en celle-vedhæftning-fri tilstand ved hjælp af et 3D-kultur-system, celler blev påsat Algimatrix, en kunstig bio-stillads materiale uden en ECM komponent. Celler blev dyrket ved lav densitet (10

5 per brønd) for at forhindre celle-celle-kontakt. Efter 2 ugers dyrkning blev celler isoleret fra gelen og CD133 ekspressionen blev målt ved FACS. Henviser eksponering for en celle-adhæsion-frit miljø signifikant øget omskiftningen af ​​SW620

CD133- celler til SW620

CD133 +, specifikt fra 16,7% til 64,5% (p 0,001), det resulterede ikke i nogen væsentlig ændring i hvilket omfang SW620

CD133 + celler skiftet til SW620

CD133- celler (p = 0,57). For at undersøge virkningen af ​​ECM-stimulering, blev celledyrkning udført i en Matrigel-coated plade. Skønt udsættelse for ECM stimulation signifikant hæmmet CD133 ekspression i begge celletyper, det havde en variabel virkning på omfanget af celletype-switching. Det faldt omskiftning af SW620

CD133- celler til SW620

CD133 + celler fra 16,7% til 5% (sort bjælke i højre panel, s 0,001) i en Matrigel-coatede plade og til 13% i et 3D Matrigel kultur (figur 4, højre panel, vandret fyldt bar, p = 0,19), steg kobling af SW620

CD133 + celle gruppe fra 5% til 11% i en Matrigel-coatede plade (p = 0,055) og til 27% i en 3D Matrigel kultur (figur 4, venstre panel, vandret fyldt bar, p = 0,023).

Test af udsættelse for de 3 former for miljøbelastninger afsløret eksistensen af ​​en betydelig regulering af CD133 skift i svar på en sådan engagementer, med eksponering for hypoxi og en celle-vedhæftning miljø uden væsentlig fremme skift af SW620

CD133- celler til SW620

CD133 + celler, mens udsættelse for ECM stimulation væsentligt fremme skift af SW620

CD133 + celler til SW620

CD133- celler. Disse resultater tyder på, at reguleringen af ​​SW620

CD133- og SW620

CD133 + subpopulationer i en

in vivo

miljø moduleres ved udsættelse for flere faktorer, der virker synergistisk på cellerne, og at celle-typen switching mellem subpopulationer kan være nødvendig for tilpasning til mikromiljø i begyndelsen tumor kolonisering.

diskussion

det er blevet bredt diskuteret at CSCS spiller en central rolle i metastase progression [7], [35]. Af de flere cellemarkører, herunder CD133, CD144, og CD166, der har været anvendt til at identificere CSCS, har en række uafhængige undersøgelser vist, at CD133

+ underpopulation af kolon kræftceller besidder højere niveauer af stemness og tumorigenicitet at CD133

– delpopulation. To uafhængige undersøgelser, der isolerede CD133

+ og CD133

– subpopulationer fra kolon tumorceller og transplanteret dem i NOD /SCID-mus viste, at kun CD133

+ celler kan initiere tumordannelse [15], [17]. En undersøgelse under anvendelse af en xenograftmodel fandt, at CD133

+ subpopulation af colon-tumorceller også vise multi-slægt differentiering kapacitet og en høj grad af tumorigenicitet [16].

Men 2 nylige undersøgelser vist, at den CD133

– delpopulation af metastatiske kolon kræftceller i lever og ovariecancer også initiere tumordannelse, og i sidste ende fremkalde større tumorvækst end CD133

+ delpopulation [21], [23]. De modstridende disse forskellige resultater kan skyldes anvendelsen af ​​forsøgsmodeller afledt af forskellige genetiske baggrunde. Den coloncancercellelinie model giver en konventionel og reproducerbar eksperimentel model, hvor sammenligning af de 2 CD133 subpopulationer. Af de 2 cellelinjer, der anvendes som eksperimentelle modeller for tyktarmskræft, der kan opdeles i CD133

+ og CD133

– subpopulationer [32], den HCT116 cellelinie, som blev etableret primært fra colon tumorer, har en mindre ( 5%) CD133

– delpopulation end SW620 cellelinje. I overensstemmelse med tidligere sammenligninger af cellernes levedygtighed og tumorgenicitet mellem HCT116

CD133- og HCT116

CD133 + celler ved MTT assay og xenograft eksperimenter, HCT116

CD133- og HCT116

CD133 + celler har vist sig at have lignende niveauer af levedygtighed og tumorgenicitet [22].

i den foreliggende undersøgelse, at SW620

CD133- og SW620

CD133 + subpopulationer viste sig at have en lignende morfologi, spredning sats, og lægemiddelrespons i en generel kultur tilstand. Imidlertid SW620

CD133- celler udviste signifikant større vækst i en 3D Matrigel kultur og i muse xenograft eksperimenter. Disse resultater giver de første beviser, at CD133

– kolon celler har større tumorigenicitet end CD133

+ kolon celler i eksperimentelle modeller med samme genetiske baggrund, hvilket tyder på, at visse miljømæssige faktorer kan fremkalde forskellige vækstrater. Desværre, udsættelse for en form for stress, såsom hypoxi eller ECM stimulation, alene, viste sig ikke at påvirke proliferationshastighed (fig S4A), hvilket indikerer, at inhibering kan induceres af en kompleks mekanisme for regulering og /eller en række faktorer der virker synergistisk i mikromiljøet. Eksistensen af ​​en så kompleks mekanisme stadig mangler at blive undersøgt

Skift mellem CD133

+ og CD133

-. Er blevet observeret subpopulationer i mange typer af tumorceller [36] – [38]. Det er velkendt, at CD133

+ CSCS skifter til CD133

– celler under differentiering [16], og at en sådan skift er ensrettet og irreversibel. I kemisk induceret differentiering model, har natriumbutyrat behandling af de humane coloncancer-cellelinjer HT-29 og HCT116 vist sig at inducere CD133 nedregulering og epitheldifferentiering [39]. Adskillige tumor undersøgelser har fundet, at omskiftningen af ​​CD133

– celler til CD133

+ -celler kan induceres ved udsættelse for vækstfaktor og miljømæssige stressfaktorer. Specifikt eksponering for TGF-beta1 har vist sig at udløse CD133 opregulering i Huh7 og A549 hepatocellulært carcinom og lungekræft cellelinier og øge celle tumorigenicitet i en nøgen musemodel [33], [36]. Mens eksponering for hypoxi har vist sig at inducere CD133 ekspression i lunge og pancreas cancerceller, disse transformerede CD133

+ tumorceller få mere stemness og malignitet [31], [40]. Hypoxi induceret CD133 ekspression i hjernetumor korrelerer også med højere tumor aggressivitet [41].

I en xenograft model af metastatisk colon tumor, blev CD133

+ -celler detekteret i en tumor genereret fra oprenset CD133

– celler [21], hvilket antyder, at celle-typeskift også kan forekomme i colon cancerceller. Resultaterne af denne undersøgelse viser klart, at der findes tovejs skift mellem SW620

CD133 + og SW620

CD133- subpopulationer, og at en sådan kobling kan moduleres ved udsættelse for forskellige stressfaktorer. Konkret blev fundet eksponering til enten en Matrigel-belagt plade eller en 3D-Matrigel kultur væsentligt fremkalde skift af SW620

CD133 + til SW620

CD133- celler, hvor sidstnævnte har vist sig at udvise større vækst i

ex vivo

og

in vivo

modeller. I pilotundersøgelser, at eksponering Type I og IV kollagen og laminin, de 3 store ECM komponenter, blev observeret at fremkalde hæmning af CD133 udtryk for en lignende grad (data ikke vist). I modsætning hertil fandtes eksponering for hypoxi eller en celle-adhæsion-fri tilstand for at fremme kobling af SW620

CD133- celler i den foreliggende undersøgelse. Dette resultat blev også observeret ved hjælp af hånd-drop kultur-system, der giver eksponering til en celle-vedhæftning-frit miljø, hvor SW620

CD133 + celler blev fundet i SW620

CD133 – formgivning sfærer, hvilket tyder på, at de spiller en rolle som drivkraft tumorigenese [32]

i den konventionelle model for metastaser progression, både CD133

+ og CD133

-. kræftceller frigives til blodbanen, når metastaser påbegyndes [42], men kun CD133

+ celler er i stand til at overleve og initialisere tumor kolonisering (figur 5, øvre panel). Imidlertid har flere undersøgelser af colon cancer cellelinjer rapporteret, at både CD133

+ og CD133

– celler kan initialisere tumordannelse [21] – [23]. Den foreliggende undersøgelse, som observeret dette fænomen i SW620 cellelinie, fandt også, at tyktarmskræft celler kan engagere sig i celle-typen skift mellem SW620

CD133- og SW620

CD133 + subpopulationer som reaktion på microenvironmental stress. Baseret på disse observationer, en alternativ hypotetisk model for tyktarmskræft kolonisering ved metastase site, som er illustreret i figur 5, foreslås her. I den tidlige metastatisk fase, kræftceller migrere ind i metastatiske websted og begynde at kolonisere. I denne fase, er cellerne direkte udsat for mange former for miljøbelastning og stimulering, blandt hvilke ECM stimulation fremmer omskiftningen af ​​CD133

+ til CD133

– celler, hvor sidstnævnte har en vækst fordel på grund af deres større modstand mod spredning inhibering fra mikromiljøet. Efter tumor kolonisering er blevet etableret, og tumorcellerne er organiseret i en fast tumor, andre former for miljø stress, herunder eksponering for hypoxi og en celle-vedhæftning-frit miljø, fremme koblingen af ​​CD133

– til CD133

+ celler, som, fordi sidstnævnte type er fundet at have større stemness og malignitet i tyktarm og andre former for kræft [36], [43], kan øge senere tumorvækst.

øverste panel viser konventionel CSC model, hvor kun CD133

+ coloncancerceller kolonisere på den metastatiske websted før differentiere til CD133

– celler under tumorvækst. Lavere panel viser den hypotetiske model, hvor både CD133

+ og CD133

– celler kolonisere på metastatisk sted, og hvor CD133

– celler har større kolonisering kapacitet. Mens ECM stimulering fremmer omskiftning af CD133

+ celler til CD133

– celler i den tidlige fase af kolonisering, udsættelse for hypoxi og 3D arkitektur efter kolonisering inducerer omskiftning af CD133

– celler til CD133

+ celler .

Denne hypotetiske model forklarer de modstridende resultater fra tidligere undersøgelser af CD133

+ og CD133

– tyktarmskræft celler. Selvom CD133 er kendt som en stamcelle markør, resultaterne af tidligere undersøgelser, såvel som den foreliggende undersøgelse, viser, at både CD133

+ og CD133

– celler kan generere tumorvækst, hvilket tyder på, at CD133 måske ikke en absolut biomarkør for cancer stamceller i tyktarmskræft.