PLoS ONE: Cellular Adhæsion Fremmer prostatacancerceller flygte fra Dormancy

Abstrakt

Formidling af prostatakræft (PCA) celler til knoglemarven er en tidlig begivenhed i sygdomsforløbet. Hos nogle patienter, disseminerede tumorceller (DTC) prolifererer til dannelse aktive metastaser efter en længere periode med målbart sygdom, kendt som tumor hviletilstand. Identificering mekanismer PCa vækstdvale og reaktivering fortsat en udfordring dels på grund af manglen på

in vitro

modeller. Her karakteriserede vi

in vitro

PCa hviletilstand-reaktivering ved at inducere celler fra tre patient-afledt xenograft (PDX) linjer til at proliferere gennem tumorcelle kontakt med hinanden og med knoglemarvsstroma. Prolifererende PCA celler demonstreret tumor celle-celle kontakt og integrin klyngedannelse ved immunfluorescens. Global genekspression analyser på prolifererende celler dyrket på knoglemarvsstroma afslørede en nedregulering af TGFB2 i alle de tre prolifererende PCa PDX linjer i forhold til deres ikke-prolifererende modstykker. Endvidere konstitutiv aktivering af myosin let kæde-kinase (MLCK), en nedstrøms effektor af integrin-beta1 og TGF-beta2, i ikke-prolifererende celler fremmes celleproliferation. Denne celleproliferation var associeret med en opregulering af CDK6 og en nedregulering af E2F4. Tilsammen vores data giver den første klinisk relevante

in vitro

model til at understøtte cellulær vedhæftning og nedregulering af TGFB2 som en potentiel mekanisme, hvormed PCA celler kan flygte fra dvale. Målretning TGF-beta2-associeret mekanisme kan tilvejebringe nye muligheder for at forhindre dødbringende PCa metastaser

Henvisning:. Ruppender N, Larson S, Lakely B, Kollath L, Brun L, Coleman I, et al. (2015) Cellular Vedhæftning Fremmer prostatacancerceller flygte fra Vækstdvale. PLoS ONE 10 (6): e0130565. doi: 10,1371 /journal.pone.0130565

Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, UNITED STATES

Modtaget: Februar 11, 2015; Accepteret: 21. maj 2015; Udgivet: 19 juni 2015

Copyright: © 2015 Ruppender et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: All genekspression filer er tilgængelige fra GEO databasen (tiltrædelse nummer GSE64262)

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af Janssen Research and Development LLC (https://www.janssenrnd.com), og PA1 CA85859 fra National Institutes of Sundhed (https://grants.nih.gov/grants/funding/ac_search_results.htm?text_curr=p01)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

formidling af prostatakræft (PCA) celler til knoglemarven er en tidlig begivenhed i sygdomsforløbet PCa [1, 2]. I mange tilfælde er disse disseminerede tumorceller (DTC) prolifererer til dannelse aktive metastaser efter en lang periode med målbart sygdom efter prostatektomi. Denne latensperiode er ofte omtalt som tumor hviletilstand. Til dato, vækstdvale fortsat en væsentlig klinisk udfordring, som PCA patienter præsenteres med knoglemetastaser i sidste ende op med at reagere på anden linje behandlingsformer og til sidst bukke under for sygdommen. Således er det blevet afgørende at identificere mekanismer for tumor vækstdvale i et forsøg på at forhindre PCa gentagelser.

En hvilende tumor celle ikke formere aktivt, men har potentialet til at formere får de rette eksterne signaler. Med denne definition, kunne flere scenarier potentielt fremkalde vækstdvale, herunder ugunstige tumor mikromiljø, næringsstof sult, den iboende karakter af DTC eller epigenetiske ændringer forårsaget af mikromiljø [2, 3]. Men ikke alle tilfælde af indolent PCa nødvendigvis udgør vækstdvale. En patient kan simpelthen have langsomtvoksende tumorceller bosiddende i den metastatiske sted på tidspunktet for indledende behandling og erfaring tilbagefald kort tid derefter. Andre kan aldrig opleve tilbagefald, mens en delmængde af patienterne oplever tilbagefald efter længere perioder. Til dato, mekanismerne i dvale stort set ukendt. Imidlertid har den urokinase-lignende plasminogen aktivator (uPA) og dens tilhørende receptor (uPAR) været impliceret i reguleringen af ​​vækstdvale i forskellige kræftformer. Specifikt høje niveauer af uPA og uPAR inducerer hviletilstand undslippe ved opregulering ERK /p38-forhold inden cancerceller [4, 5]. Denne høje uPAR-ekspression blev associeret med aktiveringen af ​​α

Vp

1 integrin, hvilket resulterer i tumorvækst [4-7]. I en separat undersøgelse blev uPA-reguleret migrering af tumorceller aktiveret af myosin letkæde-kinase (MLCK) [8], som phosphorylering blev induceret ved ERK [9]. MLCK er en kendt regulator af kontraktilitet, motilitet, og adhæsion [10, 11], men den rolle, MLCK i PCa hviletilstand flugt forbliver ukendt.

Matrix og intercellulære adhæsioner er blevet impliceret i tumor hviletilstand regulering. Undersøgelser viste, at integrin-medieret celleadhæsion til den ekstracellulære matrix aktiverer MAPK’er [12-14], som regulerer tumorvækst [15-19]. I PCa, opregulering af β

1 integrin fremmer væksten og invasion af celler [3, 20], og interaktioner mellem tumor og stroma kan skyldes udslip af hvilende celler fra strålebehandling [21]. Nylige undersøgelser humane PCA cellelinjer på museknoglemarvs stroma har identificeret vigtige faktorer i muse hæmatopoietisk niche, der regulerer dvale [22, 23].

Vi her karakteriserede hviletilstand og vækst af tre PCA patient-afledte xenotransplantater (PDXs) oprettet fra metastaser opnået ved hurtig obduktion eller operation på menneskers knoglemarv mikromiljø

in vitro

. Disse PDXs (LuCaP 86,2, 92, og 93) vises

in vitro

hvile i typiske celle dyrkningsbetingelser, som kan repræsentere vækstdvale og vi havde til formål at identificere den rolle celle-celle adhæsion i frigivelsen af ​​PCa fra dvale i en human knoglemarv sammenhæng. Vi bestemt, at tumor celle-celle kontakt på knoglemarv stroma er nødvendig for LuCaP PDX celler til at formere

in vitro

og var forbundet med en universel nedregulering af TGFB2. Endvidere kunne LuCaP PDXs vækstdvale reaktivering blive sammenfattet ved konstitutivt aktivere MLCK og cyklin-afhængige kinase 6 (CDK6).

Materialer og metoder

Dissociation, isolation, og kultur af LuCaP PDX

in vitro

stromale knoglemarvsceller (BMSC), der blev isoleret fra en patient med PCa knoglemetastaser (BM2508) blev podet ved 50.000 celler /cm

2 overnight. Den følgende dag blev BM2508 celler behandlet med 10 ug /ml mitomycin C (Sigma, St. Louis, MO) i 1 time. LuCaP PDXs der blev rutinemæssigt passeret

in vivo

som tidligere beskrevet [21] blev udskåret og dissocieret ved hjælp af Miltenyi human tumor dissociation kit (Miltenyi Biotec Inc., San Diego, CA; # 130-95-929) og beriget ved positiv selektion under anvendelse af magnetiske mikroperler mod human epithelial antigen EpCAM /CD326 (Miltenyi Biotec Inc .; # 130-061-101) ifølge producentens instruktioner. LuCaP PDX celler blev derefter podet på toppen af ​​BM2508 cellerne ved enten 50.000 celler /cm

2 (G; voksende /prolifererende) eller 50 celler /cm

2 (NG, ikke vokser /dvale). På dag 8 blev LuCaP PDX celler differentielt trypsiniseret og beriget af positiv og negativ selektion med magnetiske perler, fluorescens-mærket for EpCAM /CD326 og individuelt plukket med en mikromanipulator som tidligere beskrevet [24]. For at sikre, at NG-celler var hvilende stedet for aldrende, en β-galactosidase-assayet (Pierce Biotechnology, Inc., Waltham, MA; # 75707) blev udført på alle NG LuCaP PDX celler ifølge producentens instruktioner. Alle procedurer, der involverer mennesker blev godkendt af Institutional Review Board fra University of Washington Medical Center, og alle emner underskrevet informeret samtykke. Dyret Undersøgelsen blev specifikt er godkendt af University of Washington Institutional Animal Care og brug Udvalg og alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med NIH retningslinjer.

immunfluorescensfarvning

LuCaP PDX celler blev dissocieret , udvalgt og udpladet som beskrevet ovenfor på dækglas konjugeret med lysin. På dag 8 blev celler fikseret med iskold methanol, blokeret med 5% horse-gede-kylling serum og farvet for EpCAM og Ki67 eller

1 integrin ved anvendelse af en FITC-konjugeret muse monoklonalt anti-humant Ber-EP4-antistof ( DAKO, Carpinteria, CA, F086001), og en kanin polyklonalt anti-human Ki-67-antistof (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX; SC-15402) eller en kanin polyklonalt anti-humant ITGB1 antistof (Santa Cruz Biotechnology; SC-9970 ) sammenholdt med et gede-anti-kanin Alexa-Fluor 546 konjugeret sekundært antistof (Life Technologies, Carlsbad, CA; a-11035). Dækglas blev derefter monteret med forlænge Guld antifade reagens indeholdende DAPI (Life Technologies; P-36931).

celletælling og WST-1 assays

C4-2B (en gave fra Dr. Leland Chung [25]) og dissocierede LuCaP PDX celler (LuCaP 86.2, 92, 93, 96, 141; [26-28]) blev udpladet i RPMI-1640 eller MEM (Life Technologies) henholdsvis suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS ). Celler blev podet enten tyndt (50 celler /cm

2) eller tæt (50.000 celler /cm

2) på en sammenflydende monolag af BMSC (50.000 celler /cm

2), som blev forbehandlet med 10 ug /ml mitomycin C. for C4-2B celler podet tyndt på BMSC, efter 1 og 8 dage blev cellerne farvet for EpCAM, Ki67, og DAPI som beskrevet ovenfor. Kun EpCAM + epithelceller (som repræsenterer C4-2B celler, fordi BMSC er EpCAM-) blev talt i hele kammeret under et fluorescensmikroskop under anvendelse af 200 ganges forstørrelse. For C4-2B celler seeding uden BMSC blev WST-1 assay (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) udført ifølge producentens anvisninger. Absorbans blev aflæst på en mikropladelæser ved 450 nm, og baggrunden absorbans (medier) blev trukket fra alle aflæsninger. For LuCaP PDX celler, efter 3, 7 og 14 dage på BMSC blev celler trypsiniseret, farvet for EpCAM og Ki67 som beskrevet ovenfor og resuspenderet i 50 pi forlænge Gold antifade reagens indeholdende DAPI. To alikvoter af 10 pi farvede celler blev talt og EpCAM + epitelceller (dvs. LuCaP PDX celler) blev registreret.

Flowcytometrisk analyse

C4-2B celler blev dyrket natten over i RPMI-1640 medium suppleret med 10% FBS og derefter behandlet med DMSO eller ML-7 (10 uM) i 24 timer og 48 timer. De behandlede celler blev trypsinbehandlet, fikseret, farvet med 10 ng /nl DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol, Life Technologies) /1% NP-40/10% DMSO, og lyseret ved hjælp 25G sprøjte. Mindst 10.000 farvede celler blev analyseret ved anvendelse BD LSR II Flowcytometersystem (BD Biosciences, San Jose, CA) og cellecyklus blev analyseret ved Multicycle (De Novo Software, Glendale, CA) Salg

Viral transduktion og lægemiddelbehandlinger af LuCaP PDX celler

in vitro

LuCaP PDXs blev dissocieret og valgt som beskrevet ovenfor, og belagt på 50.000 celler /cm

2 uden stromale celler. Den følgende dag blev celler transduceres ved en MOI (infektionsmultiplicitet) på 10 med en af ​​følgende:. En adenoviral vektor, som enten indeholdt en aktiveret form af myosin let kæde-kinase (A-TMK, en gave fra Drs Zuzana Strakova, jody Martin, og Primal de Lanerolle, [29]), en tom vektor, eller en lentiviral vektor, som indeholdt enten cDNA for CDK6 eller GFP (Applied biologiske materialer pLentiIII-EF1α). Celler blev transduceret i MEM suppleret med 10% FBS og 8 ug /ml polybren (Santa Cruz Biotechnology). Celler blev enten immunofluorescently farvet som beskrevet ovenfor eller trypsinbehandlet til RNA-ekstraktion. For at bestemme om MLCK aktivitet er nødvendig for PCa proliferation, C4-2B celler, som let formere

in vitro

, blev udpladet ved 50.000 celler /cm

2 i RPMI-medium (Life Technologies) suppleret med 10% FBS. Cellerne blev derefter enten behandlet med 10 pM ML-7 (Sigma; I2764) eller DMSO-kontrol i 24 timer

RNA-ekstraktion og amplifikation

I 10-celle transkriptomisk undersøgelse, 10 individuelt isoleret. celler pr xenograft linje blev lyseret og amplificeret cDNA blev dannet fra det totale RNA ved hjælp af NuGEN Ovation RNA Amplification System som tidligere [24, 30] beskrevet. CDNA var klædt på Agilent 44K hele menneskelige genom udtryk oligonucleotid mikroarrays (Agilent Technologies, Inc.). For andre

in vitro

eksperimenter blev RNA isoleret ved anvendelse af RNeasy mini kit (Qiagen Inc., Valencia, CA). Et mikrogram RNA var omvendt transskriberet ved hjælp af Qiagen RT

2 første streng kit, efterfulgt af PCR-array eller RT-qPCR-analyse.

Mærkning og hybridisering af amplificeret materiale til hele menneskelige genom udtryk oligonukleotid microarrays

Amplified cDNA fra hver prøve blev mærket under anvendelse af BioPrime samlet genomisk Labeling System (Life Technologies, Grand Island, NY) og mikroarray blev udført ifølge tidligere procedurer [24, 30] med små ændringer. Kort fortalt blev hybridiseringsprober fremstillet ved at kombinere 4 ug Alexa Fluor 3-mærkede prøve med 400 ng Alexa Fluor 5-mærket reference. Proberne blev denatureret ved 95 ° C og hybridiseret ved 63 ° C på Agilent Menneskelig 4x44K mikroarrays (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA), vasket og fluorescerende array-billeder blev indsamlet ved hjælp af Agilent mikromatrice scanner. Dataene blev løss normaliseret inden arrays og fraktil normaliseret mellem arrays i R ved hjælp af Limma BioConductor pakken. Data blev filtreret for at fjerne prober med gennemsnitlige signalintensiteter under 300. Den statistiske analyse af Microarray (SAM) program (https://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/) [31] blev anvendt til at analysere ekspressionsforskelle mellem grupperne anvender uparrede, to-sample t-test og kontrolleret for multipel testning ved at estimere q-værdier ved hjælp af den falske opdagelse sats (FDR) metode. Microarray data er deponeret i Gene Expression Omnibus database under tiltrædelsen nummer GSE64262.

Genekspression analyser

For at afgøre, om forskellen transskription observeret i NG (ikke vokser /dvale) versus G (voksende /prolifererende) grupper blev beriget for gener i kanoniske veje og Gene ontologi gensæt fik t-testresultater underkastet gensæt Enrichment Analysis (GSEA) under anvendelse preranked tilstand med permutation test af gensæt at justere for multipel testning hypotese, at frembringe et FDR. Opsyn, hierarkisk gruppering af de mest differentielt udtrykte blev udført mellem NG og G grupper baseret på SAM score (SAM score 2 og p ≤ 0,05, i alt 238 gener) ved hjælp af Cluster 3.0 (bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software /klynge /software.htm) og Java TreeView (https://jtreeview.sourceforge.net/).

Ingenuity Pathway Analyse

238 differentielt udtrykte gener mellem NG og G-grupper var importeres til Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Opfindsomt Systems, https://www.ingenuity.com) for at identificere molekylære og cellulære funktioner og opstrøms regulatorer involveret i celledeling eller vækstdvale som tidligere beskrevet [30]

Kvantitative. real-time PCR

til PCR array, 25 ng af cDNA blev anvendt til human celle-cyklus PCR array (Qiagen Inc., PAH’er-020Z) ifølge producentens instruktioner. For qPCR analyse, 2 ng (G og NG 10-celle-undersøgelse) eller 10 ng (lentivirale transduktion undersøgelser) af cDNA blev anvendt til Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG-systemet (Life Technologies, 11733-038) i forbindelse med de følgende primere: CDK6: (F) 5’AGGCTGCTGTTTTCTCTCCA3 «, (R) 5’CCACACTGCTTCTTGGGTCT3« E2F4: (F) 5’TGATGTGCCTGTTCTCAACC3 ‘, (R) 5’GAGTCCTGTTCCCCTGCTCT3’ .; RPS15: (F) 5’TCCGGCAAGATGGCAGAAGTAG3 ‘, (R) 5’CCACGCCGCGGTAGGT3’; Cdc42: (F) 5’GTCACAGTTATGATTGGTGGAGA3 ‘, (R) 5’TCAGCGGTCGTAATCTGTCA3 «; FN1: (F) 5’AAGAGGCAGGCTCAGCAAAT3 ‘, (R) 5’GTCATAACAACCGGGCTTGC3 «; TGFB2: (F) 5’TCTTCCCCTCCGAAAATGCC3 «, (R) 5 ‘TCTCCATTGCTGAGACGTCAA3’

Resultater

PDX celler kræver celle-celle kontakt at formere

in vitro

PCA xenografter vi har etableret fra metastaser opnået ved hurtig obduktion eller operation ikke formere

in vitro

efter dissociation under standard monokultur betingelser [32]. Af de fem LuCaP PCa PDX linjer vi undersøgt, ingen af ​​dem viste målbare β-galactosidaseaktivitet (data ikke vist), hvilket antyder disse celler er i dvale i stedet senescent. Som hvilende celler ved definition bevarer potentialet til at formere sig, søgte vi at afgøre, om disse xenotransplantater kunne “aktiveret”

in vitro

. Vi udviklede en

in vitro

model den gentog PCA cellerne i kontakt med BMSC og tillod LuCaP PDX celler seedet enten tyndt uden tumor-tumor celle kontakt (NG, ikke vokser, 50 celler /cm

2) eller tæt hvor cellerne var i direkte kontakt med hinanden (G, vokser, 50.000 celler /cm

2, fig 1A). Vi her rapporteret, at når LuCaP 86,2, 96, og 141 blev podet tæt på et monolag af BMSC, de viste en stigning i celle nummer efter 14 dage, mens de celler, der blev podet tyndt undladt at formere (Fig 1B og data ikke vist) . I modsætning hertil C4-2B celler podet tyndt på BMSC viste en stigning i celle nummer efter 7 dage (S1 Fig). For visuelt at detektere associationen mellem tumor- celle-celle-kontakt og proliferation, vi udvidet undersøgelsen til fem LuCaP linjer for immunfluorescerende detektion. Efter 14 dage i kultur, blev ingen positiv Ki67-farvning påvist i ng celler, som blev tyndt podet uden tumorcelle-celle-kontakt (Fig 1C, øvre panel). I overensstemmelse med den trypan blå-udelukkelse assay blev positiv Ki67-farvning observeret i G-celler, der var tæt podes og viste celle-celle-kontakt, hvilket antyder, at tumor celle-celle-kontakt blev associeret med celleproliferation (Fig 1C, nedre panel).

A) En ordning, der viser

in vitro

kultur betingelse for ikke vokser (NG) og voksende (G) LuCaP PDX celler på BMSC. LuCaP celler blev podet tyndt på 50 celler /cm

2 eller tæt på 50.000 celler /cm

2 på en sammenflydende lag BMSC (50.000 celler /cm

2) forbehandlet med 10 ug /ml mitomycin C til hæmme BMSC celledeling. B) LuCaP celler podet tæt på BMSC blev kvantificeret ved positiv EpCAM farvning på dag 3, 7 og 14 efter såning. C) LuCaP celler (86,2, 92, 93, 96, og 141) blev podet tyndt (øvre panel, NG) eller tættest (lavere panel G) på BMSC. Efter 14 dage blev cellerne fikseret med iskold methanol og fluorescens farvet med Ki67 at vurdere proliferation. Green, EpCAM; Rød, Ki67; Blå, DAPI. Hvid pil: tyndt sederede celler viser negativ Ki67 farvning efter 14 dage. Forstørrelse: 200x. Scale bar: 50 pm. Forsøgene blev gentaget 2-3 gange og grafer, der viser gennemsnit ± SEM eller repræsentative billeder blev vist.

Ø1 Integrin aktivitet associerede med LuCaP PDX celledeling

in vitro

Når direkte celle-celle kontakt sker, blev rapporteret integriner skal aktiveres resulterer i cellecyklusprogression og celledeling [33]. Vi har derfor undersøgt i LuCaP PDX solceller, også β

1 integrin klyngedannelse blev aktiveret som reaktion på celle-celle kontakt. I LuCaP 86,2, 92, og 93, når seedet tæt på et monolag af BMSC viste prolifererende G celler gruppering af β

1 integrin, mens de ikke-prolifererende NG celler seedet tyndt ikke vise gruppering af β

1 integrin (figur 2).

LuCaP 86,2, 92, og 93 blev dissocieret og dyrket på et konfluent monolag af BMSC. β

1 integrin immunfluorescensfarvning viste integrin clustering (røde klynger og fremhævet af den hvide pil) i tæt sederede celler, der voksede (G). Denne klyngedannelse blev ikke påvist i tyndt seedede, Non-proliferativ celler (ikke vokser, NG). Green, EpCAM; Rød, β1 integrin; Blå, DAPI. Forstørrelse: 200x. Scale bar: 20 pm

Genekspression analyse viste nedregulering af TGFB2 i prolifererende celler

Dernæst vi gennemførte microarray genekspression analyse til at afgrænse mekanismerne bag aktiveringen af ​​β

1 integrin og celleproliferation. I alt 238 gener (SAM score ≥2 eller ≤-2, s 0,05) blev differentielt udtrykt mellem hvilende /ikke vokser (NG) og prolifererende /voksende (G) celler i LuCaP 86,2, 92, og 93 (fig 3A) . Vi observerede, at cellulær bevægelse var den øverste molekylære og cellulære funktion ændret (fig 3B, s 0,05) og en nedsat aktivering blev forudsagt (fig 3C, z-score -2,4) i G sammenlignet med NG-celler. Interessant Ingenuity Pathway Analyse identificeret en top regulator effektor netværket til disse gener involveret i nedsat aktivering på cellulær bevægelse og viste, at endothelin 1 (EDN1) var den fælles opstrøms regulator for nedregulering af Cdc42, FN1, og FOSL1, hvilket resulterede i nedsat cellebevægelse (fig 3C og 3D). Trods EDN1 bliver identificeret som den øverste fælles opstrøms regulator til nedsat cellulær bevægelse i G i forhold til NG celler, viste microarray udtryk analyse, at det ikke var signifikant ændret i G i forhold til NG-celler (1,2 gange opregulering i G-celler med et SAM score 0,2, data ikke vist). Da

FOSL1

har en meget lav endogen niveau, derfor har vi fokuseret på at validere

cdc42

FN1

ved hjælp af real-time qPCR og fandt, at begge gener blev nedreguleret i G-celler i to af de tre LuCaP PDX testede linier (fig 3E). Desuden TGFβ2 er en kendt nedstrøms effektor af β

1 integrin og opregulering af

TGFB2

udtryk er blevet rapporteret at være forbundet med migration og kræft vækstdvale [34, 35] undersøgte vi og fandt, at

TGFB2

udtryk konsekvent nedreguleret i G i forhold til NG celler i alle tre LuCaP PDX linjer ved real-time qPCR (figur 3E). I klinisk afledt DTC isoleret fra knoglemarven, vi valideret, at

FN1

(p 0,01, fra genekspression datasæt GSE48995, [26]) og

TGFB2

[35] blev opreguleret hos patienter uden tegn på sygdom i forhold til patienter med aktiv PCa metastaser, mens ingen signifikant genekspression ændring for

blev opdaget cdc42

(p = 0,67) mellem de to grupper af DTC (data ikke vist).

A) Heat kort over hierarkisk klynger differential genekspression i NG og G LuCaP PDX celler. Green, nedreguleret; rød, opreguleres. B) Opfindsomhed pathway analyse, der viser cellulær bevægelse var den øverste molekylære og cellulære funktion ændres mellem NG og G celler. C) Liste over otte gener, der var involveret i nedsat aktivering af cellulær bevægelse i G sammenlignet med NG-celler. D) EDN1 var forudsagt til at være den øverste tilsynsmyndighed, der ramte cellen bevægelse via nedregulering af FN1, cdc42, og FOSL1. E) Kvantitativ realtids-PCR viste en nedregulering af FN1, Cdc42 og TGFb2 i voksende LuCaP linjer. Data, blev normaliseret til niveauet i husholdning gen RPS15. NG: ikke vokser; G:. Voksende

Aktivering af MLCK forfremmet PCa PDX celler spredning via CDK6 i fravær af BMSC

Myosin let kæde kinase (MLCK) er en almindelig effektor for β

1 integrin, cdc42 og TGFβ2 og dets aktivering er blevet impliceret i celleproliferation [36-38]. For at bestemme om aktivering af MLCK er involveret i LuCaP PDX celleproliferation, vi viralt transduceret en konstitutivt aktiv form af MLCK (A-TMK) i LuCaP PDX celler. A-TMK transduktion i LuCaP 86,2, 92, og 93 celler, der normalt ikke formere resulteret i celle klyngedannelse og positiv Ki-67-ekspression, mens celler transduceret med en tom vektor ikke viser celle clustering eller positiv Ki67 farvning (Fig 4A). Genanalyse fokus på cellecyklus regulatorer viste, at A-TMK-transducerede LuCaP celler udtrykte et opreguleret niveau af cyklin-afhængige kinase 6 (CDK6, 3-22 gange) og en samtidig nedreguleret niveau af E2F transskription faktor 4 (E2F4, 4 til 6 fold;. figur 4B)

A) LuCaP celler blev inficeret med lentivirus indeholder A-TMK (konstitutivt aktivere MLCK) viste positiv Ki67 farvning, mens celler transduceret med en tom vektor ikke gjorde. B) I LuCaP 86,2, 92, og 93, ektopisk ekspression af A-TMK inducerede en opregulering af CDK6 og en samtidig nedregulering af E2F4 sammenlignet med den for de tomme vektor-transducerede celler. Inhibering af MLCK med MLCK inhibitoren ML-7 undertrykt proliferation med C) afskaffe Ki67-ekspression, D) aftagende cellelevedygtighed vurderet ved WST-1 assay og E) nedregulering CDK6 ekspression. E2F4 udtryk blev ikke ændret ved ML-7. Green, EpCAM; Rød, Ki67; Blå, DAPI. Forstørrelse: 200x. Scale bar: 20 pm. ** P 0,01 sammenlignet med DMSO-kontrol. CDK6: cyclin-afhængig kinase 6; E2F4: E2F transkriptionsfaktor 4.

For at validere inddragelse af MLCK aktivering i celleproliferation, vi hæmmede MLCK i C4-2B celler, der let formere

in vitro

i et forsøg på at inhibere celleproliferation. Efter MLCK inhibering med MLCK inhibitoren ML-7, blev C4-2B celleproliferation reduceres som vist ved tabet af Ki67-farvning (Fig 4C), faldet i WST-1 absorbans (Fig 4D), og arrestationen af ​​celler i G1-fasen (S2 fig). Desuden blev faldet i celleproliferation ledsages af en 4,9-fold nedregulering i CDK6 mRNA-ekspression i C4-2B celler behandlet med ML-7 (p = 0,007). Ekspressionen af ​​E2F4 imidlertid udviste ikke en signifikant opregulering i C4-2B celler (Fig 4E). Tilsammen dataene antydede, at aktivering af MLCK spillede en rolle i at stimulere celleproliferation, som er forbundet med en opregulering af CDK6.

Overekspression af CDK6 letter spredning af LuCaP xenotransplantater

in vitro

for at validere opregulering af CDK6 forfremmet LuCaP PDX celleproliferation, vi inficerede LuCaP 86,2, 92, og 93 celler med lentivirus indeholder konstitutivt aktiv CDK6 vektor og undersøgte spredning. LuCaP 86.2, 92, og 93 celler, der normalt ikke prolifererer i fravær af BMSC imidlertid ektopisk ekspression af CDK6 fremmes celleproliferation som vist ved den positive Ki67-farvning (Fig 5).

LuCaP 86,2, 92 og 93 celler blev lentivirally transduceret at overudtrykke CDK6 og dyrket

in vitro

at vurdere spredning. Positive Ki67 indikerede, at CDK6 overekspression lettet proliferation i disse celler. Green, EpCAM; Rød, Ki67; Blå, DAPI. Forstørrelse: 200x. Scale bar: 20 pm

Diskussion

PCA celler kan forblive hvilende /dvale i år, og formere sig at danne aktive metastaser på fjerne steder.. Der vides kun lidt til dato om mekanismerne bag induktion og frigivelse fra dvale i PCA celler, der bor i knoglemarven. Større årsager omfatter manglen på patientprøver og relevant menneskelig

in vitro

og

in vivo

modeller. Vi har tidligere rapporteret en potentiel hviletilstand signatur forbundet med DTC isoleret fra PCA patienter uden tegn på sygdom [30]. Her, i stedet for at bruge immortaliserede PCA cellelinier, let formere

in vitro

, vi bruges klinisk relevante PDX celler for at undersøge den mekanisme underliggende direkte celle-celle-interaktion til at genoprette celleproliferation. Vi karakteriseret tre LuCaP PCA PDXs bosiddende på den menneskelige knoglemarv stroma, som viste rolige /hvilende og prolifererende fænotyper afhængig af celle seeding tæthed. Vores resultater viste, at tumor celle-celle-kontakt induceret celleproliferation som kan repræsentere hviletilstand undslippe via aktivering af β

1 integrin forbundet med universel nedregulering af TGFB2 signalering og opregulering af MLCK aktivering /CDK6 i PCa PDXs.

nylige undersøgelser i andre faste tumorer, såsom i hovedet, på halsen, og bryst, er impliceret elementer af cytoskeletale migration og adhæsion maskiner i aktiveringen af ​​indolent tumorceller [4-7, 38-41]. β

1 Integrin er kritisk for initieringen af ​​tumorigenese og opretholdelsen af ​​proliferative kapacitet tumorer [33, 41]. I PCa, fandt vi, at celle-celle kontakt, både mellem tumorceller og med en underliggende stroma, var forbundet med aktivering af β

1 integrin og var afgørende for at fremme væksten af ​​hvilende PCA xenograft celler

in vitro

. Mens celle-celle-kontakt har til vores viden ikke været direkte rapporteret som et krav for hviletilstand frigivelse, har adskillige mekanismer forbundet med migration og adhæsion af tumorceller blevet impliceret i denne proces. Specifikt aktivering af α

5β

1 integrin har vist sig at frigive humane pladecarcinom og brystcancerceller fra hviletilstand [6, 7, 39, 41], og aktivering af α

5 β

1 integrin inducere celleadhæsion og migrering [42, 43] samt spredning på ekstracellulære matrix [44]. Det er således ikke overraskende, at få mulighed for at komme i kontakt i knoglemarven mikromiljø, disse normalt hvilende LuCaP PDX celler begynder at formere

in vitro

.

Aktivering af β

1 integrin er blevet vist at inducere nedregulering af TGF β2 og Cdc42 [45, 46]. Global genekspression analyse af de reaktiverede celler versus hvilende celler fremhævet et fald i TGF β2 signalering i prolifererende PCa PDX-celler, som var konsistent med den iagttagelse, at TGF β2 induceret hviletilstand af malign DTC i hoved og hals pladecellecarcinom [47]. Dette er i overensstemmelse med de i data fra klinisk afledt DTC, der

TGFB2

udtryk er højere i PCA patienter uden tegn på sygdom, når sammenlignet med patienter med fremskreden sygdom [35]. Desuden Cdc42 blev impliceret i aktivering af p38 og vækst anholdelse i kræft [7] og blev nedreguleret i prolifererende PCa PDX celler i den aktuelle undersøgelse. Af note, MLCK er en velkendt nedstrømseffektor af adhesion- og motilitet-medierede mekanismer, herunder β

1 integrin [9, 10, 38, 40], og dens aktivering er blevet knyttet til celleoverlevelse [40]. I vores undersøgelse, at nedregulering af Cdc42 og TGFB2 pegede på en mulig aktivering af MLCK fører til celleproliferation. Faktisk indførelse af konstitutivt aktiv MLCK alene var tilstrækkelig til at fremkalde proliferation i LuCaP PDX celler, der normalt bevare hvilende

in vitro

. Omvendt C4-2B celler, som let prolifererer

in vitro

blev vækst undertrykkes ved behandling med MLCK inhibering ML-7. Disse data korrelerede godt med en tidligere undersøgelse fra Barkan og kolleger, at påviste ubevægelighed

in vitro

og hæmning af metastatisk udvækst af forskellige brystkræft cellelinier ved hæmning af MLCK [38].

I aktuelle undersøgelse, aktivering af MLCK resulterede i en opregulering af CDK6 i alle tre LuCaP PDX linjer. CDK 6 associerer med cyclin D1 til overgangen celler gennem G1 fasen af ​​cellecyklus [48] og reguleres af androgen receptor (AR) [49].