PLoS ONE: Differentieret Ansættelse af Th17 celler til livmoderhalskræft via CCR6-CCL20 Pathway

Abstrakt

Vores tidligere undersøgelser tyder på, at Th17 celler ophobes i tumorvæv og korrelerer med gentagelse af livmoderhalskræft kræftpatienter. Dog forbliver kilden til de øgede tumorinfiltrerende Th17 celler dårligt forstået. Vi undersøgte forekomsten, fænotype og handel ejendom af Th17 celler hos patienter med livmoderhalskræft. Vores resultater viste, at Th17 celler stærkt aggregeret inden tumorvæv i en aktiveret fænotype med markant øget ekspression af CCR6. Tilsvarende niveau af CCL20 i tumorvæv var betydeligt højere end i ikke-tumor og normale kontrol væv, og stærkt positivt associeret med Th17 celler. Endvidere viste in vitro migration assay CCL20 havde effektiv kemotaksi til cirkulerende Th17 celler. Afslutningsvis er Th17 celler rekrutteret til tumorvæv fortrinsvis gennem CCR6-CCL20 vej, der kan tjene som en ny terapeutisk mål for livmoderhalskræft

Henvisning:. Yu Q, Lou Xm, han Y (2015) Differentieret Rekruttering af Th17 Celler til livmoderhalskræft via CCR6-CCL20 Pathway. PLoS ONE 10 (3): e0120855. doi: 10,1371 /journal.pone.0120855

Academic Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, SPANIEN

Modtaget: 15 oktober, 2014 Accepteret: 27 Januar 2015; Udgivet: 13 Mar 2015

Copyright: © 2015 Yu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Livmoderhalskræft er den anden mest almindelige kræftform hos kvinder på verdensplan [1]. Der er stigende tegn på, at CD4

+ T-hjælper (Th) celler spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af ​​immunreaktioner mod kræft [2, 3]. Th17 celler er en hidtil ukendt delmængde af interleukin IL-17-producerende CD4

+ T-celler [4], som er blevet vist at spille en afgørende rolle i inflammation og autoimmune sygdomme [5-7], mens også akkumulere i tumorer, såsom hepatocellulært carcinom [8], mavekræft [9], lungecancer [10], og esophageal carcinoma [11]. Vores tidligere undersøgelse viste også øget antal Th17 celler i tumorvæv af livmoderhalskræft og deres uafhængig forening med tilbagefald efter operation [12]. Disse undersøgelser antyder, at Th17 celler kan bidrage til immunopatogenese af mange typer af cancere.

Før T-celler kan udøve deres virkning på cancercelle, de skal nå målstedet. Migrationen af ​​T-celler til målområdet er en multi-trins procedure, i hvilken signaler fra chemokiner /kemokinreceptorer spiller en kritisk rolle [13]. Forskellige CD4

+ T-cellepopulationer hos mennesker og mus viser forskellige mønstre af kemokinreceptor-ekspression. I tumor mikromiljø, Th1 celler udtrykker CCR5 og CXCR1, Th2 celler udtrykker CCR4 og CCR8, mens regulatoriske T-celler hovedsageligt udtrykker CCR4 [14]. Nylige undersøgelser tyder på, at Th17 celler udtrykker CCR2, CCR4, og CCR6 i voksent menneske perifere blod [15, 16]. Men den vandrende determinanter for Th17-celle migration i tumorvæv af livmoderhalskræft kræftpatienter fortsat ukendt. I denne undersøgelse fandt vi, at de CCR6-CCL20 akse hovedsageligt bestemmer migrering af cirkulerende Th17 celler i tumorvæv i livmoderhalskræft kræftpatienter.

Patienter og metoder

Etik Statement

studie-protokol blev godkendt af Institutional Review Board of Hangzhou Obstetrik og Gynækologi Hospital. Informeret skriftligt samtykke blev opnået fra patienter i henhold til Helsinki-deklarationen.

Emner

I alt 35 patienter med livmoderhalskræft, som gennemgik kirurgisk resektion ved det første Folkets Hospital of Hangzhou mellem 2012 og 2013, blev indrulleret i denne undersøgelse. Matched perifert blod (PB), tumorer, og tilsvarende ikke-tumorvæv blev opnået fra disse patienter. Ingen af ​​patienterne modtog anticancerterapi eller andre medicinske indgreb. De patientkarakteristika (som det bemærkes i S1 tabel).

Isolering af PBMC, TIL, og NIL Salg

Perifere mononukleære blodceller (PBMC) blev isoleret ved Ficoll-Hypaque (Sigma-Aldrich , St. Louis, MO) densitetsgradient separation. Tumor-lymfocytter (TIL) og ikke-tumor-infiltrerende lymfocytter (NIL) blev isoleret som beskrevet af Pang og hans kollega [17]. Kort beskrevet blev vævet skåret i små stykker og inkuberet i en enzymblanding indeholdende 0,05% collagenase IV (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 0,001% DNase I (Sigma-Aldrich) i 1 time. Dissocierede væv blev derefter formalet gennem en 70-um si, og mononukleære celler blev opnået ved densitetsgradientcentrifugering separation anvendelse af Ficoll-Hypaque.

Flowcytometri

PBMC, TIL og NIL blev farvet med fluorochrome- konjugerede monoklonale antistoffer mod human CD3, CD4, CD45RO, HLA-DR, CCR2, CCR4, CCR6, CD11a, CD49d, CD103, PD-1, Granzyme B, og IL-17 (BD PharMingen, San Diego, CA). Celler blev stimuleret til at udskille cytokiner i 4 timer med 100 ng /ml phorbolmyristatacetat (PMA), 1 ug /ml ionomycin (Sigma-Aldrich) og 2 pM monensin (Enzo, Plymouth, PA). Til intracellulær farvning blev cellerne permeabiliseret og fikseret ved anvendelse Cytofix /Cytoperm (BD PharMingen) ifølge producentens instruktioner. Efter farvning blev tre- eller fire-farve flowcytometri udført under anvendelse LSR II flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA), og data blev analyseret under anvendelse Flowjo software (Tree Star, Inc., Ashland, OR).

immunhistokemisk farvning

Paraffin-embedded, formalin-fikseret levervæv blev skåret i 4-um sektioner. Antigen-genvinding prædannedes via trykkogning i 10 minutter i citratpuffer (pH 6,0). Antistoffer af muse-anti-humant foxp3 (fortynding 1: 200; Abcam, Cambridge, UK) og kanin-anti-humant IL-17 (fortynding 1: 150; R CCL17: CCA GGG ATG CCA TCG TTT (fremad), GGT GGA GGT CCC AGG TAG TC (tilbage); CCL20: GAC ATA GCC CAA GAA CAG AAA (fremad), GAC AAG TCC AGT GAG GCA CAA (tilbage); og CCL22: GGA GGC AAA GAG TAG GGT GTA AT (frem), TCA GCC AGA AAG GCA TAG ATA GA (tilbage). Prøver blev kørt i tre eksemplarer, og deres relative udtryk blev beregnet i følgende formel ved hjælp GAPDH som endogene kontrol:. 2

-ΔΔCt

kemotaksiassay

Migration analyser blev udført på PBMC hjælp Transwell system som tidligere beskrevet [18]. PBMC (1 × 10

6) i et volumen på 200 pi blev tilsat til de øverste brønde (insert porestørrelse, 5 um; Millipore, Billerica, MA). Humane kemokiner (CCL20, CCL21 og CCL22, 100 ng /ml af hver, alt fra R 0.05.

Resultater

Fordeling af Th17 celler hos patienter med livmoderhalskræft

For at undersøge fordelingen af ​​Th17 celler på tumor, NIL og TIL blev isoleret fra parret nontumor og tumorvæv i 35 patienter med cervikal cancer og karakteriseret via flowcytometri (fig. 1A). Som forventet, hyppigheden af ​​Th17 celler i tumorvæv, der repræsenterer 11,49 ± 1,19% af CD4

+ T-celler, var signifikant højere end i ikke-tumorvæv (3,68 ± 0,48%,

P

0,01) og raske donorer (1,67 ± 0,19%,

P

0,001; fig . 1B). Derudover var andelen af ​​cirkulerende Th17 celler var også højere hos patienter med livmoderhalskræft sammenlignet med raske donorer (

P

0,001). Immunohistokemisk farvning observeret også betydelige Th17 celler i tumorvæv af cervixcancer endnu højere end regulatoriske T-celler (tregs) i de samme omgivelser (fig. 1C). Disse resultater tilsammen antyder, at Th17 celler stærkt beriget i patienter med cervikal cancer, især i tumorvæv.

Th17 celler blev gated fra CD3

+ T-celler ved flowcytometri. (A) repræsentant IL-17 ekspressionsprofiler i CD4

+ T-celler fra de fire undersøgte grupper. Procenterne repræsenterer frekvensen af ​​Th17 celler blandt CD4

+ T-celler. (B) Statistisk analyse viser, at frekvensen af ​​Th17 celler var højere hos patienter med cervikal cancer, især blandt tumorinfiltrerende lymfocytter (n = 35). **

P

0,01, ***

P

0,001. (C) Repræsentative billeder for Th17 celler (IL-17

+) og tregs (foxp3

+) infiltration i livmoderhalskræft væv fra den samme patient. Immunofarvede celler (Brown, angivet med sort pil) og tumorceller (blå). Forstørrelse, × 100.

Desuden forekomsten af ​​Th17 celler var højere i avanceret stadie tumorer end i fase tumorer tidligt (8,12 ± 1,31% i FIGO I vs. 14,18 ± 2,78% i FIGO II vs 15.50 ± 1,73 i FIGO III. figur 2). Men der var ingen signifikante forskelle i forekomsten af ​​Th17 celler til alder, HPV-status, tumorstørrelse, infiltration dybde, lymfeknude status, lymfe-vaskulære rum invasion og tumor differentiering (fig. 2).

Sammenligning af frekvensen af ​​tumorinfiltrerende Th17 celler i cervikale cancerpatienter i forskellig alder, HPV-status, tumorstørrelse FIGO stage, infiltration dybde, lymfeknude status, lymfe-vaskulære rum invasion (LVSI) og tumor differentiering. Statistisk analyse viste frekvensen af ​​Th17 celler i tumorvæv blev forøget fra FIGO I til FIGO III, men ikke forbundet med de øvrige kliniske parametre. *

P

0.05.

fænotypiske karakteristika af tumor-infiltrerende Th17 celler

Vi analyserede derefter udtryk for markører relateret til aktivering /effektorfunktion (CD45RO og HLA-DR) og immunsuppression (granzym B og PD -1). Tumorinfiltrerende Th17 celler udtrykte høje CD45RO, HLA-DR, men lav granzym B og PD-1 (fig. 3A). Granzyme-B-cytolyse [20] og B7-H1 /PD-1-vejen [21] bidrager til immunsuppression i tumormikromiljøet. Disse resultater indikerede, at tumor-infiltrerende Th17 celler udviste en aktiveret hukommelse fænotype (CD45RO

+ HLA-DR

+), men kan ikke mediere effektorfunktion gennem granzym B eller B7-H1 /PD-1-vejen (Granzyme B

– /PD-1

-.)

(A) Repræsentative udtryk profiler af CD45RO, HLA-DR, Granzyme B og PD-1 i tumor-infiltrerende Th17 celler. Procenterne repræsenterer frekvensen af ​​forskellige markører i Th17 celler. (B) Repræsentative udtryk profiler af CCR4, CCR6 og CD49d på Th17 celler fra perifert blod (lang punkteret linje), ikke-tumor (stiplet linie) og tumorvæv (optrukket linje). Procenterne repræsenterer frekvensen af ​​forskellige markører på tumor-infiltrerende Th17 celler. (C) Statistisk analyse af overfladeekspression af CCR4, CCR6, CD49d på Th17 celler fra perifert blod, ikke-tumor og tumorvæv (n = 25). *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001.

lymfocytmigration sker gennem en flertrinsproces, hvor chemokin /kemokinreceptor signalering er en vigtig begivenhed, efterfulgt af integrin-medieret adhæsion til karvægge [13]. Derfor vi yderligere analyseret overfladen udtryk for kemokinreceptorer (CCR2, CCR4 og CCR6) og integriner (CD49d, CD11a og CD103) på Th17 celler. Tumor-infiltrerende Th17 celler udtrykte høje niveauer af CCR4 (cPBMC: 38,83 ± 3,90%, NIL: 42,76 ± 2,84%, TIL: 57,61 ± 2,99%;

P

0,001 og 0,01 til TIL vs. cPBMC og vs NIL, henholdsvis), CCR6 (cPBMC: 22,17 ± 2,04%, NIL: 42,89 ± 3,23%, tIL: 72,97 ± 2,45%,

P

0,001 for tIL vs cPBMC og vs. NIL), og CD49d (cPBMC: 63,13 ± 3,74%, NIL: 56,59 ± 3,10%, tIL: 74,24 ± 2,69%,

P

0,05 og 0,001 for tIL vs cPBMC og vs NIL henholdsvis) (fig. 3B og 3C), men ikke CCR2, CD103, og CD11a (data ikke vist). De udtrykte målsøgende molekyler kan være forbundet med Th17-celle migration og fastholdelse inden tumor [22].

Sammenslutninger af kemokinniveauer med intratumorale Th17 celler

Fordi Th17 celler overudtrykt CCR6 og CCR4, vi hypotese, at Th17 celler kunne migrere som respons på CCL20, CCL22 og CCL17. Vi bestemt udtryk for CCL20, CCL22 og CCL17 ved real-time PCR. Vi fandt signifikant højere mRNA udtryk for CCL20 i tumorvæv sammenlignet med ikke-tumorvæv og normale kontrol væv (

P

. 0,01, figur 4A). Endvidere blev der observeret en stærkt positiv sammenhæng mellem forekomsten af ​​Th17 celler og intratumoral udtryk for CCL20 (R = 0,795,

P

0,001;. Figur 4C). Disse data antydede, at CCL20 er et vigtigt signal at mægle handel med Th17 celler til tumorer. Tværtimod, vi ikke fundet forøget ekspression af CCL17 og CCL20, de to specifikke ligander af CCR4, i tumorvæv (fig. 4A). Endvidere regressionsanalyse kun fundet svag korrelation af Th17 celler med CCL22 (R = 0,385,

P

0,05;. Figur 4D), men ikke med CCL17 (

P

0,05, fig. 4B), i samme tumormikromiljøet. Resultaterne kollektivt indikerer, at CCR4-CCL17 /CCL22 akse kan ikke være hovedansvarlig for Th17-celle migration.

(A) Real-time PCR af chemokin CCL17, CCL20 og CCL22 i tumor (T) og ikke- tumor (nT) regioner af patienter med cervikal cancer og i normal kontrol (NC). Værdien blev normaliseret til GAPDH, ganget med 10

5, og log forvandlet. *

P

0,05, **

P

0,01. (B, C, D) Korrelationer af chemokin CCL17 (B), CCL20 (C) og CCL22 (D) med hyppigheden af ​​tumorinfiltrerende Th17 celler. Statistisk analyse viste en stærk korrelation af CCL20 med Th17 celler i tumor.

kemokinvirkningerne på Th17 celle rekruttering

Væsentlige kemotaktiske respons af cirkulerende Th17 celler til rekombinant human CCL20 blev observeret i dosis -afhængig måde (fig. 5A). Endvidere har en neutraliserende monoklonalt antistof til CCL20 markant blokerede CCL20-induceret migrering af Th17 celler (

P

. 0,001, figur 5A). Selvom CCL17 og CCL22 også kan fremkalde migration af Th17 celler, deres virkning var betydeligt svagere end CCL20 gjorde (migration indeks i koncentration på 100 ng /ml: CCL20, 45,5 ± 10,6 vs. CCL17, 19,1 ± 6,5 og vs. CCL22, 26,1 ± 7,9, begge

P

0,001;. figur 5A). For yderligere at bestemme, om tumor-udskilte kemokiner havde en effekt på Th17 celle rekruttering, kemotaksiassay hjælp dyrkningssupernatanter fra cervikale cellelinjer blev udført. HeLa-cellerne er HPV-18-inficerede cervikale celler, Siha-celler er HPV-16-inficerede cervikale celler, og C-33A-celler er HPV negative cervical cancerceller. Alle tre cervikale celler kan stærkt udskiller CCL20 med højeste CCL20 ved HeLa-celler (fig. 5b og 5c), og inducerede betydelig migration af Th17 celler (fig. 5D). Dette kan effektivt blokeret af antistof mod CCL20 alene eller i kombination med CCL17 og CCL22 (

P

0,001), men signifikant mindre effektivt af antistof mod CCL17 eller CCL22 (Fig 5B.). Disse resultater tilsammen indikerer, at CCL20 kan inducere effektiv vandring af Th17 celler i tumorvæv.

Migration assays blev udført i et Transwell system. (A) Th17 celler migrerer som respons på rekombinant human CCL17, CCL20 og CCL22 i dosisafhængig måde (n = 5). Specifikke antistoffer til kemokiner signifikant hæmmer Th17 cellemigration ***

P

0,001. (B og C) Ekspression af CCL20 af HeLa, Siha, og C-33A-celler påvist under anvendelse realtid Kina (B) og ELISA (C). Alle de tre cervikale celler kunne meget udskiller CCL20 med højeste CCL20 af HeLa-celler. (D) Th17 celler migrerer også mod kultursupernatanter af HeLa, Siha, og C-33A-celler, som effektivt kan blokeres af antistof mod CCL20 alene eller i kombination med CCL17 og CCL22, men signifikant mindre effektivt af antistof mod CCL17 eller CCL22 ( n = 3). *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001.

Diskussion

Som rapporteret i andre solide tumorer [8, 10, 11, 19, 23-25], viste denne undersøgelse, at betydelige Th17 celler, viser en aktiveret hukommelse fænotype, er koncentreret inden for livmoderhalskræft væv. Men den rolle Th17 celler i immunitet kræft forbliver blandet. Akkumulere data viser, at selv om kræftpatienter udviser en generaliseret immunosuppressiv status, kan den inflammatoriske reaktion ved tumorstedet fremmer tumorvækst og progression. Fortsættelse af kronisk inflammation er i vid udstrækning opnås gennem positiv feedback loops, der indbefatter inflammatoriske celler, der producerer cytokiner, der inducerer chemokin syntese i maligne og stromaceller fører til langvarig rekrutteringen af ​​inflammatoriske celler i tumoren mikromiljø [26]. Th17 celler er en af ​​de mest kritiske immuncelleundergrupper i denne henseende og har således tumor-fremmende virkning. Hos patienter med hepatocellulær carcinom, colorektal cancer eller esophageal carcinoma, blev fundet høje niveauer af intratumorale Th17 celler til at være positivt associeret med dårlig prognose [8, 24, 27]. På den anden side, Th17 celler undertiden kan give vigtig hjælp til at sætte skub i cytotoksisk immunitet og dermed udøve tumor-undertrykkende virkninger [28, 29]. Vores tidligere undersøgelse har vist, at høje intratumorale Th17 celler forudser nedsat lokalt recidiv hos patienter med livmoderhalskræft [12], i overensstemmelse med tidligere rapporter i ovariecancer [25] og melanom [30].

Kilderne til Th17 celler i livmoderhalskræft væv kan omfatte handel med cirkulerende Th17 celler til tumorer og lokalt inducerede Th17 celler. Migreringen af ​​T-celler er stramt reguleret af chemokin /chemokin receptor-interaktionen [31]. Tidligere undersøgelser har vist, at rekruttering af Th17 celler styres af flere veje, herunder CCR2-CCL2, CCR4-CCL17 /CCL22, og CCR6-CCL20 [15, 16, 19, 32]. I den forbindelse fandt vi handel med cirkulerende Th17 celler i tumorvæv af livmoderhalskræft var fortrinsvis gennem CCR6-CCL20 vej. Denne konklusion er baseret på to resultater. Første, CCL20 havde markant forhøjet ekspression i tumorvæv og stærkt forbundet med forekomsten af ​​Th17 celler i samme mikromiljø. For det andet, det cirkulerende Th17 fra patienter med cervical cancer højt udtrykt CCR6, og selektivt migrere som respons på CCL20 in vitro. I fortiden, var CCR6 primært impliceret at være ansvarlig for den inflammatoriske rekruttering af Th17 celler. Fox eksempel CCR6 er afgørende for optimal rekruttering af Th17 celler til steder med Th17-medieret inflammation i eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) [7]. Men akkumulerende seneste resultater viser, at den CCR6 på Th17 celler også spiller en kritisk rolle i tumor udvikling [8, 24]. Det er godt accepteret, at virkningen af ​​immunceller på tumorudvikling bestemmes ved ikke kun deres pro- eller anti-potentiale, men også passende lokalisering [33]. Alle disse resultater, sammen med vores data, viser Th17 celle-udtrykt CCR6 er funktionel og spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​cervikal cancer. Desuden, selvom CCR4 også kan være relateret til Th17 cellevandring, effekten er meget svagere end CCR6 ifølge mindre ekspression af CCR4, lavere intratumorale niveauer af CCL17 og CCL22, og svagere chemotacitc reaktioner på CCL17 og CCL22.

Afslutningsvis viste vi her at CCR6-CCL20 vej er fortrinsret kemoattraktant for handel med cirkulerende Th17 celler i tumorvæv af livmoderhalskræft. Resultaterne udvide vores forståelse af mekanismen for livmoderhalskræft carcinogenese, og giver en potentiel strategi til behandling af livmoderhalskræft.

Støtte Information

S1 Table. Patienter Kendetegn

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120855.s001

(DOC)