PLoS ONE: MDM2-medieret Nedbrydning af p14ARF: A Novel mekanisme til kontrol ARF Niveauer i kræftceller

Abstrakt

Vi viser her et nyt forhold mellem den menneskelige p14ARF oncosuppressor og MDM2 oncoproteinet. MDM2 overekspression i forskellige cancercellelinier forårsager p14ARF reduktion inducerende dens nedbrydning via proteasomet. Virkningen kræver ikke ubiquitin-ligaseaktivitet af MDM2 og fortrinsvis forekommer i cytoplasmaet. Interessant behandling med inhibitorer af PKC (proteinkinase C) pathway og anvendelse af p14ARF phosphorylering mutanter indikerer, at ARF phosphorylering kunne spille en rolle i MDM2 medieret ARF nedbrydning forstærkende vores tidligere observationer, at ARF phosphorylering påvirker dets stabilitet og biologiske aktivitet. Vores undersøgelse afdækker en ny potentielt vigtig mekanisme, hvorigennem ARF og MDM2 kan opveje hinanden under tumorigen proces

Henvisning:. Vivo M, Matarese M, Sepe M, Di Martino R, Festa L, Calabro V, et al. (2015) MDM2-medieret Nedbrydning af p14ARF: A Novel mekanisme til kontrol ARF Niveauer i kræftceller. PLoS ONE 10 (2): e0117252. doi: 10,1371 /journal.pone.0117252

Academic Redaktør: Thomas G. Hofmann, tysk Cancer Research Center, TYSKLAND

Modtaget: Juni 23, 2014, Accepteret: December 19, 2014; Publiceret: 27 februar 2015

Copyright: © 2015 Vivo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Legge Regionale (Regione Campania) nr 5/2007 til AP og GLM og Progetto “Campania Forskning i Experimental Medicine” (CREME). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kendskab til de mekanismer, der gælder for ubalance mellem tumor undertrykkere og onkogener, er afgørende for forståelsen af ​​patogenesen og udviklingen af ​​kræft.

Blandt de vigtigste tumorsuppressorer, p14ARF (mus p19ARF) (Alternative Læsning Frame) synes at spille en stor rolle, er dets direkte bidrag til kræft stort set demonstreret i de seneste år [1,2].

ARF er involveret i onkogen checkpoint ved sensibiliserende begyndende kræftceller til at undergå vækst anholdelse eller apoptose. Der er stigende tegn på, at ARF signalering er kompleks og involverer p53-afhængige eller uafhængige veje sigter primært på at nedskære unormal cellevækst og at opretholde genomisk stabilitet. Opdagelsen af ​​en overflod af ARF interaktionskandidater og den iagttagelse, at også viral, genotoksisk, hypoksisk og oxidative stress aktivere en ARF respons, antyder, at ARF har et bredere rolle at beskytte cellen [3]. Primære celler i normale omstændigheder holde ARF i lave niveauer; men når celler stimuleres af onkogene fornærmelser, dets koncentration i cellen drastisk øger. Dette fænomen er generelt ledsages af en parallel afbrydelse af den inhibitoriske interaktion mellem Mdm2 og p53, hvilket resulterer i akkumulering af transkriptionelt aktive p53 som stimulerer enten apoptose eller cellecyklusstandsning [4, 5]. Den stærke ARF effekt på celleproliferation kræver, at celler bør have udviklet mekanismer, der hurtigt kan reducere ARF intracellulære niveauer, når dens aktivitet er ikke mere påkrævet. Imidlertid er de mekanismer, der regulerer ARF omsætning først for nylig vil blive belyst. ARF nedbrydning afhænger i det mindste delvist, på proteasomet, og selv om ARF mangler lysinrester i dets sekvens, kan det undergå N-terminale ubiquitinering uafhængigt af Mdm2 og p53 [6]. Ganske nylig, en specifik ubiquitinligase for ARF kaldet ULF blev identificeret [7]. På den anden side er der beviser, at ARF kan nedbrydes

in vitro

af 20S proteasom i fravær af ubiquitinering, og at denne proces kan modvirkes ved TBP-1 (Tat-bindende protein 1), en multifunktionel komponent af den regulatoriske subunit af proteasomet [8]. Desuden har REG γ proteasom været impliceret i ubiquitin-uafhængig regulering af p19ARF omsætning, støtter opfattelsen af, at ubiquitinering kan ikke nødvendigvis impliceret i ARF omsætning [9].

Interessant vi og andre nylig vist, at efter PKC (proteinkinase C alfa) aktivering, ARF stiger [10, 11]. Endvidere en punktmutation, der efterligner phosphorylering i den konserverede Thr8 inducerer ARF akkumulering hovedsageligt i cytoplasmaet og inhiberer dets biologiske aktivitet [11].

Hidtil ARF subcellulære lokalisering synes at spille en vigtig rolle i dens stabilitet og biologiske funktioner, men i ikke utvetydig måde. Det fremgår, at nucleolar lokalisering af ARF kan tjene til oplagring eller stabilisering [12,13]. I nucleolus, antager ARF en stabil struktur takket være dets associering til B23 /NPM, mens i nukleoplasma er underkastet en hurtigere omsætning. I nogle tilfælde, at stigningen i ARF niveauer forårsager Mdm2 at flytte til nucleolus [14, 15], og dette har været forbundet med p53 stabilisering. Andre rapporterede, at selv nucleolar lokalisering af ARF forårsager dets stabilisering, dette ikke er væsentligt at regulere ARF aktivitet hen imod p53 [16, 17]. Interessant nok er det blevet rapporteret, at ikke-nucleolar former af ARF underkastes hurtig nedbrydning af proteasomet, med MDM2 spiller en rolle i moduleringen af ​​dette fænomen, selv med mekanismer langt fra er fuldt belyst [18]. MDM2 har mangesidede roller i proteinnedbrydning. Faktisk bort fra dets velbeskrevet rolle som E3-ubiquitin-ligase, MDM2 er i stand til at shuttle P63 til cytoplasmaet mediere dens interaktion med proteiner specifikt involveret i omsætningen [19]. Desuden har MDM2 vist sig at mediere proteasom-afhængige, men ubiquitin-uafhængig nedbrydning af p21Waf1 /Cip1 [20] og af retinoblastom-proteiner [21]. For nylig er det blevet rapporteret, at MDM2 kan interagerer med komponenter af 19S proteasomet [22] hævder en bredere betragtning af sin virkningsmekanisme. Vi her undersøge om en ny indbyrdes forhold mellem ARF og Mdm2 hvor Mdm2 synes at være impliceret i reguleringen af ​​ARF omsætning medierende sin nedbrydning gennem proteasomet.

Resultater

Mdm2 overekspression forårsager p14ARF nedbrydning gennem proteasomet

for at analysere potentialet inddragelse af MDM2 i reguleringen af ​​p14ARF protein stabilitet vi overudtrykt en MDM2 ekspressionsplasmid i forskellige menneskelige og mus cellelinjer, der til stede eller mangler påviselige niveauer af p53 og /eller MDM2. Som fig. 1 viser, p14ARF endogene niveauer i både H1299 og HeLa-celler lineært falde, når stigende mængder af MDM2 ekspressionsplasmid blev transficeret (fig. 1, A og B). Real-Time PCR analyse på RNA ekstraheret fra MDM2 transficerede HeLa og H1299-celler viser ingen signifikante ændringer i den relative mængde af ARF-mRNA (fig. 1C), hvilket indikerer, at MDM2 virkning opnås på post-transkriptionel niveau. Desuden MDM2 overekspression resulterer også i reduktion af eksogent udtrykte ARF protein i flere humane og mus cellelinjer (fig. 1D, E og F), uanset p53 status, hvilket indikerer, at MDM2 påvirker ARF protein stabilitet i en p53-uafhængig måde. Vigtigere, reduktion af endogene MDM2 intracellulære niveauer af siRNA forårsager en forøgelse af ARF endogene niveauer i både HeLa og H1299-celler, hvilket yderligere bekræfter, at endogen MDM2 kan styre p14ARF overflod (fig. 2). Vi undersøgte således ARF protein stabilitet i nærvær eller fravær af MDM2 overekspression efter udsættelse for cycloheximid til blokering proteinsyntese. På de angivne tidspunkter efter eksponering for lægemidlet blev celler høstet og ekstrakterne blev analyseret ved Western Blot. Fig. 3A og B viser, at endogene p14ARF halveringstid sænkes efter MDM2 overekspression.

A H1299 celler var mock transficeret (første bane) eller transficeret med stigende mængder af MDM2 ekspressionsplasmid (0.3-0.6-0.9 ug). Effekt på p14ARF intracellulære niveauer blev bedømt ved Western Blot på hele proteinlysater probet med anti-ARF og, som kontrol, med anti-MDM2 og anti-actin. B HeLa-celler blev mock transficeret eller transficeret med MDM2 ekspressionsplasmid (0,3-0,6 ug) og analyseret som i

A

. C Real Time relativ kvantificering af ARF ekspression i H1299 og HeLa-celler. Celler blev transficeret ved elektroporering med MDM2 plasmid (4×10

6 celler /2,5 ug af MDM2 ekspressionsplasmid) og underkastes RNA-ekstraktion og QRT-PCR-analyse. ARF RNA-niveauer blev normaliseret i forhold til 18s RNA. Værdier i grafen repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige forsøg. Standardafvigelse er vist. D U2OS, E H1299 og F MEF p53

– /- MDM2

– /- celler blev transficeret med et fast beløb på p14ARF udtrykke plasmid (0,3 ug første bane) alene eller med stigende mængder af MDM2 udtrykker plasmid (0,3 -0.6-0.9 ug). Effekt på p14ARF niveauer blev bedømt ved Western Blot på hele proteinlysater, probet med anti-ARF eller anti-Xpress (til påvisning exogent udtrykt ARF) og, som kontrol, med anti-MDM2 og anti-actin. Western Blot vist er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. ARF båndintensiteter blev kvantificeret af Image J software, actin normaliseret og udtrykt som fold berigelse i forhold til ubehandlede prøver vilkårligt sat til 1 (se materialer og metoder for detaljer).

H1299 og HeLa-celler blev behandlet med enten MDM2 eller negativ kontrol rettet siRNA (10 nM slutkoncentration), og efter 72 timers inkubation opsamles og analyseres ved Western-blot og og QRT-PCR som beskrevet i Materialer og Metoder.

A Half -Life analyse i nærvær eller fravær af MDM2 overekspression. HeLa-celler blev mock transficeret eller transficeret med MDM2 ekspressionsplasmid (0,6 ug). 24 timer efter, cycloheximid blev tilsat, og cellerne blev høstet ved de angivne tidspunkter. Lysater blev analyseret ved Western blot med anti-ARF, anti-actin og anti-MDM2. B Plottet betegner halveringstid analyse af ARF i nærvær eller fravær af MDM2 overekspression. Båndintensiteter blev kvantificeret af Image J software og actin normaliseret før de afbildet i grafen. Mængden af ​​protein til forskellige tidspunkter udtrykkes som procent af total protein, dvs. proteinmængde ved t0. Hver profil repræsenterer middelværdien af ​​tre uafhængige transfektioner og Western blot eksperimenter. Standardafvigelser er også vist. C U2OS celler blev transficeret med et fast beløb på p14ARF ekspressionsplasmid (0,3 ug) og stigende mængder af MDM2 ekspressionsplasmid hvor det er angivet (0,3-0,6 mg). 24 timer efter transfektion blev cellerne behandlet med 10 pM MG132 (bane 4-6) eller DMSO (bane 1-3). Niveauer af p14ARF blev analyseret ved Western Blot på hele proteinlysater, probet med anti-ARF og, som kontrol, med anti-MDM2 og anti-actin.

Vi næste spurgt, om proteasomet er involveret i MDM2-medieret p14ARF nedbrydning. For at udforske denne hypotese, vi transficeret U2OS celler med et fast beløb på p14ARF og stigende mængder af MDM2 og behandlede celler med proteasominhibitoren MG132. Western Blot i fig. 3C viser konsekvent, at behandling med proteasominhibitor modvirker MDM2 effekt, angiver proteasom som den endelige effektor af MDM2 handling på ARF.

ARF nedbrydning af MDM2 kræver protein-protein interaktion

fysisk interaktion mellem p14ARF og MDM2 har været genstand for intensive undersøgelser og flere interagerende domæner er blevet identificeret i p14ARF der bidrager til binding til MDM2 [14, 17, 23, 24]. Derfor besluttede vi at analysere, hvilke områder af ARF er nødvendige for at observere MDM2 effekt på p14ARF. Vi gjorde derfor brug af to forskellige ARF deletionsmutanter, ARF

1-65, omfatter exon 1β af p14ARF og ARF

65-132, svarende til ARF exon 2. Co-immunopræcipitering i U2OS celler viste, at ARF

1-65 mutant er i stand til at interagere med MDM2 mens bevarer kun exon 2 (ARF

65-132) er ikke (fig. 4A), hvilket bekræfter en stor rolle i exon 1β i binding MDM2 [23, 24]. De to ARF deletionsmutanter blev derefter transficeret sammen med stigende mængder af MDM2. Som fig. 4B og C viser klart, den aminoterminale halvdel af p14ARF (ARF

1-65) vises nedbrydes af MDM2 overekspression, mens den C-terminale halvdel (ARF

65-132) er ikke påvirket, understøtter en rolle bindingen mellem proteinerne i MDM2 medieret ARF nedbrydning.

A U2OS celler blev transficeret med samme mængde (1 ug) af MDM2 og enten 3xFlagARF

1-65 eller 3xFlagARF

65-132 udtrykkende plasmider, som angivet. Lige store mængder proteinekstrakt blev immunfældet med anti-MDM2 antistof og afsløret ved Western blot med anti-MDM2 og anti-Flag at afsløre ARF. B U2OS celler blev transficeret med 0,3 ug 3xFlagARF

1-65 (udtrykkende exon 1β af p14ARF) (første bane) alene eller med stigende mængder af MDM2 ekspressionsplasmid (0.3-0.6-0.9 ug). Niveauer af p14ARF blev analyseret ved Western Blot på hele proteinlysater, probet med anti-ARF og, som kontrol, med anti-MDM2 og anti-actin. C U2OS celler blev transficeret med 0,3 ug 3xFlag ARF

65-132 plasmid (udtrykkende exon 2 i p14ARF) (første bane) alene eller med stigende mængder af MDM2 ekspressionsplasmid (0.3-0.6-0.9 ug). Niveauer af p14ARF blev analyseret ved Western Blot på hele proteinlysater probet med anti-ARF og, som kontrol, med anti-MDM2 og anti-actin. D U2OS celler blev transficeret med 1 ug af både ARFΔ

2-14 /82-101 og MDM2 ekspressionsplasmid som angivet. Lige store mængder proteinekstrakt blev immunfældet med anti-ARF antistof og afsløret ved Western blot med anti-MDM2 og anti-ARF. E U2OS celler blev transficeret med 0,3 pg ARFΔ

2-14 /82-101 og stigende mængder af MDM2 ekspressionsplasmid hvor det er angivet (0,6-0,9 mg). Niveauer af endogene p14ARF blev analyseret ved Western Blot på hele proteinlysater probet med anti-ARF og, som kontrol, med anti-MDM2 og anti-actin.

Desuden analyserede vi kapaciteten af ​​MDM2 til inducerer nedbrydning af en ARF sletning mutant (ARFΔ

2-14 /82-101) mangler de nukleare /nucleolar lokalisering signaler [14]. Interessant denne mutant viser en fremherskende cytoplasmatisk lokalisering [14] og bevarer evnen til at binde (Fig. 4D) og blive nedbrudt af MDM2 (fig. 4E).

Bortset den veletablerede rolle som ubiquitinligase, MDM2 kan påvirke protein turnover også gennem en ubiquitin uafhængig mekanisme, inducere en direkte sammenslutning af målproteiner med proteasomet [22]. For at skelne mellem disse muligheder, vi analyserede effekten af ​​en MDM2 mutant mangler den ubiquitinligase ringfinger domæne (MDM2

1-441) (fig. 5A) [25] på eksogent udtrykte ARF niveauer. Interessant denne mutant er i stand til at inducere ARF nedbrydning ved overekspression (fig. 5B), hvilket viser, at MDM2 ubiquitin ligase domæne af MDM2 er undværlig for den observerede virkning på ARF. Dernæst analyserede vi effekten af ​​en MDM2 sletning mutant (MDM2Δ

150-230) (fig. 5A), at der mangler både import (NLS) og eksport (NES) nukleare positionsbestemmelsessignaler viser en udbredt cytoplasmatisk lokalisering [25 ]. Ved overekspression i U2OS celler, denne mutant inducerer nedbrydning af eksogent udtrykte ARF (fig. 5C), hvilket indikerer, at ARF nedbrydning ikke kræver MDM2 lokalisering i kernen. Co-immunopræcipitationsforsøg indikerer, at begge MDM2 mutanter er i stand til at binde ARF, styrke følelsen at bindingen mellem de to proteiner kunne spille en rolle i den observerede virkning (fig. 5D).

A Ordningen angiver MDM2 mutanter, der er beskrevet i denne figur [25]. B U2OS celler blev transficeret med et fast beløb på p14ARF udtrykke plasmid (0,3 ug) og stigende mængder af MDM2

1-441 udtrykke plasmid (0.3-0.6-0.9 ug). Niveauer af p14ARF blev analyseret ved Western Blot på hele proteinlysater probet med anti-ARF og, som kontrol, med anti-MDM2 og anti-actin. C U2OS celler blev transficeret med et fast beløb på p14ARF udtrykke plasmid (0,1 mg) og stigende mængder af MDM2Δ

150-230 udtrykke plasmid (0.5-1-1.5-2-2,5-3 ug). Niveauer af p14ARF blev analyseret ved Western Blot på hele proteinlysater probet med anti-ARF og, som kontrol, med anti-MDM2 og anti-actin. D U2OS celler blev transficeret med samme mængde (1 ug) af p14ARF udtrykkende plasmid og MDM2

1-441 eller MDM2Δ

150-230 udtrykkende plasmid. Lige store mængder proteinekstrakt blev immunfældet med anti-ARF antistof og afsløret ved Western blot med anti-MDM2 og anti-ARF.

The MDM2-medierede ARF nedbrydning forekommer hovedsagelig i cytoplasmaet

beviser for, at en MDM2 mutant, ude af stand til at lokalisere i kernen, inducerer ARF nedbrydning, sammen med den observation, at en ARF mutant viser en overvejende cytoplasmatisk lokalisering (ARFΔ

2-14 /82-101) er tilbøjelig til MDM2 medieret nedbrydning, fører til forslaget om, at MDM2 inducerede ARF nedbrydning ved MDM2 overekspression kan forekomme i cytoplasmaet. Dette fik os til at verificere evne MDM2 at nedbryde ARF i celler behandlet med Leptomycin B (LMB), kendt for at blokere MDM2 shuttling til cytoplasmaet [26]. Til dette formål blev U2OS celler transficeret med en fast mængde ARF behandlet eller ikke med Leptomycin B i nærvær eller fravær af ektopisk MDM2. Som vist i fig. 6A, Leptomycin B behandling ikke alene afgør ophobning af ARF, men endnu vigtigere, modvirker MDM2 effekt på ARF, stærkt indikerer, at tvungen nukleare MDM2 lokalisering forhindrer dens evne til at påvirke p14ARF omsætning.

A U2OS celler blev transficeret med 0,5 ug af ARF ekspressionsplasmid alene (bane 1, 2) eller i kombination med 1 ug af MDM2 ekspressionsplasmid (bane 3, 4). 24 timer efter transfektion blev celler behandlet med Leptomycin B (bane 1 og 3) eller methanol (bane 2 og 4). Total celleekstrakter har været underkastet Western Blot og analyseret med anti-ARF, anti-MDM2 og anti-actin-antistoffer. B HeLa-celler blev transficeret med stigende mængder af MDM2 ekspressionsplasmid (1 og 1,5 ug). 24 timer efter transfektion blev cellerne behandlet med enten DMSO, TPA eller Bisindolylmalemide og analyseret med anti-ARF, anti-MDM2 og anti-actin-antistoffer i Western Blot. C HeLa-celler blev transficeret med PKCa siRNA eller negativ kontrol siRNA (siRNActrl). 48 timer senere blev celler mock transficeret eller transficeret med stigende mængder af MDM2 udtrykkende plasmid hvor det er angivet (0,6 og 0,8 ug plasmid-DNA). Total celleekstrakter blev analyseret ved Western blot med anti ARF, anti-MDM2 og anti-actin-antistoffer. D U2OS celler blev transficeret med 0,3 ug af enten ARFT8A eller ARFT8D alene (første baner) eller i kombination med stigende mængder af MDM2 ekspressionsplasmider (0.3-0.6-0.9 ug). 24 timer efter transfektion celleekstrakter blev udsat for Western Blot med anti ARF, anti-MDM2 og anti-actin.

MDM2 medieret ARF nedbrydning forhindres på PKC-aktivering.

Vi har for nylig påvist, at TPA (en kendt aktivator af signaltransduktion enzym PKCa) behandling resulterer i en forøgelse af ARF cytoplasmatisk pool [11]. Her behandles vi, om PKC-aktivering kan påvirke MDM2-medieret ARF nedbrydning. Til dette formål har vi behandlede HeLa-celler, transficeret med stigende mængder af MDM2, med enten TPA eller Bisindolylmalemide (Bim, en inhibitor af PKC-aktivering). Fig. 6B viser, at Bim behandling, som forventet, inducerer et fald på ARF. Interessant, MDM2 overekspression sænker ARF niveauer yderligere i forhold til kontroller. Omvendt TPA behandling meste modvirker MDM2 induceret nedbrydning af p14ARF, tyder på, at PKC pathway ikke bør aktiveres for at opnå effektiv MDM2-medieret ARF nedbrydning. For yderligere at analysere PKC rolle i MDM2 medieret ARF nedbrydning blev U2OS celler behandlet enten med PKC α specifikke siRNA eller kontrollere siRNA og transficeret med stigende mængder af MDM2 (Fig. 6C). Overekspression af MDM2 i si-ctr udtømte celler inducerer ARF nedbrydning som forventet. Interessant, vi observerer et fald på ARF niveauer upon PKC udtømning i fravær af MDM2 overekspression (sammenlign bane 5 med bane 2). Dette er i overensstemmelse med den observation, at PKC-aktivering inducerer en stigning i ARF protein niveauer og PKC inaktivering forårsager et fald i ARF-niveauer (Vivo et al., 2013 og fig. 6B). Vi faktisk observeret, at også MDM2 niveauer er negativt reguleret af PKC udtømning, (sammenlign bane 5 med bane 2). Vigtigere er det, efter aftale med vores tidligere eksperimenter, MDM2 overekspression i PKC udtømte celler kan stadig reducere ARF protein niveauer (sammenlign bane 5 med baner 6 og 7).

For at gå dybere inde potentielle rolle ARF fosforylering i MDM2 medieret ARF nedbrydning, vi gjort brug af to point mutanter, den ARFT8D og ARFT8A hvor threonin 8 er blevet erstattet, for at efterligne, henholdsvis en phosphoryleret og en ikke phosphoryleret form for ARF [11]. Interessant nok dephosphorylerede form af ARF (T8A mutant) er meget ustabil, med en relativ kort halveringstid, mens T8D konsekvent ligger beriget i det cytoplasmatiske rum [11].

Begge mutanter blev transficeret i U2OS celler sammen med stigende mængder af MDM2. Interessant synes mere modstandsdygtige over for MDM2 medieret nedbrydning phospho-mimetiske T8D mutant, mens T8A mutanten forekommer mere fornuftigt at MDM2 virkning (fig. 6D og 1D), hvilket bekræfter, at phosphorylering udøver en beskyttende rolle på ARF.

Dette resultat rejste den hypotese, at den fremherskende kernelokalisering af ARF (T8A og WT-proteiner) kan være et resultat af en effektiv clearance af dephosphoryleret, og dermed ustabil, ARF protein fra cytoplasmaet. For at udforske denne hypotese blev U2OS celler, transficeret med vildtype eller mutante proteiner behandlet med MG132 og ARF subcellulære fordeling blev analyseret ved immunofluorescens. Som vist i fig. 7A og B vi observeret efter MG132 behandling, en konsekvent stigning af ARF cytoplasmatisk farvning i både WT og T8A transficerede celler, hvilket yderligere antyder, at ARF nedbrydning prevalently forekommer i cytoplasmaet. Tilsvarende Western Blot af nukleare og cytoplasmatiske ekstrakter af U20S celler, transficeret og behandlet som ovenfor, viser en konsekvent stigning af både WT ARF og ARFT8A protein niveauer i cytoplasmatisk rum på proteasomhæmning (fig. 7C).

A U2OS celler blev transficeret med 1,5 ug af enten wt eller mutanter ARF udtrykkende plasmider. 16 timer efter transfektion blev cellerne behandlet med enten DMSO eller 10 uM MG132 i 5 timer og underkastet IF med anti-ARF antistof. Repræsentative billeder, der viser ARF og ARF mutanter subcellulære lokalisering i U2OS celler med eller uden MG132 behandling vises. Billeder blev taget med et Nikon fluorescensmikroskop på lignende eksponeringsforhold. B Histogrammet, der repræsenterer middelværdien af ​​tre uafhængige forsøg, rapporterer procentdelen af ​​transficerede celler, der viser hver lokalisering mønster. Standardafvigelser er også vist. C Western blot-analyse af lige store mængder af både cytoplasmiske (30 ug) og nuklear (6 ug) proteinekstrakter af transficerede U2OS celler behandlet eller ej med MG132. Effektivitet af cellulær fraktionering blev kontrolleret med anti-lamin A /C og anti-tubulin antistoffer. Normaliseret ARF band intensiteter, der er vist under hver tilsvarende bånd, er udtrykt som fold berigelse i forhold til ubehandlede prøver vilkårligt sat til 1 (se Materialer og metoder for detaljer).

Diskussion

betydningen af ​​den funktionelle interaktion mellem ARF og MDM2 kom ud fra den oprindelige opdagelse, at ARF har potentiale til at fungere som en tumorsuppressor ved at binde til og inhibere p53 antagonist MDM2. Denne viden blev styrket og forfinet gennem årene, selv med kontroverser om den rolle, ARF nucleolar lokalisering i denne proces [16, 17, 27]. På den anden side, at det er vigtigt for denne interaktion fremgår den iagttagelse, at inaktivering /deregulering af p53-MDM2-ARF akse er afgørende for udviklingen af ​​de fleste humane cancere. Interessant MDM2 overekspression og p14ARF tab korrelerer med en mere aggressiv fænotype i primære humane lungetumorer underliggende et omvendt forhold mellem de to i humane tumorer [28]. På den anden side, tidligere observationer pegede på en kontroversiel effekt af MDM2 handling på p14ARF: det blev vist, at tabet af Mdm2 kunne enten undertrykke [29] eller genoprette [14] evne murine p19 ARF at inducere p53-uafhængig cellecyklusstandsning . Således afhængigt af sammenhængen (cellulære typer, opstrøms signaler, ekspressionsniveau), kunne Mdm2 opfører enten som en mediator eller inhibitor af p14ARF funktion på celleproliferation [28]. Anyway, den første “opsving” i vores måde at se på MDM2 /ARF forhold kom ud fra den iagttagelse, at en kort ARF mutant (aa2-29) dukkede stabiliseret markant efter tavshed af MDM2 eller overekspression af MDMX (en MDM2 relateret, blande protein), hvilket fører til en model, hvor ARF binding til MDM2 forårsager, på en måde, dens selvmord fordi bringer sig for nedbrydning ( “skyld ved association model”) [18]. Vores undersøgelse godt passe ind i disse observationer, der viser, at MDM2 intracellulær stigning kan, ja, forårsager ARF ødelæggelse af proteasomet. Vi viser, at den fysiske vekselvirkning mellem ARF og MDM2 er nødvendig, men ikke tilstrækkelig til at observere effekten, da ARFT8D mutant er i stand til at interagere med MDM2 [11], men er ikke nedbrydes. Det faktum, at regionen interaktionen af ​​MDM2 med MDMX (dvs. ringfingeren domæne) kan undværes for denne effekt tyder på, at, ja, er dette protein ikke involveret. På den anden side, den observation, at ringfingeren /ubiquitinligase domæne af MDM2 kan undværes påvirke ARF niveauer, tyder på, at, selv om dette ikke formelt kan udelukkes, er ARF ubiquitinering ikke påkrævet [8, 9]. På den anden side, Rodway et al. [18] postuleret en rolle MDM2 ved mediering ARF levering til proteasomet uden krav om ubiquitinering. Dette kan formentlig medieret af MDM2 direkte interaktion med proteasomet [22]. Især har Mdm2 blevet vist at direkte interagere med flere proteasom underenheder via både N-terminale og C-terminale områder, mens dens centrale domæne (aa200-300), synes at udøve en negativ regulerende kontrol på bindingen [22]. Vores MDM2 mutanter (MDM2

1-441 og MDM2Δ

150-230) bevarer mindst en af ​​de regioner, der er nødvendige for interaktionen med proteasomet og begge af dem er i stand til at inducere ARF nedbrydning. Interessant nok har vi også observere en mere effektiv ARF reduktion med MDM2Δ

150-230 mutant, der mangler centrale domæne.

Men som ARF ubiquitinering ikke har været direkte behandlet i den foreliggende undersøgelse, kan vi ikke udelukke intervention ULF [7] eller enhver anden endnu ikke identificeret ubiquitinligase i den observerede effekt. mens ULF medieret ARF nedbrydning vises udøves i nukleoplasma, forskellige observationer i dette papir tyder dog, at MDM2 virkning indtræder i cytoplasmaet. For det første gør mutationer i både ARF og MDM2, der tvinger deres lokalisering i cytoplasmaet, ikke påvirke MDM2 medieret ARF nedbrydning. Endvidere Leptomycin B behandling, som inhiberer MDM2 nuklear eksport, forårsager ARF ophobning og modvirker MDM2 nedbrydning virkning på ARF. Endelig immunfluorescens eksperimenter viser klart, at MG132 behandling resulterer i en forøgelse af ARF-niveauer i cytoplasmaet, hvilket kraftigt antyder, at faktisk grunden ARF er normalt ikke påviselig i denne subcellulært afsnit består i en hurtigere omsætning.

Det skal bemærkes, at da dens oprindelige opdagelse blev ARF beskrevet med en fremherskende nucleo /nucleolar lokalisering. Følgelig er det blevet rapporteret, at en beskyttende rolle på ARF niveauer udøves i nucleolus ved B23 /NPM. Desuden interaktion med TBP1, som beskytter ARF fra proteasom nedbrydning forekommer i kernen [8].

For nylig er ARF blevet rapporteret også at lokalisere i cytoplasmaet selvom hovedsagelig forbundet til mitokondrier, på grund af dets rolle i autophagy [30]. Interessant nok har cytoplasmatisk p14ARF farvning blevet beskrevet i nogle kræftformer [28].

Endelig har vi for nylig rapporteret, at efter aktivering af PKC, ARF protein phosphoryleres og akkumuleres i cytoplasmaet [11].

Her viser vi, at aktivering af PKC-vejen ved TPA modvirker MDM2 indsats, samtidig inhibering af vejen ved enten Bisindolylmalemide behandling eller PKCa instrueret siRNA, forårsager et fald i ARF-niveauer og forbedrer MDM2 medieret ARF nedbrydning. Følgelig T8D ARF mutant, der efterligner phosphoryleret status af proteinet, selvom mere til stede i cytoplasmaet, synes at være mindre følsomme over for MG132 behandling og MDM2 overekspression. Disse data forstærker vores tidligere forslag om, at fosforylering udøver en beskyttende virkning på ARF. Det ser ud til, at mere end en transskription uafhængige mekanismer er involveret i reguleringen af ​​ARF protein, dvs. proteasom medieret nedbrydning [6-8] og fosforylering.

Samlet set vores observationer fører til den hypotese, at i et onkogen miljø som MDM2 er overudtrykt, er ARF niveauer holdes lav på grund af en hurtig omsætning skyldes MDM2 udløst nedbrydning. Forøgelse ARF nedbrydning og /eller phosphorylering kunne således være fælles strategier at en celle orkestrerer til straks undslippe ARF vækstsuppression funktioner enten i fysiologiske betingelser eller når celler er tvunget til at proliferere under cancer progression. er behov for yderligere forsøg for at afklare de molekylære mekanismer understreger disse bemærkninger og deres relevans for udvikling af kræft

in vivo

.

Materialer og metoder

Konstruktioner

pcDNARF , 3xFlag ARF

1-65, 3xFlagARF

65-132, ARFΔ

2-14 /82-101 blev beskrevet i [8]. pcDNAARFT8A og T8D plasmider blev beskrevet i [11]. pCMVMDM2 vægt, pCMVMDM2

1-441, pCMVMDM2Δ

150-230 blev beskrevet i [31].

Cellekulturer, transfektioner

U2OS, H1299, Hela cellelinjer blev købt fra cellelinierne service (CLS).

MEF

p53 – /- MDM2 – /-

cellelinje blev beskrevet i [32]. Alle cellelinjer blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (Euroclone, Life Science) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% (v /v) CO2 i luft. Salg

Celler blev transficeret ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Life Technology) [33] eller med RNAiMAX (Life Technology) [34] i henhold til producentens anbefalinger.

for forsøgene beskrevet i fig. 7C, U2OS celler blev transficeret ved elektroporering under anvendelse af Neon transfektionssystemet (Life Technology) ved at følge producentens instruktioner.