PLoS ONE: Mekanismer Underliggende kræft vækst og apoptose af DEK Overekspression i kolorektal Cancer

Abstrakt

Vores tidligere undersøgelse viste, at DEK protein blev overudtrykt i kolorektal cancer (CRC) sammenlignet med den normale kolorektal slimhinde. DEK var også signifikant korreleret med de prognostiske karakteristika patienter med CRC, hvilket viser, at DEK spillet en vigtig rolle i CRC progression. I dette arbejde, vi vurdere virkningerne af DEK på biologiske adfærd i CRC og udforske de relaterede molekylære mekanismer. Resultaterne viste, at DEK blev overudtrykt i humane CRC væv, og blev korreleret med Ki-67-indekset og den apoptotiske indeks. DEK tømt af RNAi i SW-620 og HCT116 celler faldt betydeligt celleproliferation, men steg celle apoptose. Opregulering af DEK var involveret i p53 /MDM, Bcl-2 familien, og caspase veje. Vores undersøgelse viser, at DEK fremmer væksten af ​​CRC, og kunne være et terapeutisk mål i CRC

Henvisning:. Lin L, Piao J, Ma Y, Jin T, Quan C, Kong J, et al. (2014) Mekanismer Underliggende kræft vækst og apoptose af DEK Overekspression i tyktarmskræft. PLoS ONE 9 (10): e111260. doi: 10,1371 /journal.pone.0111260

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: Juni 26, 2014, Accepteret: September 24, 2014; Udgivet: 23. oktober 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af den særlige fond af 973 profase Forskning fra National Ministeriet for Videnskab Teknologi Kina (2014CB560708), tilskud fra National Natural Science Funds i Kina (61.371.067), og videnskabelig grundforskning Fund af Jilin University i Kina (2013-01). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal carcinom (CRC) er den tredje mest almindelige malignitet og den næsthyppigste årsag til kræft død på verdensplan [1]. Livskvaliteten og 5-års overlevelse er lav i avancerede CRC’er selv med kirurgisk excision ledsaget af kemoterapi og strålebehandling. Tidlig påvisning af CRC er afgørende for en vellykket behandling, fordi avancerede high-grade sygdom er korreleret med forøget metastase og dødelighed [2] – [4]. Derfor identifikation af nye CRC mæglere og biomarkører, især dem der er forbundet med metastase og vækst, fortsat kritisk til bekæmpe dødeligheden fra tilbagevendende sygdom. Fremgangen i kræft patogenese kan hjælpe optrævle de vitale /gyldige molekylære biomarkører involveret i kolorektal carcinogenese og hjælpe med at udvikle og opdage nye terapeutiske indgreb, og forebyggende strategier og agenter. Vores tidligere data har vist, at DEK proteinekspression opreguleres i CRC væv [5]. Den overekspression er særlig markant i høj kvalitet og sen-fase CRC’er, hvilket gør DEK en potentiel ny biomarkør for prognosen for CRC og et mål i kampen mod tilbagefald [5].

DEK blev oprindelig opdaget som målet om en kromosomal translokation begivenhed t (6; 9) i en delmængde af akutte myeloide leukæmier [6] – [7]. Nu er DEK fremstår som et medlem af en ny klasse af DNA topologi modulatorer som kan være mål og effektorer af pro-tumorigene begivenheder [8]. DEK lokaliserer på kromosom 6p22.3 [9], og er et særdeles konserveret nukleoprotein, der kan phosphoryleres. Sammensat af 375 aminosyrer, er DEK hovedsagelig fordelt i kernen euchromatin, og fortrinsvis udtrykker i aktivt prolifererende og maligne celler, hvor det kan nå op til 4 til 6 millioner kopier pr nucleus [8]. Efterfølgende undersøgelser har gentagne gange identificeret DEK som ofte overudtrykkes gen i en række neoplasmer [10] – [12]. Endvidere kan DEK udøve virkninger på mRNA splejsning, transkriptionel kontrol, DNA beskadigelse reparation, differentiering, cellelevedygtighed og celle-til-celle signalering [11], [13] – [15]. Imidlertid har funktioner DEK

in vitro

i CRC cellulære adfærd ikke blevet evalueret. Tidligere viste vi, at DEK protein blev overudtrykt i 109 tilfælde af CRC væv, var signifikant korreleret til patienternes prognose egenskaber, og var en uafhængig risikofaktor for samlet overlevelse [5]. Denne undersøgelse bemærker ekspressionen af ​​DEK i en ny gruppe af indsamlede primære CRCs, og korrelerer DEK ekspression med Ki-67 og apoptotiske indeks, som afspejler bidrag celleproliferation og celletab hhv. Også vi præcisere, hvilken rolle DEK i CRC progression med DEK RNA-interferens (RNAi) i en cellelinie afledt af en CRC.

DEK er en inhibitor af p53-afhængige og -uafhængige cellulær senescens og apoptotiske fænotyper [ ,,,0],7], [14], [16], og transkriptionelt opreguleret af Rb /E2F-vejen, som ofte forstyrres i CRC [17] – [19]. Derfor dets ekspression er en stærk indikation af proliferation og apoptose. Her definerer vi specifikke onkogene aktiviteter DEK i CRC’er

in vitro

, og identificere en molekylær mekanisme, hvorigennem DEK bidrager til tumorvækst.

Metoder

Etik Statement

Alle deltagere gav skriftligt informeret samtykke til undersøgelsen, der overholdt Helsinki-erklæringen og blev godkendt af de menneskelige Etik og forskningsetik udvalg i Yanbian University Medical College i Kina. Gennem operationen samtykkeerklæring, blev alle deltagere oplyst, at resektion prøver blev opbevaret af hospitalet og potentielt anvendes til forskningsformål, og at deres privatliv ville blive opretholdt.

Vævsprøver

Frisk prøver fra fire tilfælde af CRC blev parret med tilstødende noncancerous væv, og blev inkluderet med rutinemæssigt behandles og diagnosticeres 55 tilfælde af kolorektal cancer væv, der blev udvalgt tilfældigt fra patienter, der gennemgår kirurgi mellem 2009 og 2012 på tumorvæv Bank of Yanbian University Medical College . De patologiske parametre blev nøje gennemgået i alle tilfælde. I alt 22 af de tilstødende normale colon mucosa væv fra kræft resektionsranden og 18 af de colorektale adenom væv blev også inkluderet. Ingen af ​​patienterne havde modtaget kemoterapi før kirurgi eller havde fjernmetastaser. De H . E-farvede objektglas blev revideret af to erfarne patologer (Lin Z, Jin T) og en passende paraffin blok blev udvalgt til denne undersøgelse

immunhistokemisk (IHC) analyse for DEK og Ki-67

IHC farvning metode og kriterier tolkning blev som tidligere beskrevet [5]. Kort fortalt, for at eliminere endogen peroxidaseaktivitet blev 4 um tykke vævssnit afparaffineret, rehydreret og inkuberet med 3% H

2O

2 i methanol i 15 minutter ved stuetemperatur (RT). Antigen genfinding blev udført ved 95 ° C i 20 minutter ved at placere objektglassene i 0,01 M natriumcitratbuffer (pH 6,0). Objektglassene blev derefter inkuberet med DEK antistof (1:50, BD Biosciences Pharmingen, CA, USA) og et monoklonalt muse-anti-Ki-67-antistof (klon: MIB-1, Dako, Glostrup, Denmarkat 4 ° C natten over efter. inkubering med biotinyleret sekundært antistof ved stuetemperatur i 30 minutter, blev objektglassene inkuberet med streptavidin-peroxidase-kompleks ved stuetemperatur i 30 min. Immunfarvning blev udviklet ved anvendelse af 3,3′-diaminobenzidin, og Mayers hematoxylin blev anvendt til kontrafarvning. Vi anvendte muse-IgG som en isotop kontroller. Desuden blev positive vævssnit forarbejdet mens udelade af det primære antistof som negative kontroller.

Både DEK og Ki-67 er normalt udtrykt i cellekernen. The IHC farvning for DEK var semi- kvantitativt scoret som ‘-‘ (negativ, ingen eller mindre end 5% positive celler), ‘+’ (5-25% positive celler), ‘++’ (26-50% positive celler) og “+++” ( mere end 50% positive celler). Kun mønsteret nukleare udtryk blev betragtet som positiv farvning, og stærkt positive betyder ‘++’ og ‘+++ “positive celler. Ki-67 indeks (antallet af Ki-67-positive tumorceller divideret med det samlede antal tumorceller × 100%) blev bestemt ved at tælle antallet af tumorceller i 20 tilfældigt udvalgte high-power felter (× 400).

apoptotisk assay i vævssnit af CRC

apoptotiske indeks blev målt under anvendelse en in situ apoptosis afsløring kit (Takara Bio, Otsu, Japan). Procedurerne farvende blev udført ved at følge producentens instruktioner. Efter rutinemæssig afparaffinering blev sektion vævet fordøjet med proteinase K (20 mg /ml i PBS) i 15 minutter ved stuetemperatur og vasket med PBS. Objektglas blev derefter inkuberet i 3% hydrogenperoxid i 5 minutter og vasket med PBS. TdT enzym og substrat blev pipetteret på sektionerne, som derpå blev inkuberet ved 37 ° C i 90 min. Efter vask blev anti-FITC HRP-konjugat tilsættes til objektglassene i 30 minutter. Objektglassene blev vasket, farvet med diaminobenzine (Nichirei, Tokyo, Japan), og modfarvet med hæmatoxylin. Den apoptotiske indeks (antallet af positive tumorceller divideret med det samlede antal tumorceller × 100%) blev bestemt ved at tælle antallet af tumorceller i 20 tilfældigt udvalgte high-power felter (× 400) [20]. De korrelationer mellem DEK udtryk og Ki-67 eller apoptotisk indeks blev evalueret i ovenstående humane CRC væv.

Western blotting

Primære antistoffer mod DEK (1:1000, BD, Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA), mutant-p53 (1:2000, Santa Cruz, CA, USA), MDM2 (1:2000, Santa Cruz, CA, USA), Bcl-2 (1:2000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), Bax (1:2000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), PARP (1:2000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), caspase-3 (1:2000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), caspase-8 (1:2000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), og caspase-9 (1:2000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA) blev anvendt.

friske vævsprøver af CRC blev formalet til pulver i flydende nitrogen og lyseret med SDS-PAGE-prøvebuffer. Sammenflydende celler blev lyseret i lysisbuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM natriumchlorid, 0,5 mM EDTA, 0,09 enheder /ml aprotinin, 1 mg /ml pepstatin, 10 mM phenylmethylsulfonylfluorid og 1 mg /ml leupeptin) . Lige proteinprøver (20 ug) blev separeret på 12% SDS polyacrylamidgeler og overført til PVDF-membraner. Membraner blev blokeret med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,1% Tween-20 i 1 time ved stuetemperatur. Membraner blev inkuberet med det primære antistof natten over ved 4 ° C. Membranen blev vasket 3 gange med TBST og inkuberet med HRP-konjugeret gede-anti-muse-IgG. (Cwbiotech, Beijing, Kina) og HRP-konjugeret gede anti-kanin IgG (Cwbiotech, Beijing, Kina) ved stuetemperatur i 2 timer. Derefter ekspression blev påvist under anvendelse af ECL prime western blotting påvisningsreagens (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige) ifølge producentens anvisninger. β-actin (Sigma, St. Louis, MO, USA) blev anvendt som indlæsning kontrol. Billeder blev taget med Champchemi Professional billedanalyse-system (Sagecreation, Beijing, Kina), og protein båndene blev kvantificeret ved hjælp LANE 1D software (Sagecreation, Beijing, Kina).

Reverse transskription-polymerasekædereaktion (RT PCR) og kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)

i RT-PCR, blev totalt RNA fra CRC prøver og cellelinjer ekstraheret ved anvendelse Trizol-reagens (Takara, Shiga, Japan) ifølge producentens instruktioner. Første-streng cDNA blev syntetiseret ved Prime Script revers transkriptase (Takara Bio, Dalian, Kina) og oligo (dT) ved at følge producentens instruktioner. Alle PCR-reaktioner blev udført i 20 ul reaktionsblanding, startende med 4 minutter ved 94 ° C til denaturering cDNA, derefter PCR-amplifikation blev udført i 23~36 cykler ved 94 ° C i 15 s og 53~58 ° C i 30 s at anneale primerne, og forlængelse af primerne ved 72 ° C i 1 min. Portioner af PCR-reaktionen blev fjernet efter forskellige antal cykler og blev resolveret ved elektroforese på 3% agarosegeler. Billeder blev taget med Champchemi Professional billedanalyse-system (Sagecreation, Beijing, Kina), og kvantificering blev udført med LANE 1D software (Sagecreation, Beijing, Kina).

Real-time PCR blev udført af en Bio- rad detektion sekvens ifølge producentens instruktioner under anvendelse af dobbeltstrengede DNA-specifik SYBR Premix Ex TaqTM II Kit (Takara, Shiga, Japan). Primersæt til specifikke gener er vist i tabel 1. Real-time PCR-reaktioner blev udført i tre eksemplarer, og tærskelcyklus numre (CT) blev bestemt på det niveau, der viste de bedste kinetiske PCR parametre. Kontrol uden template blev anvendt som negativ kontrol, og smeltekurver blev opnået for at bekræfte specificiteten af ​​PCR-produktet. En sammenlignende CT metode (2

-ΔΔCt) blev anvendt til måling af den relative kvantificering af DEK-genet.

Cellekultur og transfektion Salg

Humane colorektale cancercellelinier SW-620 , HT29, SW-480, og HCT116 blev købt fra Cell Bank of Chinese Academy of Medical Science (Shanghai, Kina), og bevares af Cancer Research center i Yanbian Universitet. Disse cellelinier blev dyrket i RPMI 1640 eller DMEM-medium (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) suppleret med 10% føtalt kalveserum, 2 mmol /l L-glutamin og 100 U /ml penicillin /streptomycin i befugtet 5% CO

2 ved 37 ° C

DEK siRNA (siDEK) målrettet det humane DEK-gen, og siRNA-duplexer med ikke-specifikke sekvenser blev anvendt som negative kontroller (siControl).; alle sekvenser blev designet og syntetiseret af RiboBio (RiboBio, Guangzhou, Kina) (tabel S1). Den siDEK anvendt i denne undersøgelse er vist i tabel 1.

MTT assay

En tusind celler per brønd blev inkuberet i plader med 96 brønde. Fireogtyve timer senere blev siControl og siDEK transficeret med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). De siDEK sekvenser blev tilsat i en dosis-afhængig måde ved 30 nM, 50 nM og 100 nM. Otteogfyrre timer senere, 5 mg /ml MTT blev tilsat til hver brønd. Efter inkubation ved 37 ° C i 4 timer blev supernatanterne fjernet omhyggeligt. Derefter 200 pi dimethylsulfoxid blev tilsat til hver brønd og brøndene blev grundigt blandet i 10 min. Absorbansværdien (OD) ved 560 nm af hver brønd blev målt ved anvendelse af mikroplade-læser (TECAN-uendelig M200 pro, Mannedorf, Schweiz).

Immunfluorescensfarvning

CRC cellelinie, SW- 620, blev dyrket på dækglas til 70% konfluens, og derefter fikseret i 4% paraformaldehyd i 10 minutter og permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 i 10 min efter 24 timer. Blokering blev udført med 3% okseserumalbumin fraktion V (Solarbio, Beijing, Kina) i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask med PBS blev cellerne inkuberet med muse-anti-humant DEK (1:50, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA) ved 4 ° C natten over, efterfulgt af inkubation med Alexa Fluor 568 ged anti-mus IgG (H + L) (A11004, 1:1000, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask med PBS blev cellerne kontrastfarvet med 49-6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Beyotime, Shanghai, Kina) og dækglas blev monteret med antifade Mounting Medium (Beyotime, Shanghai, Kina). Endelig blev immunofluorescens signaler visualiseret og registreres ved hjælp af Leica SP5II konfokalmikroskop [21].

Colony dannelse assay

Scrambled siDEK (SiControl) og siDEK transficeret SW620 cellelinje blev udsået i 10 cm retter på tætheden af ​​5 × 10

4 celler pr fad. Følgende dag blev mediet erstattet med medium indeholdende 800-1000 ug /ml G418 (Gibco, Gaithersburg, MD, USA). Efter omkring 7 dage, blev mediet erstattet. Assayet blev standset, når kolonierne var klart synlige selv uden at se under mikroskop, og det var omkring 2~3 ugers inkubation ved 37 ° C, 5% CO2. Derefter blev cellerne fikseret med 0,5% paraformaldehyd, farvet med krystalviolet og derefter talt efter definerede størrelse koloni [22].

Hoechst33342 farvning

Celler blev udpladet ved en tæthed på 1 x 10

4 celler /ml og blev dyrket i 2 til 4 dage indtil 80% til 90% konfluens. En cellulær densitet på 0,5-3,0 × 10

6 celler /ml blev opnået og fikseret i 10 minutter ved stuetemperatur med 3% paraformaldehyd (50 pi) før behandling med Hoechst 33342. Hoechst 33342 blev opløst i destilleret vand ved 25 mg /ml og tilsat til DMEM (Dulbeccos modificerede Eagles medium) med 2% FBS ved en slutkoncentration på 16 ug /ml i 15 min. Den apoptose blev beregnet ved at tælle 500 celler i et fluorescensmikroskop.

Flowcytometri

SW-620-celler blev dyrket i seks-brønds plader, og blev transficeret med siRNA-targeting DEK eller kapløbet siRNA i 48 timer med Lipofectamine 2000 Invitrogen, Carlsbad, CA, USA. Efter behandling blev cellerne høstet ved trypsin (0,25%) – EDTA og opsamlet ved centrifugering ved 1000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Celler blev vasket og resuspenderet i bindingsbuffer, før de mærkes med Annexin V-FITC og 7AAD i 20 min. Fluorescens (DNA-indhold) blev målt ved flowcytometri ved anvendelse af standard software. Celler, der var Annexin V-FITC (-) og 7AAD (-) blev anset levedygtige celler, mens celler, der var Annexin V-FITC (+) og 7AAD (-) blev anset tidlige fase apoptotiske celler. Celler, der var Annexin V-FITC (+) og 7AAD (+) blev anset sene apoptotiske celler.

Statistisk analyse

Hvert forsøg blev udført tredobbelt. Alle data blev udtrykt som middelværdien ± SD. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS 17.0 statistisk pakke (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA), og sammenligninger mellem grupper blev udført ved anvendelse af t-test. De korrelationer på DEK ekspressionsniveauer med CRC og histologiske faktorer blev analyseret under anvendelse af Fishers eksakte test. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant på

P

. 0,05

Resultater

DEK protein overudtrykt i CRC’er

For at demonstrere rolle DEK på CRC målte vi DEK proteinniveauer i fire tilfælde af CRC med matchede tilstødende ikke-tumor friske væv. Western blot data viste robust DEK protein-ekspression i CRC væv sammenlignet med matchede tilstødende ikke-tumorvæv (fig. 1).

(A) Billeder af Western blotting af DEK proteinekspression i fire matchede par af CRC ( T) og tilstødende ikke-tumorvæv (NT). (B) Relative T /NT forhold mellem DEK protein udtryk niveauer i parret CRC og tilstødende ikke-tumorvæv er vist (øget fold ændring, **

P

0,01).

DEK-proteinekspression viste en nuklear IHC farvningsmønster i CRCs (fig. 2). Antallet af celler indeholdende DEK protein (positiv) var signifikant højere i CRC væv (80,0%, 44/55) end i normalt tilstødende slimhinder (36,4%, 8/22), og i kolorektale adenomer (16,7%, 3/18) . Tilsvarende stærkt positiv sats på DEK-protein var 50,9% (28/55) i CRCs, hvilket var betydeligt højere end i det tilstødende normale colon mucosa (18,2%, 4/22), og i kolorektale adenomer (16,7%, 3/18) (Begge

P

0,001). (tabel 2)

(A) DEK protein farvning var negativ i tilstødende normale colon væv. (B) DEK protein viste diffust og stærkt nukleare positiv farvning i sen-fase CRC. (C) DEK protein er positiv i invasive kræftceller i serosa af colon. (D) DEK protein er negativ i CRC uden metastaser.

Korrelationer mellem DEK udtryk og Ki-67-indekset og apoptose indeks i humane CRC væv

Vi evaluerede korrelationer mellem DEK udtryk og Ki-67 og apoptotiske indeks i humane CRC væv. Ki-67-indekset var 26,60 ± 8,12% i væv med lave DEK ekspressionsniveauerne og 48,17 ± 7,87% i væv med høje DEK udtryk niveauer (Fig. 3A). DEK ekspressionsniveauerne og Ki-67-indekset var positivt korreleret (

P

= 0,030). Den apoptotiske indeks var 0,78 ± 0,10% i væv med lave DEK ekspressionsniveauer og 0,30 ± 0,16% i væv med høje DEK ekspressionsniveauer (fig. 3B). Der var også en signifikant sammenhæng mellem de DEK ekspressionsniveauerne og apoptotiske indeks (

P

= 0,010).

(A) Signifikante forskelle blev observeret i korrelere DEK udtryk og Ki-67-indekset (

P

= 0,030). (B) Der var også en signifikant sammenhæng mellem DEK udtryk og apoptotisk indeks (

P

= 0,010). . (DEK lav, “-” og “+”. DEK høj, “++” og “+++”)

DEK udtryk i CRC celler ved RT-PCR og western blot

IHC data vist ovenfor, og vores tidligere rapporterede data [5] tyder på, at DEK kan være involveret i udviklingen af ​​CRC’er og en god markør for spredning og metastaser. Således har vi opdaget ekspressionsniveauerne af DEK mRNA og protein i flere CRC cellelinjer, herunder SW-620, SW-480, HCT116, og HT29. RT-PCR-data viste, at al SW-620, SW-480, viste HT29 og HCT116 celler af høj ekspressionsniveauer af DEK mRNA (fig. 4A). Lignende resultater blev observeret for proteinniveauer af disse cellelinier ved Western blot-assays (fig. 4B). Her valgte vi SW-620 celler, som har høj spredning og metastaser potentiale bekræftes af tidligere rapporter [23], for følgende eksperimenter.

Effekter af DEK RNAi på celleproliferation af coloncancercellelinie , SW620

Vi transficerede SW-620-celler med DEK RNAi, og fandt, at DEK RNAi effektivt nedreguleret mRNA og protein ekspressionsniveauer af DEK i SW-620 celler ved immunfluorescensfarvning, RT-PCR, og Western blot analyser (fig. 5A-C).

(A) Nuclear lokalisering af DEK protein observeres i siControl og siDEK SW-620-celler. DEK (rød) lokaliseret til SW-620 cellekerner ved immunfluorescensfarvning og konfokal mikroskopi observation. DAPI-farvning (blå) blev inkluderet for at visualisere kernen. (B) DEK mRNA-ekspression i den humane CRC cellelinien SW-620 efter siControl og siDEK. (C) DEK proteinekspression i den humane CRC cellelinie SW-620 efter siControl og siDEK.

Virkningerne af DEK proteinekspression på cellevækst blev testet ved hjælp af en MTT assay. Væksthastigheden af ​​de 100 nM siDEK-behandlede celler faldt i en dosis-afhængig måde (Fig. 6A). De absorbansværdier af MTT-analysen efter 72 timer og 96 timer var 0,43 ± 0,02 og 0,62 ± 0,03 for siControl, og 0,35 ± 0,03 og 0,39 ± 0,02 for siDEK-transfekterede SW-620 celler, både

P

0,05, henholdsvis (figur 6B.). Desuden viste en koloni formation assay SW-620 celler blev effektivt reduceret i nærværelse af siDEK (100 nM). Til sammenligning siDEK inhiberede kolonidannelse i SW-620-celler med omkring 70% (

P

0,05) (. Figur 6C). Disse data viste, at der var en signifikant reduktion i cellevækst i siDEK-transficerede celler sammenlignet med siControl celler.

(A) MTT-assay viste siDEK (100 nM) efterligner reducerede signifikant proliferation af SW- 620 celler i forhold til siControl gruppen (

P

= 0,034). (B) MTT assay efter 24 timer, 48 timer, 72 timer og 96 h for siControl og siDEK-transficerede SW-620 celler, *

P

0,05 hhv. (C) Colony dannelse assay viste siDEK behandling hæmmede kolonidannelse i SW-620 celler med omkring 70% (

P

0,001).

Effekter af DEK udtryk på apoptose af SW-620 celler

Som vist i fig. 7A, efter SW-620-celler blev transficeret med 100 nM siDEK eller siControl, blev den apoptotiske steg betydeligt i siDEK SW-620-celler sammenlignet med siControl-transficerede SW-620-celler. Procentdelen af ​​Annexin V-FITC + /7AAD- celler var 13,13% i siDEK gruppen og 4,99% i siControl gruppen, hvilket indikerer, at DEK udtømning øget tidlig apoptose af SW-620 celler (fig. 7B).

(A) Hoechst33342 farvning viste, at knockdown af DEK-genet inducerede apoptose. (B) Transficerede siDEK i 48 h markant forøget debuterende apoptotiske celler angivet med en højere procentdel af Annexin V-FITC + /7AAD- celler i forhold til siControl gruppen.

Angivelse af p53 /MDM2, caspasefamilien, og Bcl-2 /Bax proteiner i siDEK-transficerede celler

Som vist i fig. 8A, ekspressionsniveauerne af mutant-p53 og MDM2 ekspression i siDEK-behandlede SW-620-celler faldt meget i Western blot-assays, hvilket antyder, at DEK stimulerer væksten af ​​SW-620-celler gennem p53 /MDM2 pathway. Endvidere blev ekspressionen af ​​Bcl-2 nedreguleret efter siDEK behandling. I modsætning hertil blev Bax udtryk opreguleret under de samme betingelser. Disse observationer antydede, at Bcl-2 /Bax-vejen spiller en vigtig rolle i SW-620 cellernes progression, der er reguleret af DEK (fig. 8B).

(A) mutant-p53 og MDM2-proteiner var signifikant nedreguleret i siDEK-transficerede SW-620-celler. (B) Forholdet mellem Bcl-2 /Bax blev reduceret betydeligt i siDEK-transficerede SW-620-celler. (C) PARP proteinekspression var meget højere i siDEK celler og caspase-3 og -9-proteinerne var signifikant lavere i siDEK-transficerede SW-620-celler end dem i siControl gruppen. Caspase-8 proteinniveauer forblev uændret.

Derudover vores data viste også, at spaltet caspase-3 og spaltes caspase-9 blev faldet i de siDEK celler, mens ekspressionsniveauet af caspase-8 ikke gjorde lave om. Imidlertid spaltes poly ADP ribose polymerase (PARP) ekspressionsniveauer øges med siDEK ansøgning. Disse data antydede, at caspase-3 og caspase-9, men ikke caspase-8 er involveret i SW-620-celle apoptose efter siDEK transfektion, hvilket viser, at siDEK også aktiveret caspase-afhængige pathways (Fig. 8C).

mekanismen for DEK funktion i CRC blev også bekræftet i en anden CRC HCT116, og fundet lignende resultater med det i SW620-celler. Dataene blev givet som suppleret figurer (fig. S1-S3).

Diskussion

DEK genamplifikation og opreguleret udtryk er blevet beskrevet i flere forskellige typer kræft, herunder hepatocellulært carcinom, blærecancer, og melanom [7], [16], [24]. Værker af Khodadoust et [7] al viste, at DEK ekspressionsniveauerne kan skelne benigne nævi fra maligne melanomer, hvilket indikerer, at dette protein kan vise sig meget nyttig for differentialdiagnoser. For nylig, Datta et al. [24] rapporterede, at oncoproteinet DEK blev opreguleret i blærekræft væv sammenlignet med normale modstykker, som bestemt ved Western blotting. Faktisk DEK-protein var til stede i udtømt urin fra patienter med lav- og høj kvalitet blære kræft, hvilket antyder, at DEK kunne bruges som en biomarkør til påvisning af blærecancer hjælp patientens urinprøver. Vores nuværende undersøgelse er den første til at rapportere om de onkogene aktiviteter DEK i CRC ved nedbrydende DEK, og definere funktionelle og molekylære mekanismer for DEK i CRC patogenese.

Vores tidligere undersøgelse [5] viste, at den stærkt positiv sats på DEK protein var 48,62% (53/109) i tarmkræft, hvilket var betydeligt højere end i enten tilstødende normal colon mucosa (9,17%, 10/109) eller kolorektale adenomer (13,46%, 7/52). DEK overekspression i CRC’er var positivt korreleret med tumorstørrelse, grad, lymfeknude metastaser, serøse invasion, sent tidspunkt, og sygdomsfri overlevelse og 5-årige overlevelsesrater. Yderligere analyser viste, at patienter med sen-fase CRC og høj DEK udtryk havde værre overlevelsesrater end dem med lav DEK udtryk. Desuden viste multivariat analyse høj DEK udtryk, serøse invasion, og sent tidspunkt er væsentlige uafhængige risikofaktorer for dødelighed i CRC. I dette arbejde, analyser western blot og IHC farvning viste, at høj DEK udtryk var signifikant mere almindelig i CRC væv end i både tilstødende normal kolorektal slimhinde eller kolorektale adenomer.

Ki-67 antigenet udtrykkes ved prolifererende celler under G1, S, G2, og M-faser, men ikke i G0 fase (hvilende celler) [25]. Ki-67 anvendes som markør for tumor spredning og aggressivitet, og det kan have en stor indvirkning på prognosen for patienter med CRC [26] – [27]. Vore tidligere resultater viste, at DEK proteinekspression mønster var meget lig den Ki-67-antigenet som en prolifererende markør i uterine livmoderhalskræft [28]. En positiv korrelation mellem DEK udtryk og Ki-67 eller apoptotisk indeks i CRC væv blev også fundet i denne undersøgelse.

Wise-Draper et al. [29] anvendte RNAi tilgange for den specifikke målretning af DEK i cancer og primære celler, og fandt, at DEK udtømning i HeLa cervical cancerceller resulterede i induktion af apoptose. Lignende resultater blev opnået med primære humane keratinocytter, implicerer DEK som kræft og primær celle overlevelse faktor. I denne undersøgelse har vi bemærket også sammenhængen mellem DEK overekspression og mere maligne adfærd af CRC ved hjælp SW-620 og HCT116 human CRC-celler med og uden RNAi behandling. Celleapoptosen analyse afslørede, at DEK udtømning øget tidlig apoptose af SW-620 og HCT116-celler. Trods dette har vi også observeret, at DEK depletering inhiberede cellevækst i en MTT assay og kolonidannelse assayet. Disse resultater er aftalt med resultaterne af Ki-67 og apoptose indeks i CRC vævsprøve. Vores resultater viser, at DEK regulerer CRC cellevækst og overlevelse

in vitro

.

Det humane p53-protein er den hyppigst inaktiverede tumor-suppressor gen i human cancer og er involveret i reguleringen af ​​celleproliferation som reaktion på stress [30]. Men p53 har en kort halveringstid og fastholdes på et lavt eller ikke-detekterbare niveauer ved løbende proteolytisk nedbrydning i normale celler. Vedvarende nedbrydning af p53 medieres hovedsageligt af E3-ligase MDM2 [31]. Ved at binde p53, MDM2 blokerer transaktiveringsdomænet af p53 og hæmmer derfor sin transkriptionsaktivitet [32]. Udfordret med stress signaler, såsom hypoksi eller DNA-beskadigelse, er tilbagekoblingssløjfen af ​​MDM2-p53 forstyrret, hvilket fører til apoptose eller malignitet [33]. Khodadoust undersøgelse foreslået en ny rolle for DEK i celle overlevelse, involverer destabilisering af p53 på en måde, der sandsynligvis vil bidrage til menneskers carcinogenese [7]. Desuden Wise-Draper et al. ligeledes, at celledød som respons på DEK depletering blev ledsaget af forøget stabilitet protein og transkriptionel aktivitet af p53 tumor suppressor, og efterfølgende opregulering af kendte p53-målgener, såsom Bax [29]. Bax, et pro-apoptotisk faktor for Bcl-2-familien, er beliggende i en monomer form i cytosolen eller løst fæstnet til membranerne under normale forhold. Efter en død stimulus, cytosolisk og monomert Bax translokere til mitokondrierne, hvor de bliver integrale membranproteiner.