PLoS ONE: p68 /DdX5 Understøtter β-Catenin & amp; RNAP II under Androgen receptor medieret transskription i prostata Cancer

Abstrakt

DEAD kasse RNA helicase p68 (Ddx5) er en vigtig androgen receptor (AR) transkriptionel co-aktivator i prostatacancer (PCA) og er over -expressed i sent stadium sygdom. β-Catenin er et multifunktionelt protein med vigtige strukturelle og signalfunktion som opreguleres i PCa og ligner p68, vekselvirker med AR at co-aktivere ekspression af AR målgener. Vigtigere, p68 danner komplekser med nuklear β-Catenin og fremmer gentranskription i coloncancer indikerer en funktionel samspil mellem disse to proteiner i cancer progression. I denne undersøgelse har vi undersøge forholdet af p68 og β-Catenin i PCa at vurdere deres potentielle samarbejde i AR-afhængig genekspression, som kan være af betydning for udviklingen af ​​kastrationsniveau resistent prostatacancer (CRPCa). Vi bruger immunpræcipitering at demonstrere en hidtil ukendt interaktion mellem p68 og β-Catenin i kernen af ​​PCA-celler, som er androgenafhængig i LNCaP-celler, men androgenuafhængig i et hormon ildfast derivat af samme cellelinje (repræsentant for CRPCa sygdom type). Forbedret AR aktivitet ses i androgenafhængige luciferase reporter assays upon transient co-transfektion af p68 og β-Catenin som en additiv virkning, og p68-udtømte chromatin-Immunpræcipitation (chip) viste et fald i rekrutteringen af ​​AR og β- catenin til androgen responsive promotorområder. Desuden fandt vi p68 immunfældet med det processive og ikke-processiv form af RNA polymerase II (RNAP II) og viser p68 rekrutteret til at forlænge regioner af AR medierede

PSA

gen, hvilket antyder en rolle for p68 ved at lette RNAP II transkription af AR medierede gener. Disse resultater tyder på p68 er vigtigt for at lette β-Catenin og AR transkriptionel aktivitet i PCA celler

Henvisning:. Clark EL, Hadjimichael C, Temperley R, Barnard A, Fuller-Pace FV, Robson CN (2013) p68 /DdX5 Understøtter β-Catenin RNAP II under Androgen receptor medieret transskription i prostatakræft. PLoS ONE 8 (1): e54150. doi: 10,1371 /journal.pone.0054150

Redaktør: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Frankrig

Modtaget: Maj 29, 2012; Accepteret: December 7, 2012; Udgivet: januar 17, 2013 |

Copyright: © 2013 Clark et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af prostata Action Charity [PCRF9 /07 til CNR ELC]; og Medical Research Council, Cancer Research UK, og Department of Health Prostata kræft Mekanismer for Progression og behandling (prompt) samarbejde [G0100100 /64424 til CNR]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

indtræden og progression af prostatacancer (PSA) er drevet af transkriptionelle funktion af androgenreceptoren (AR), og ablation af androgener er en effektiv strategi på tidlige stadier af sygdommen [1]. Imidlertid kan PCa videre til en kastrat resistent prostatacancer (CRPCa) fænotype, der er i øjeblikket uhelbredelig [1], [2]. Aberrant aktivering af AR menes at spille en fremtrædende rolle i udviklingen af ​​CRPCa; en proces postuleres at være delvist medieret via ukontrolleret aktivering af co-aktivatorproteiner, der letter ekspressionen af ​​AR responsive gener i en minimal hormon miljøet [3]. Forståelse af de molekylære begivenheder, som progression til CRPCa forekommer, kan føre til identifikation af nye mål og forbedre overlevelsen af ​​patienter med sygdom.

β-Catenin er en integreret komponent i Wnt-vejen, spiller en rolle i signaltransduktion. Den cytoplasmatiske stabilisering og nuklear akkumulering af β-Catenin er “kendetegnende« af aktiveringen af ​​Wnt signalvejen (se anmeldelser [4], [5]). I prostataceller, er β-Catenin fundet at være associeret med ligandholdigt AR og fungere som en AR co-aktivator forbedre både Wnt og androgen responsive gentranskription (gennemgået i [6] – [8]). Aktiveret AR er i stand til at shuttle β-Catenin ind i kernen og forbedre AR transkription, hvilket indikerer en ligand afhængig interaktion [9]. Men xenografter høstet fra kastrationsniveau resistente mus viste også øget samarbejde lokalisering og interaktion af AR og β-Catenin [10]. I LNCaP PCA celler i fravær af androgener, H2-relaxin medieret phosphorylering af Akt og GSK-3β forårsagede den stabiliserede cytoplasmatiske akkumulering af β-Catenin som efterfølgende bindes til AR og translokeres ind i kernen, hvilket antyder, at tilstedeværelsen af ​​androgener er ikke afgørende for interaktionen mellem AR og β-Catenin visse betingelser [11]. Interessant nok blev co-lokalisering og interaktion mellem AR og β-Catenin ikke set i tumorer høstet fra ikke-kastrerede mus, hvilket antyder, at denne interaktion er specifik for progressionen af ​​PCa til CRPCa og berettiger til yderligere undersøgelse. Direkte bevis for β-Catenin som en del af AR transkriptionelle komplekset er blevet demonstreret gennem Chromatin Immunpræcipitation (chip) undersøgelser, som viser β-Catenin rekrutteret til promotorregionerne af både androgen og Wnt responsive gener i nærvær og fravær af androgener [11 ], [12]. Yderligere bevis tyder på, at væksten af ​​metastatiske prostatatumorceller i knoglen er via androgen medieret Wnt aktivering [13], og øget nuklear p-catenin-niveauer er blevet korreleret med prostatacancer sygdomsprogression [14], [15]. Derudover reduktion eller tab af E-cadherin som normalt sekvestrerer β-Catenin på plasmamembranen postuleres at øge niveauet af cellulær β-Catenin og fremme AR aktivitet [7]. Kollektivt antyder dataene en vigtig rolle for β-Catenin i progressionen af ​​PCa til CRPCa fænotype. Men det er klart, at de præcise mekanismer, som β-Catenin medierer AR transkriptionel aktivitet og vækst af CRPCa i fraværet af androgener, fortjener yderligere undersøgelse.

RNA helicase p68 (Ddx5) er en vækst- og developmentally- reguleret prototypisk medlem af DEAD kasse familie af helicaser. P68 funktioner i mange cellulære processer ofte dysreguleret i kræft, herunder behandling af præ-mRNA og alternativ splejsning, celleproliferation, microRNA forarbejdning (revideret i [16], [17]), og ribosom biogenese [18]. p68 er også kendt for at interagere med flere komponenter af transkriptionelle kompleks og at co-aktivering af forskellige transkriptionsfaktorer, såsom tumor suppressor p53, østrogenreceptormodulatorer α (ERa) og β-Catenin (gennemgået i [16], [19], [20 ]). Vi har tidligere demonstreret p68 overudtrykt i PCa og fungerer som en co-aktivator af AR [21]. Foruden prostatatumorer, er p68 overudtrykt i mange andre cancer celletyper såsom colon og bryst, hvilket antyder, at p68 virker som en potentiel tumor promotor ([22] og revideret i [17]). p68 og stærkt homologe protein p72 (Ddx17), overeksprimeres og danner komplekser med β-Catenin i kernen af ​​coloncancerceller at aktivere gentranskription og fremmer celleproliferation [22] – [24]. Tyrosin 593-phosphoryleret p68 også forbundet med β-Catenin i cytoplasmaet for tyktarmskræft celler, hvor det fremmet β-Catenin nuklear translokation via en RanGTPase Wnt-uafhængig vej gennem interaktion med β-Catenin og fortrængning af Axin [25], [26 ]. Imidlertid modstridende forskning fandt ingen beviser, at p68 var nødvendig for nuklear translokation af β-Catenin i samme celletype [27] og tyrosin 593-phosphoryleret p68 adskilte sig ikke fra vild type i dets evne til at stimulere β-Catenin afhængig transskription i en anden undersøgelse [23].

i denne artikel bruger vi immunpræcipitation, chip og luciferase reporter teknikker i kombination med siRNA oligo nukleotid knockdown, at undersøge forholdet af p68 med β-Catenin at forstå den molekylære mekanisme, ved som de potentielt mediere afvigende aktivering af AR og vækst af PCA celler, som en del af AR transkriptionel kompleks.

Resultater

p68 og β-Catenin Interact i kernen af ​​PCA Cells

Da androgen receptor (AR) forbinder selvstændigt med β-Catenin og p68 i PCA celler [21], [28], og p68 og β-Catenin interagere i colon cancerceller [23]. Vi spekulere en mulig tre-vejs protein interaktion mellem AR, β-Catenin og p68 i PCA celler. Ligand fri AR sekvestreres i cytoplasmaet i PCA-celler og ved hormonbinding bevæger overvejende ind i kernen [29]. Tidligere fandt vi p68 at være et nukleart protein i PCA celler, hvis lokalisering var uændret ved androgen behandling [21]. Men p68 har vist sig, i cytoplasmaet for tyktarmskræft celler, hvor det associerer med β-Catenin [23], [25], og β-Catenin har vist sig at interagere med AR i cytoplasmaet i PCA-celler og flytte ind i kerne i nærvær og fravær af androgener [9] – [11]. I lyset af disse resultater, vi søgte at bekræfte lokaliseringen af ​​β-Catenin og p68 i LNCaP og hormonrefraktær LNCaP-AI PCa cellelinje (se materialer og metoder). Som forventet som reaktion på R1881 behandling (10 nM), AR translokeres til kernen i både LNCaP og LNCaP-AI-celler (figur 1A). Androgen behandling ændrede ikke signifikant den nukleare lokalisering af p68 i enten LNCaP eller LNCaP-AI-celler og på samme måde, lokaliseringen af ​​β-Catenin var uændret efter R1881 behandling. Forholdsmæssigt mindre β-Catenin findes i kernen i forhold til cytoplasmaet i LNCaP-celler, med forholdsmæssigt højere i LNCaP-AI celletype. Dette afspejler tidligere resultater, der demonstrerede AR konstitutivt pendulfart β-Catenin ind i kernen af ​​LNCaP-AI celler som en tilpasning til androgen uafhængige betingelser [10], [12].

A. Beskåret immuno-blot billeder viser cytoplasmatisk og nuklear LNCaP og LNCaP-AI PCA cellelysater (+/- R1881 10 nM, 8 timer), undersøgt sekventielt med β-Catenin, AR, p68, α-tubulin og TATA bindende (TBP) antistoffer . B. Interaktion af ektopisk p68 og β-Catenin i COS-7-celler. Hele cellelysater af COS-7-celler transficeret med pcDNA

3-p68-myc og pc’er

3 + Myc

6-β-Catenin-konstruktioner (+/- R1881 10 nM, 8 timer), var immunpræcipiteret med β-Catenin og p68 antistof henholdsvis. Beskåret immuno-blots blev probet sekventielt med β-catenin p68 og myc antibody.C. Interaktion af endogen p68 og β-Catenin i kernen af ​​LNCaP og LNCaP-AI PCA-celler i nærvær og fravær af androgener. Beskåret immuno-blot-billeder af LNCaP og LNCaP-AI nukleare lysater, immunopræcipiteret med p68 antistof (+/- R1881 10 nM, 8 timer), og probet sekventielt med β-Catenin og p68. Ekstrakt prøver indeholder enten hele celler eller nuklear lysat og protein G-sepharose uden antistof til stede. Kontrol (Con) prøver indeholder antistof og protein G sepharose i ekstraktionsbuffer alene.

Co-immunopræcipitation af HCT-116 cellelysater med β-cateninantistof identificeret en endogen p68 interaktion med β-Catenin helt lysater af tyktarmskræft celler [23]. Yderligere analyse under anvendelse Myc-mærkede trunkeringer af p68 viste, at COOH-terminalen af ​​p68 var ikke i stand til at interagere med β-catenin og interaktionen var gennem helicase (N-terminal) domæne af p68. Efter vores immuno-blot-resultaterne i figur 1A, hvor både β-Catenin og p68 blev fundet i kernen af ​​LNCaP og LNCaP-AI-celler i nærvær og fravær af androgener, undersøgte vi, om p68 og β-Catenin direkte interagerede i kernen af PCA celler. Figur 1B viser ektopisk co-immunpræcipitering af overudtrykt myc-mærket p68 og β-catenin-fusionsproteiner i androgen receptor negative COS-7 cellelinie, i både nærvær og fravær af R1881 (10 nM). Demonstration at under

in vitro

betingelser, p68 og β-Catenin er i stand til direkte at binde uafhængigt af AR og androgener. (N.B. det højere bånd i β-Catenin immunoprecipitation blot er et ikke-specifikt bånd detekteret af myc antistof). Men endogent protein immunpræcipiteret fra nukleare LNCaP ekstrakter viste, at β-Catenin-p68 interaktion blev lettet i tilstedeværelse af androgener (R1881, 10 nM), men omvendt i LNCaP-AI-cellelinje interaktionen blev lettet i fravær af androgener ( R1881, 10 nM) (figur 1C). (N.B. den omvendte immunpræcipitation under anvendelse β-cateninantistof at trække ned p68-protein ikke vist nogen interaktion mellem de to proteiner i enten LNCaP eller LNCaP-AI celletype, trods talrige forsøg med forskellige antistoffer mod p-catenin). Vi fandt heller ikke nogen endogen interaktion mellem p68 og β-Catenin i AR negative PC3 cellelinie (se figur S1 støtte information), hvilket indikerer, at tilstedeværelsen af ​​et funktionelt AR er muligvis vigtigt for en endogen interaktion mellem p68 og β-Catenin i PCA celler [21], [28].

p68 Interagerer RNAP II og rekrutteres til funktionelle regioner af

PSA

Gene

Vi har tidligere beskrevet p68 som funktion som en “adapter” eller “kobling” protein, der kan koordinere de tæt integrerede processer transkriptionel initiering, forlængelse og mRNA splejsning i AR-regulerede genekspression [30]. Rekruttering af p68 til endogene AR responsive gener kan lette spliceosome samling og øge hastigheden af ​​RNA-polymerase II (RNAP II) forlængelse, der påvirker splejsningssite anerkendelse og fremme exon springe i spirende udskrifter. På grund af de etablerede roller p-catenin og p68 spiller i den transkriptionelle initiering af AR regulerede gener, vi søgte at ekspandere på disse resultater og undersøge forholdet af p68 med RNAP II i PCA celler. Vi fandt p68 immunpræcipiteret med både endogent processiv (phosphorylering ved Ser-2) og ikke-processive (phosphorylering ved Ser-5) former af RNAP II i PCA-celler, i både nærvær og fravær af androgener (figur 2A R1881, 10 nM behandling ). Indikerer en mulig rolle for p68-aktivitet (udover AR co-aktivator-funktion), under forlængelsesegenskaberne stadier af AR reguleret transkription. Vi har tidligere demonstreret af chromatin-Immunpræcipitation (chip) og QPCR analyse over en 100 minutter androgen behandling (R1881, 10 nM) tidsforløb, en co-rekruttering af p68 med Ar ved androgen-responsiv promotor og enhancer regioner i AR regulerede

PSA

gen [21]. Udvidelse på disse resultater, vi optimeret qPCR primere til andre områder af

PSA

gen (i-mellem forstærker og promoter region (EP), exon 1, intron 2, exon 3, intron 3, exon 5 og 3’dsF regioner), at fastslå, om p68 blev rekrutteret til andre end transkriptionel initiering sites. (NB primer placering og rækkefølge oplysninger for disse regioner Den kan findes i tabel S1 støtte information. Det var ikke muligt at optimere qPCR primere til intron 1, exon 2, intron 4 eller exon 4 regioner i

PSA

gen). Figur 2B viser signifikant (

s

0,05 *) differential berigelse af AR på R1881 behandling (10 nM) på sæt tidspunkter (0, 15, 30, 45, 90 og 120 minutter) til ARE III region af

PSA

gen, som påvist tidligere [31]. Berigelse af Ar ved andre regioner sås ikke. Tilsvarende figur 2C viser signifikant (

s

0,005 **) cyklisk dissociation-association rekruttering af p68 på R1881 behandling (10 nM) til ARE III-region, selv om ansættelsen ikke var begrænset til denne region som EP , Exon 3, Intron 3, Exon 5 og 3’dsF regioner viste også signifikant berigelse. Rekruttering nåede ikke signifikans på, er I, Exon 1 og Intron 2-regioner. Disse resultater indebærer p68 er forbundet med både transkriptionel initiering og forlængelse former af RNAP II og beriget ikke kun på det transskriptionelle start- steder af en AR reguleret gen men på exon, introniske og 3’dsF regioner, hvilket indikerer en mulig funktion for p68 til at lette behandling af AR gentranskription ved RNAP II.

A. Beskåret immuno-blot-billeder af LNCaP nukleare lysater immunpræcipiteret med RNAP II H5 (ser-2), RNAP II H14 (ser-5), RNAP II CTD muse monoklonale og p68 antistof (+/- R1881 10 nM, 8 timer), probet sekventielt med P68 og RNAP II-antistof. Ekstrakt prøver indeholder nuklear cellelysat og protein G-sepharose uden antistof til stede. Kontrolprøver indeholder antistof og protein G-sepharose i kun kerneenergi buffer ekstraktion. B. Rekruttering af AR og C. p68 til regioner i

PSA

gen. LNCaP-celler blev behandlet med 10 nM R1881 og høstet efter 0, 15, 30, 45, 90 120 minutters tidspunkter. Prøverne blev immunfældet med AR, p68 eller kontrol IgG antistoffer og genvundet materiale behandles af chip assay. QPCR data er repræsentative for n = 3 uafhængige chip assays normaliseret til input niveauer (+/- SE). (N. B. qPCR primere kunne ikke være optimeret til alle exoniske og intron regioner i

PSA

gen). Den uafhængige parrede prøve

t

test blev anvendt til at sammenligne berigelse i rekrutteringen mellem forskellige

PSA

regioner og vis betydning. D. Diagram over

PSA

gen skildrer exon /intron-grænserne.

p68 funktion er nødvendig for Ansættelse af AR og β-Catenin til arrangøren regioner Androgen Responsive Gener

Vi har tidligere vist et fald i mRNA og protein niveauer i AR og androgenet responsiv

PSA

gen ved p68 knockdown af siRNA [21]. Overensstemmelse med chippen ovenstående resultater er β-Catenin rekrutteret til promotoren og enhancerregioner af androgen responsive og Wnt signaling målgener i både nærvær og fravær af androgener [11], [12]. I lyset af disse resultater, vi udførte CHIP eksperimenter i LNCaP celler forarmet af p68 af siRNA at fastslå, om p68 funktion var nødvendig for AR og β-Catenin rekruttering til promotorområder af androgen responsive gener. p68 målrettet siRNA knockdown udtryk (dæmpning af p68 mRNA -50%

s

0,0494 * og protein~90% ved 72 timer efter transfektion), ændrede ikke signifikant p-catenin mRNA eller protein udtryk niveauer i forhold til kontrol (ikke-nedregulering, NS) siRNA i LNCaPs celler, i nærvær eller fravær af R1881 (figur 3A, B og C henholdsvis). Androgen stimulation lettet en beskeden (0,8 gange) rekruttering af AR til ARE I området af

PSA

promotor i kontrol (NS) siRNA transficerede LNCaP-celler som forventet (figur 4A), som i væsentlig grad var svækket til kontrolniveauer i P68 udtømte celler (

s

0,0077 **). Ligeledes androgen stimulation øget AR rekruttering til ARE III enhancer region af

PSA

gen 9 gange i kontrol (NS) siRNA transficerede celler (figur 4B), mens det i P68 udtømte celler, rekruttering til den samme region var reduceret med 4 gange (

s

0,0008 ***). Et lignende mønster af dæmpning i AR rekruttering blev også set på

KLK2

(0,25 gange,

s

= 0,1593 Figur 4C) og

TMPRSS2 Hotel (1 fold,

p

0,0016 ** figur 4D) promotorområder i p68 målrettet siRNA udtømte celler efter R1881 behandling, selv om dette ikke nåede signifikans og androgen stimulation viste ikke berigelse af AR rekruttering på

KLK2

promotor . Men har vi set rekruttering af AR til

KLK2

promotor på andre tidspunkter (data ikke vist). Interessant nok blev et lignende mønster i dæmpning af β-Catenin rekruttering ved p68 målrettet siRNA knockdown også set. Øget β-Catenin rekruttering til begge ER I (0,6 gange) og ER III (0,8 gange) regioner blev observeret ved androgen stimulering i kontrol (NS) siRNA transficerede celler sammenlignet med ikke-behandlede celler (figur 4E og 4F henholdsvis), som forventet . Men i P68 udtømte celler, β-Catenin rekruttering var signifikant svækket til under kontrol (NS) siRNA niveauer begge regioner (1,1 fold,

s

0,0023 ** og 1,3 gange, s 0,0011 ** henholdsvis). Et lignende mønster af β-Catenin de-rekruttering blev gentaget på

KLK2

TMPRSS2

promotor i P68 udtømte celler (1,25 gange,

s

0,0003 ** * Figur 4G, og en fold,

s

0,0005 *** Figur 4H henholdsvis). Selv om det er at bemærke, at i modsætning til AR rekruttering, en stigning i β-Catenin rekruttering (1,75 gange) ses på

KLK2

promoter region på dette androgen tidspunkt. Vi har rapporteret et fald i AR mRNA og protein niveauer på p68 udtynding i LNCaP celler tidligere [21], støtter tanken om, at P68 fungerer som en AR co-aktivator. Derfor vil en reduktion i rekrutteringen af ​​AR til promotorregionerne af androgen responsive gener i P68 udtømte celler forventes som AR selv er et androgen responsive gen. Men i P68 udtømte celler, fandt vi β-Catenin rekruttering reduceres til et niveau lavere end ikke-behandlede celler på alle promotorområder vurderede (svarende til IgG-niveauer). Tyder direkte p68 interaktion kan være nødvendigt for at lette læsningen af ​​β-Catenin til transkriptionelt aktive regioner af androgen responsive gener. Disse data fremhæver betydningen af ​​p68 funktion i rekruttering af co-aktivator β-Catenin og AR til promotorområder af androgen responsive gener.

mRNA ekspressionsniveauer af p68 A. og β-Catenin B. i kontrol (NS) og p68 siRNA-transficerede LNCaP-celler (+/- R1881 10 nM, 16 timer). QPCR data blev normaliseret til GAPDH niveauer og fold forandring beregnet i forhold til at styre (NS) (-R1881) mRNA-niveauer (indstillet som 1). Den uafhængige prøve

t

test blev anvendt til at sammenligne forskelle i ekspressionsniveauer og vis betydning. C. Beskåret immuno-blot-billeder af lysater fra LNCaP-celler behandlet med 10 nM R1881 (16 timer) og transficeret med kontrol (NS) og p68 siRNA. Blots probet sekventielt med β-catenin p68 og α-tubulin antistoffer.

LNCaP-celler transficeret med p68 eller kontrol (NS) siRNA, behandlet med 10 nM R1881 i 90 minutter og immunpræcipiteret med enten AR ABC D. eller β-Catenin E. F. G. H. antistoffer (herunder en IgG kontrol antistof). Genvundet materiale blev behandlet af chip assay og rekruttering til

PSA

ER I (A F),

KLK2

(C G)

TMPRSS2

(D H) promotorområder vurderes i forhold til 0 minutter tidspunkt. p68 udtynding i LNCaP celler viste nedsat AR β-Catenin rekruttering efter behandling med 10 nM R1881 i 90 minutter til alle regioner vurderes i forhold til kontrol (NS) siRNA celler. De viste resultater repræsenterer n = 3 uafhængige forsøg (+/- SD). Den uafhængige prøve

t

test blev anvendt til at sammenligne forskelle i ekspressionsniveauer og vis betydning.

p68 og β-Catenin additivt Øge transkriptionsaktivitet androgenreceptor regulerede gener

i betragtning af at p68 og β-Catenin interagere i PCA celler og p68 letter rekrutteringen af ​​β-Catenin til androgen responsive genpromotorer. Vi valgte næste at undersøge den kombinerede virkning af co-ekspression af p68 og β-Catenin på den transkriptionelle aktivitet af AR hjælp androgenafhængige luciferase reporter assays i COS-7-celler. AR-medierede p (ARE)

3 Luc reporter blev robust stimuleret 2 gange ved AR upon R1881 (10 nM) androgen behandling (figur 5, sammenlign lysegrå bar + R1881 og mørkegrå bar -R1881). Over-ekspression af β-Catenin udviste ubetydelig p (ARE)

3 Luc reporter aktivitet i nærvær eller fravær af R1881 påviser, at β-Catenin påvirker ikke direkte p (ARE)

3 Luc reporter aktiviteten i fravær af AR. Men co-ekspression af AR og β-Catenin viste en 8 gange stigning i p (ARE)

3 Luc reporter aktivitet ved R1881 behandling, hvilket bekræfter β-Catenin som en co-aktivator af AR i overensstemmelse med tidligere fund [28 ]. Ligeledes co-ekspression af AR og p68 viste en 5 gange stigning i p (ARE)

3 Luc reporter aktivitet efter R1881 behandling, også bekræfter p68 som en co-aktivator af AR i overensstemmelse med tidligere resultater. (N. B. p68 har vist sig at ikke påvirke p (ARE)

3 Luc reporter aktiviteten direkte i fravær af AR [21]). Men co-ekspression af AR, β-Catenin og p68-konstruktioner viste en signifikant 18 fold (

s

0,0011 **

)

stige i p (ARE)

3 Luc reporter aktivitet ved R1881 behandling, 10 gange højere end AR og β-Catenin co-ekspression, hvilket viser p68 har en væsentlig additiv virkning på AR og β-Catenin transkriptionel aktivitet. Dette blev også set med et andet androgen reguleret

PSA

promotor luciferase reporter (p (PSA) Luc), hvorved co-ekspression af AR, β-Catenin og p68-konstruktioner udviste en signifikant 8 fold (

p

0,0057 **) stige i reporter aktivitet, 5 gange højere end AR og β-Catenin co-ekspression, hvilket bekræfter den additive virkning af p68 på β-Catenin og AR transkriptionel aktivitet (se supplerende oplysninger, figur S2). p68 er blevet rapporteret at danne heterodimerer med stærkt homologe helicase p72 (DdX17), og co-aktivere β-Catenin medieret genekspression tidligere [23]. Vi fandt, at co-transfektion af AR, β-Catenin og P72-konstruktioner ikke havde en væsentlig additiv virkning på p (ARE)

3 Luc reporter aktivitet sammenlignet med co-transfektion af AR, β-Catenin og p68-konstruktioner (se supplerende oplysninger, figur S3

s

= 0,3646). Dette svarer til en tidligere rapport, der fandt p72 ikke kunne forbedre AR transkriptionelle aktivitet af p (ARE)

3 Luc reporter [21], og foreslår en specificitet for p68 i den transskriptionelle aktivering af AR i PSA. Kollektivt antyder disse data β-Catenin og p68 kan arbejde sammen som co-aktivatorer at øge AR reguleret transskription.

COS-7 celler forbigående transficeret i tre eksemplarer med p (ARE)

3Luc reporter og pCMV β-galactosidase plasmider sammen med mammale ekspressionsvektorer for AR, β-Catenin og p68 (+/- 10 nM R1881). Luciferaseaktivitet blev korrigeret for den tilsvarende β-galactosidaseaktivitet, hvilket gav relativ aktivitet. Rækken af ​​plasmid niveauer (+ og ++) svarer til 50 og 100 ng henholdsvis. Viste data i forhold til AR aktivitet alene (-R1881) (indstillet som en), og repræsentant for mindst n = 3 luciferase assay forsøg (+/- SE). Den uafhængige prøve

t

test blev anvendt til at sammenligne forskelle i ekspressionsniveauer og vis betydning.

Discussion

I denne undersøgelse beskrives en funktionel interaktion mellem p68 , β-Catenin og AR i kernen af ​​PCA-celler. AR er vist at signalere gennem Wnt /β-Catenin pathway i PCa som en tilpasning til kastratniveau af androgener [12], og β-Catenin er kendt for at interagere med andre co-aktivatorer af AR [32]. Her præsenterer vi immunopræcipitation, p68-udtømte chip og

PSA

luciferase reporter data til at bekræfte en interaktion mellem p68, β-Catenin og AR i PCA celler. Vi bekræftede oprindeligt en direkte

in vitro

p68-β-Catenin interaktion ved forbigående transfektion af konstruktioner ind i AR negative COS-7 cellelinie (som ikke var androgenafhængige). Men efter yderligere undersøgelse fandt vi, under endogene betingelser p68-β-Catenin interaktion blev lettet i nærvær af androgener i LNCaP PCa cellelinie, men omvendt i hormonrefraktær (LNCaP-AI) derivat af denne cellelinie (som er repræsentative for den CRPCa sygdom type), blev interaktionen lettet i fravær af androgener. Dette svarer til en konstatering af øget endogen AR /β-cateninkomplekset dannelse i en kastrat resistent PCa mus implanteret model, hvor ingen interaktion mellem AR og β-Catenin blev påvist i tilstedeværelsen af ​​androgener [10]. Dette kan tyde på en tilpasset mekanisme, ved hvilken p68 og β-catenin co-aktivatorer kooperativt opretholde transkriptionel aktivitet af AR (og androgen regulerede gener), hvilket letter celle overlevelse kastreringsområdet-resistente (CRPCa) sygdom type. Imidlertid er yderligere arbejde, der kræves for at underbygge den fulde molekylære mekanisme for denne påstand. Immuno-blot-data bekræftede den cellulære lokalisering af p68 og β-Catenin blev ikke påvirket af hormon (vi fandt p68 og β-Catenin i kernen af ​​PCA-celler i både nærvær og fravær af androgener), og

PSA

luciferase reporter data viste co-transfektion af p68 og β-catenin-konstruktioner havde en additiv virkning på den transkriptionelle aktivitet af AR i nærvær af androgener. Disse data antyder, at p68 og β-Catenin arbejder sammen som co-aktivatorer til additivt forbedre den transkriptionelle aktivitet af AR, som interessant nok kan have konsekvenser i progression af CRPCa sygdom type.

Vi viste også bruger knockdown af p68-ekspression ved siRNA oligonukleotid kombineret med chip blev denne p68 kræves til optimal rekruttering af AR og β-Catenin at promotorområder af androgen regulerede gener. Androgen stimulering lettet rekruttering af AR til både ER I og ER III regioner i

PSA

promotor, og

KLK2

TMPRSS2

promotorregioner i kontrol (NS) siRNA transfekterede LNCaP celler, som efterfølgende blev svækket i P68 udtømte celler. Den observerede β-Catenin rekruttering til de samme androgen reguleret promotorområder blev reduceret i P68 udtømte LNCaP celler efter androgen behandling, men til niveauer lavere end ikke-behandlede celler (svarende til IgG kontrol). Dette er en interessant fund, da det tyder på, at en reduktion i rekrutteringen af ​​β-Catenin til promotorområder af androgen regulerede gener i P68 udtømte celler er ikke bare en konsekvens af mindre AR rådighed for rekruttering, og indebærer, at p68-funktion er nødvendig for at load β-Catenin til transkriptionelt regulerede områder af androgen responsive gener.

rolle p68 i alternativ mRNA splejsning er veldokumenteret (anmeldt i [19], [21], [33]). Vi har tidligere spekuleret på, at p68 kan fungere som en “adapter” eller “kobling” protein, der koordinerer tæt integrerede processer transskription og RNA behandling, lette krydstale mellem transskription og RNA forarbejdning i AR-regulerede gener, eventuelt ved at kontrollere hastigheden af transkriptionel initiering /forlængelse på RNAP II [30]. RNAP II har to fysiologisk vigtige phosphoryleringssites ved C-terminalen, som er vigtige for overgang polymerasen fra en transkriptionel initiering formular (fosforylering ved ser-5), til etablering af forlængelse transkriptionelle kompleks formular (fosforylering ved ser-2) . I denne undersøgelse demonstrerer vi at bruge endogene nukleare ekstrakter af LNCaP PCA-celler, at p68 vekselvirker med både processive (phosphorylering ved Ser-2) og ikke-processive (phosphorylering ved Ser-5) form af RNAP II, i nærvær og fravær af androgener.