PLoS ONE: SELEX aptamer anvendes som probe til Detect Cirkulerende tumorceller i perifert blod af kræft i bugspytkirtlen Patients

Abstrakt

Mange undersøgelser har vist, at mængden og dynamik af cirkulerende tumorceller (CTCs) i perifert blod af patienter ramt af faste tumorer har stor relevans i terapeutisk effektivitet og prognose. Forskellige metoder baseret på forskellige strategier er blevet udviklet til at isolere og identificere CTCs, men deres effektivitet skal forbedres på grund af sjældenhed og kompleksitet CTCs. Denne undersøgelse er designet til at undersøge muligheden for at anvende en SELEX aptamer (BC-15) som en sonde til at identificere sjældne CTCs ud af baggrunden celler med kerne. Aptamer BC-15 blev udvalgt fra et tilfældigt oligonucleotid-bibliotek screenet mod human brystcancer væv. Fluorescensfarvning viste, at BC-15 havde en høj affinitet for kerner af humane cancercellelinier af forskellig oprindelse samt CTCs isoleret fra pancreas kræftpatienter, hvorimod dets bindingskapacitet for ikke-tumor bryst epitelceller og leukocytter var næsten upåviselig. BC-15

+ /CD45

– celler i kræftpatient blod viste sig også at være cytokeratiner 18-positive og aneuploide ved immunfluorescensfarvning og fluorescerende in situ-hybridisering, hhv. Endelig blev aptamer metode sammenlignet med den veletablerede anti-cytokeratin fremgangsmåde under anvendelse af 15 bugspytkirtelkræft patient blodprøver, og tælling indikerede ingen forskel mellem disse to metoder. Vores undersøgelse fastslår en hidtil ukendt måde at identificere CTCs ved anvendelse af en syntetisk aptamer probe. Denne nye tilgang kan sammenlignes med anti-cytokeratin-baserede CTC identifikationsmetode

Henvisning:. Zhang J, Li S, Liu F, Zhou L, Shao N, Zhao X (2015) SELEX aptamer Anvendes som Probe Detect Cirkulerende tumorceller i perifert blod af bugspytkirtelkræft Patienter. PLoS ONE 10 (3): e0121920. doi: 10,1371 /journal.pone.0121920

Academic Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: November 7, 2014 Accepteret: 5 februar 2015; Udgivet: 23 marts 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra High-tech R 4 um i diameter, intakte med rund-til-ovale morfologi med et DAPI-farvet kerne, og positive for CK eller BC-15 farvning og negativ for CD45 [18] .

aneuploid kromosom analyse ved hjælp af fluorescens

in situ

hybridisering (FISH)

kromosom tælling prober (CEP) 8 (Vysis, Des Plaines, IL, USA) blev denatureret i hybridiseringspuffer (0,15 M natriumchlorid, 0,015 M natriumcitrat, 70% formamid) ved 73 ° C i 5 min. Sonden blev derefter inkuberet med en side i et fugtigt kammer ved 42 ° C natten over efterfulgt af vask med 0,3% (vægt /volumen) NP-40 i 0,4x saltvand-natriumcitrat (SSC; 1x SSC indeholdende 150 mM NaCl og 15 mM na

3Citrate) ved 73 ° C i 2 minutter og med 2 x SSC /0,1% NP-40 ved stuetemperatur i 30 s. Efter kortvarigt tørring blev slides analyseret efter montering med DAPI montering medium (Vector Labs) under fluorescensmikroskop.

Statistisk analyse

Forskel mellem disse to identifikationsmetoder blev evalueret ved SPSS 19 (IBM, Armonk , NY, USA) software med Wilcoxon-test og sammenhængen mellem BC-15 og anti-cytokeratin resultater blev vurderet af parametrisk Spearmans rho værdi. En

P

-værdi af. 0,05 blev betragter som den statistiske signifikans

Resultater

BC-15 binder til kernen af ​​humane tumorceller specifikt

Vores tidligere undersøgelse viser, at BC-15 kan binde til brystcancerceller og væv med høj affinitet, hvorimod dets bindingskapacitet for ikke-tumorigene celler og normale brystvæv er meget lavere; foruden fluorescensfarvning, flowcytometrisk bekræftede, at BC-15 har en høj affinitet for tumorceller [12]. For at validere bindingen af ​​BC-15 til andre end brystcancerceller tumorceller, blev et sæt af humane cancerceller farvet med BC-15 (fig. 1). BC-15 signaler akkumuleret primært i kerner af kræftceller, men var meget lavere i udødeliggjort bryst epitel MCF10A celler. Ingen positive signaler blev observeret i nogen celler, når farvning med en tilfældig kontrol aptamer probe. This observationer antydede, at BC-15 udelukkende binder til kerner af cancerceller. Salg

Celler blev farvet med FITC-mærket BC-15 aptamer (Øverste række) eller FITC-mærket tilfældig kontrol aptamer (Midterste række, grøn). Alle cellerne blev modfarvet med 0,25% Evans blue i 10 min for at afsløre helcelle morfologi (rød). Nederste række viser CK immunfluorescensfarvning af forskellige typer af kræftceller. Disse dyrkede celler blev trypsiniseret, dryppet på de overtrukne objektglas, efterfulgt af farvning med Alexa 594 mærket anti-CK18 antistof og modfarvet med DAPI. PL45, pancreasadenocarcinom celle; MCF-7, brystcancer celle; A549, lungekarcinom celle; MDA-MB-231, brystcancer celle; HT-29, colon adenocarcinom celle; MCF10A, ikke-tumorogene immortaliserede mammaepitelceller. Scale bar, 20 pm.

BC-15

+ celler i patientens perifere blod er også CK-positive

Da BC-15 har en høj og specifik affinitet til CK -positive cancerceller af forskellig oprindelse (fig. 1 og fig. 2A), farvede vi patientprøver med BC-15. Morfologien af ​​BC-15

+ -celler er vist i fig. 2B. BC-15 signaler blev observeret udelukkende i cellekerner, som er magen til de tidligere beskrevne mønstre i humane cancerceller og væv. Endvidere har langt størstedelen af ​​BC-15

+ -celler var CD45

-, og BC-15-binding til leukocytter (CD45

+) blev ikke påvist (Fig 2B og 2C.). Bugspytkirtelkræft PL-45 celler og nogle bugspytkirtlen prøver kræftpatient, der farves positivt med anti-CK, blev derefter re-farvet af BC-15. Som vist i fig. 2B, BC-15 og CK-signaler faldt godt i både PL-45-celler (øverste række) og CTCs fra bugspytkirtlen prøver kræftpatient (nederste række). Derefter blev FISH eksperimenter med CEP8 udført for at verificere aneuploide karakter af BC-15

+ -celler. Som vist i fig. 2D, BC-15

+ /CD45

– celler var unormal i kromosom 8 opregning, mens de hvide blodlegemer (CD45

+) i baggrunden var diploid for kromosom 8. Udover enkelt og dublet CTCs, tumorcelle-lymfocyt blandede klynger blev også detekteret med BC-15 (figur 2C.); sådanne klynger har vist sig at være en mere nøjagtig prognostisk faktor for metastase sammenlignet med tilstedeværelsen af ​​enkelte cirkulerende tumorceller [17].

(A) BC-15

+ (grøn) og CK18

+ (rød) signaler faldt sammen i både PL-45-celler (øverste række) og CTCs fra bugspytkirtlen kræftpatienter (nederste række). (B) Morfologi af dispergerede CTCs fra pancreas kræftpatienter identificeret ved immunfluorescensfarvning. CTCs blev påvist som CD45

-celler med BC-15

+ kerner (grøn) og pilene i de nederste billeder af panel A indicat de hvide blodlegemer (CD45

+, rød). (C) Clustered CTCs anerkendt af BC-15 i blodprøver fra bugspytkirtlen kræftpatienter. Hvide pile angiver leukocytter (CD45

+). (D) Immunofluorescens af en BC-15

+ celler (bemærket af gul pil) blev standset, og det samme dias blev udsat for FISH ved hjælp af en CEP8 sonde. BC-15

+ celle havde et kromosom 8 aberration (7 eksemplarer), mens baggrunden leukocyt var diploid for kromosom 8 (hvid pil). Cellen er angivet med grøn pil blev ikke klassificeret som CTC grund af sin positivitet for både BC-15 og CD45. Scale barer, 10 um.

BC-15 har lignende effekt som anti-Ck8 /18/19 for at identificere CTCs

Anti-CK-baserede immunfarvning er en etableret metode til at påvise CTCs i mange systemer og viser relativ tilfredsstillende konsistens og repeterbarhed i forskellige former for kræft typer [19]. De maligne karakteristika CK

+ celler er også blevet bevist af FISH med forskellige CEP sonder. At sammenligne CTC identifikation kapacitet af BC-15 med den for anti-CK metoder, 15 perifere blodprøver fra patienter med pancreascancer (tabel 1) og 15 fra raske donorer blev indsamlet. Cellerne beriget fra disse prøver blev delt ligeligt og farvet ved siden af ​​hinanden ved hjælp af disse to metoder. Hverken metode påvist positive celler i prøver fra raske donorer. Af de 15 patienter prøver, 12 (80,0%) havde positive celler efter anti-CK-metoden, mens den positive sats var 73,3% (11/15) ved hjælp af BC-15 farvning. Det gennemsnitlige antal positive celler påvises ved anti-CK eller BC-15-farvning var 25,7 og 19,1 per prøve hhv. Ingen statistik forskel blev fundet mellem CTC tælling resultaterne af de to metoder ved Wilcoxon-test (

P

= 0,699), og der var signifikant sammenhæng mellem resultaterne af disse to forskellige CTC detektionsmetoder ved Spearman rang korrelation test (Spearman Rho = 0,810,

P

0,01)

diskussion

Som et surrogat af primære eller metastatiske tumorer, er CTCs viser stigende betydning både i. kræft forskning og klinisk praksis, og CTC afsløring har fået skærpet interesse i kræftforskningen samfund. I den foreliggende undersøgelse, vi med succes etableret et CTC detection system kombinerer en leukocytdepletering berigelse strategi og BC-15 aptamer identifikation. Denne påstand understøttes af følgende bemærkninger: (1) BC-15 anerkendte forskellige former for tumorceller specifikt og ikke-tumorigene epitelceller og leukocytter var negative for BC-15-farvning; (2) BC-15 havde samme farvning mønster i BC-15

+ /CD45

– celler beriget fra kræft i bugspytkirtlen patient blod som i kræftceller og tumorvæv; (3) BC-15

+ celler i kræftpatienter blod var CK

+ [20]; (4) BC-15

+ /CD45

– celler i blodet fra kræftpatienter viste aneuploidi, en cytogenetisk abnormitet typisk for maligne celler; og (5) CTC identifikation effekten af ​​BC-15 var den samme som for anti-CK metoder.

På grund af deres heterogeneic egenskaber og mesenchymale-epitelial overgang i omløb, CTCs ikke fuldt ud kan optælles ved antistoffer, målrette epiteliale markører (f.eks anti- CK) [21]. Imidlertid kunne aptamerer blive udviklet til at genkende subtile egenskaber og /eller lav-immunogene molekyler af maligne celler. Vores foreløbige resultater præsenteret her viser, at det er muligt at bruge en aptamer som en CTC afsløring sonde og også give perspektiver, der ville gøre CTC påvisning mere tilpasset og personlig. Selvom vores pilot resultater viser ingen forbedring på effekten af ​​CTC identifikation i forhold til antistof-baserede metoder, aptameren sonde lover godt for CTCs detektion (både isolation og identifikation) på grund af sin evne til at binde sig til forskellige former for molekylære mål, høj affinitet, veldefinerede syntese /modifikation proces, stabilitet og ensartethed. Med udgangspunkt i det veludviklede celle /vævs-SELEX teknik, er det muligt at frembringe særlig aptamerer med høj stabilitet ved hjælp tumorceller eller tumorvæv fra en given patient som at vælge mål [22]. Disse individualiserede aptamerer kan delvis overvinde svagheden rejst af ensartede antistoffer [23] og kan anvendes som vejledning molekylære målrette terapi eller anvendes til at overvåge terapeutisk respons og foregribe langsigtede prognose [22].

Tak

forfatterne vil gerne takke Nathan Ungerleider som hjalp på engelsk redigering af dette manuskript.