PLoS ONE: Global Phosphotyrosine Proteomics Identificerer PKCδ som en markør for Lydhørhed til Src Hæmning i kolorektal Cancer

Abstrakt

Følsomme og specifikke biomarkører af protein kinase hæmning kan udnyttes til at fremskynde udvikling af lægemidler studier i onkologi ved at knytte tidligt molekylære reaktioner med target hæmning. I denne undersøgelse, vi udnyttet upartiske shotgun phosphotyrosin (pY) proteomics at opdage nye biomarkører for respons på dasatinib, et lille molekyle Src-selektiv inhibitor, i prækliniske modeller for kolorektal cancer (CRC). Vi udførte upartiske massespektrometri shotgun Py proteomics at afsløre pY proteomanalyse af dyrkede HCT-116 colon carcinomceller, og derefter udvidet denne analyse til HCT-116 xenotransplantattumorer at identificere Py biomarkører for dasatinib-lydhørhed in vivo. Større dasatinib-responsiv py steder i xenotransplantattumorer inkluderet sites på delta-typen protein kinase C (PKCδ), CUB-domæne-holdige protein 1 (CDCP1), type-II SH2-domæne-holdige inositol 5-phosphatase (SHIP2), og receptorprotein-tyrosinphosphatase alpha (RPTPα). Den pY313 webstedet PKCδ blev yderligere understøttet som en relevant biomarkør for dasatinib-medieret Src hæmning i HCT-116-xenografter ved immunhistokemi og immunblotting med en phosphospecifikt antistof. Reduktion af PKCδ pY313 blev yderligere korreleret med dasatinib-medieret inhibering af Src og formindsket vækst som sfæroider af et panel af humane CRC cellelinier. Disse undersøgelser viser PKCδ pY313 som et lovende udlæsning af Src hæmning i CRC og potentielt andre solide tumorer og kan afspejle lydhørhed over for dasatinib i en delmængde af tarmkræft

Henvisning:. McKinley ET, Liu H, McDonald WH, Luo W, Zhao P, Coffey RJ, et al. (2013) Global Phosphotyrosin- Proteomics Identificerer PKCδ som en markør for Lydhørhed til Src Hæmning i kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (11): e80207. doi: 10,1371 /journal.pone.0080207

Redaktør: Laszlo Buday, Ungarsk videnskabsakademi, Ungarn

Modtaget: Juli 19, 2013; Accepteret: September 30, 2013; Udgivet: November 8, 2013 |

Copyright: © 2013 McKinley et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse undersøgelser blev støttet af tilskud fra National Cancer Institute: R25 CA136440, P50-951903; R01-CA140628; K25-CA127349; RC1-CA145138; R01-CA46413; og Kleberg Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyrosin phosphorylering er et centralt signaleringsmekanisme regulerer centrale aspekter af mammale celle adfærd, herunder proliferation, motilitet, metabolisme og differentiering [1]. Proteintyrosinkinaser blev først anerkendt som produkter af virale onkogener, herunder v-src og v-abl, og som receptorer for vækstfaktorer, herunder EGF. Aberrant signalering ved mange af de halvfems konventionelle tyrosinkinaser kodes af det humane genom er blevet forbundet med sygdomsprocesser, herunder udvikling og spredning af cancer [1,2].

Målrettet behandling med tyrosinkinasehæmmere (TKI’er) er et stadigt voksende modalitet, der muliggør personlig kræftbehandling [3,4]. Skelsættende eksempler indbefatter den lille molekyle inhibitor imatinib, der effektivt behandler kronisk myeloid leukæmi drevet af BCR-ABL oncoprotein [5,6] såvel som terapier til at inhibere mutant BRAF i cancere, såsom melanomer [7,8]. Lille molekyle TKI’er og neutraliserende monoklonale antistoffer, der er målrettet EGF-receptoren (EGFR) og /eller den nært beslægtede ERBB2 (HER2 /neu) har haft succes i behandlingen af ​​ikke-småcellet lungekræft og brystcarcinom [9,10].

I kolorektal carcinom (CRC), et stort flertal af sager viser forhøjet aktivitet af Src-familien nonreceptor tyrosinkinaser [11,12], som gradvist øges i aktivitet som tumorer videre til metastatisk sygdom [13]. Afvigende Src-aktivitet kan bidrage til malignitet ved at påvirke flere receptorsystemer herunder cadherin-medieret celle-celle vejkryds, integrin-medieret celle-ECM sammenvoksninger, og aktiverede receptor komplekser herunder EGFR [14-16]. Forhøjet Src aktivitet i CRC forudser dårlig klinisk prognose [17]. Følgelig har der været betydelig interesse i Src som et terapeutisk mål i CRC og andre kræftformer [18-21]. Dasatinib, det mest klinisk undersøgt Src-selektiv inhibitor, er en effektiv cytostatisk middel hæmmer tumorvækst, invasion og metastase [22]. Foruden Src-familien af ​​kinaser, dasatinib inhiberer kraftigt BCR-ABL og blev for nylig vist at være bedre end imatinib som en terapi for kronisk myeloid leukæmi [23].

Ved bedømmelsen målrettede TKI’er i klinisk onkologi, der er en brug for at identificere relevante biomarkører, der kan bruges til at vejlede valg af dosis i præklinisk udvikling og til at overvåge anti-tumor aktivitet i kliniske forsøg. Biomarkører kan også være af værdi til at forudsige, om en patient er sandsynligt at drage fordel af en bestemt behandling. Flere undersøgelser har udnyttet forskellige tilgange i et forsøg på at identificere sådanne markører [24-26]. Rationelt, kunne sådanne biomarkører også være specifikke tyrosin websteder, der er phosphoryleret af kinasen (r) inhiberes. Det er således af interesse at karakterisere tyrosinkinase-signaleringsveje opererer i tumorceller. Tyrosinphosphorylering i tumorceller kan systematisk og omfattende profileret under anvendelse af massespektrometri til analyse af peptider beriget for phosphotyrosin (pY) ved immunoaffinitetskromatografi [27]. Vi har tidligere anvendt denne fordomsfri shotgun proteomics tilgang for at opnå en dybdegående analyse af tyrosinphosphorylering i normal versus Src transformerede musefibroblaster og derved karakteriserer den globale effekt af onkogen Src [28]. I en anden anvendelse af denne fremgangsmåde, afslørede pY signalering i et stort udsnit af ikke-småcellet lungekræft cellelinjer og solide tumorer aktiverede tyrosinkinaser [29].

Formålet med den foreliggende undersøgelse var at bruge haglgevær pY proteomics at få et samlet overblik over tyrosinphosphorylering i den velkendte HCT-116 human colon adenocarcinom cellelinie, og at udvide analysen til HCT-116 xenotransplantattumorer behandlet med dasatinib at identificere dasatinib-responsiv py biomarkører. Vi identificerede Py sites på signalering proteiner, herunder PKCδ CDCP1, og RPTPα som store dasatinib-reagerende steder i HCT-116 xenotransplantattumorer der kan være nyttige som prædiktive biomarkører for SRC hæmning. Endelig giver sfæroide kulturer etableret fra et antal humane CRC cellelinier, observerede vi en korrelation mellem datatinib-medieret inhibering af proliferation og reduktion af PKCδ pY313. Vores resultater afslører PKCδ pY313 som kandidat biomarkør til forudsigelse af respons på dasatinib i CRC.

Materialer og metoder

Cell kultur og medicinsk behandling

HCT-116 (ATCC CCL- 247), Caco-2 (ATCC HTB37), Colo205 (ATCC CCL-222), DKO-1, DLD-1 (ATCC CCL-221) blev opnået fra ATCC og Lim1215 celler [30] blev opnået fra Robert Whitehead, Ludwig Institute for Cancer Research. De humane CRC cellelinier blev opretholdt som en monolagskultur på subkonfluent tæthed i et CO 5%

2, 37 ° C atmosfære. Vækstmedium bestod af Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Mediatech) for alle cellelinjer med undtagelse Colo205 som blev dyrket i RPMI (Cellgro). Vækstmedium blev tilsat 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals), 1% antimycotiske antibiotika (Mediatech), og 100 uM ikke-essentielle aminosyrer (Gibco-Invitrogen). Alle celler blev passeret anvendelse af 0,25% EDTA-trypsin (Gibco).

Dasatinib (BMS-354.825) blev venligst stillet til rådighed af Richard Smykla fra Bristol-Myers Squibb Oncology (Princeton, NJ). Dasatinib blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) i en 10 mM stamopløsning. HCT-116, Caco-2, Colo205, DKO-1, og DLD-1-celler blev behandlet med eskalerende dasatinib koncentrationer (0, 10, 100, 1000, 5000 nM) i 24 timer. Ved afslutningen af ​​behandlingen, blev dyrkningsmediet fjernet, og cellerne blev høstet til analyse.

Animal model

Alle undersøgelser blev godkendt af Vanderbilt University Institutional Animal Care og brug Udvalg og blev gjort alle bestræbelser at minimere dyrenes lidelser. HCT-116-xenografter blev dannet i athymiske nøgne mus (Harlan Sprague-Dawley) efter subkutan injektion af 2-4 × 10

6 celler. Tydelige tumorer blev påvist i løbet af 2 til 4 uger. Dasatinib blev rekonstitueret i DMSO. Umiddelbart før behandling, ni dele sterilt saltvand blev tilsat til lægemiddelopløsningen. Tumorbærende mus (0,5-1 cm længste dimension) blev indgivet 100 pL dasatinib (60 mg /kg) eller DMSO /saltvand køretøj ved oral sondeernæring. Dyr fik enten en enkelt dosis eller behandlet dagligt i 5 på hinanden følgende dage. For hvert behandlingsregime blev kohorter af dyr aflivet, og tumorerne blev udskåret 4 timer og 24 timer efter den endelige lægemiddelindgivelse.

Fremstilling af phosphotyrosin-beriget Peptidprøver Salg

Tryptiske peptider beriget med phosphotyrosin var fremstillet ud fra HCT-116 monolagskulturer (eksponentielt voksende ved ca. 70% konfluens) og fra HCT-116 xenograft-tumorer. Cellelyse, protein fordøjelse, og immunaffinitetskromatografi berigelse for pY-holdige tryptiske peptider blev opnået ved anvendelse af PhosphoScan Kit (P-Tyr-100; Cell Signaling Technology) ifølge fabrikantens protokol. For dyrkede celler blev hver runde af analyse udført under anvendelse af 60 mg totalt cellulært protein (opnået fra otte 150 mm skåle). Proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse BCA (Thermo Scientific), med bovint serumalbumin (BSA; Sigma) som en standard. Tumorlysater blev fremstillet ved homogenisering på is for at dispergere det frosne væv (ca. 400 mg tumor vådvægt i 9 ml i PhosphoScan Lysis Buffer), efterfulgt af kortvarig sonikering og centrifugering (20.000 x

g

i 15 min) til klar uopløseligt materiale. Cleared tumorlysater indeholdende ca. 40 mg protein (som bestemt ved BCA-assay) blev anvendt i analysen. Tryptiske peptider blev frembragt ved behandling af lysater natten over ved 25 ° C med trypsin-TPCK (60: 1 cellulært protein: trypsin).

Massespektrometri

LC-MS /MS-analyse af peptiderne blev udført under anvendelse af en hybrid lineær ionfælde /orbitrap instrument (LTQ-Orbitrap, Thermo-Fisher) udstyret med en Eksigent nanoLC-AS1 autosampler Eksigent nanoLC-1D plus højtydende væskekromatografi (HPLC) pumpe (Eksigent), nano-electrospray kilde, og Xcalibur instrument kontrol software. Peptider blev separeret på en kapillarsøjle med sintret silica (100 um x 18 cm) pakket med omvendt fase-harpiks (Jupiter C18, 3 um, 300 Å, Phenomenex), og koblet med en in-line, frittet (genereret med flydende silikat Kasil) fældefangst søjle (100 um x 4 cm) også fyldt med C18 harpiks (Jupiter C18, 5 um, 300 Å, Phenomenex) [31]. Bifasisk gradient kromatografiske eluering blev anvendt, hvorved mobil fase A bestod af 0,1% myresyre og mobil fase B bestod af 0,1% myresyre i acetonitril. Strømningshastigheden under påfyldning og afsaltning fase af gradienten var 1,5 uL /​​minut og under adskillelse fase var 500 nL /min. En 184 minutters gradient blev gennemført med en 10 min vask periode omdirigeret til spilde efter præ-søjle (100% et opløsningsmiddel for de første 10 minutter efterfulgt af en gradient til 98% opløsningsmiddel A, v /v, 15 min) til tillade fjernelse af eventuelle resterende salte. Efter vask periode blev gradienten steg til 35% B ved 125 minutter, efterfulgt af en stigning til 90% B ved 140 min og holdt i 9 min før returnering til de oprindelige betingelser. Tandem spektre blev erhvervet ved hjælp af en data-afhængig scanning tilstand, hvor en fuld MS-scanning (m /z 300-2000) blev erhvervet på Orbitrap med en opløsning på 60.000. Maksimal injektion tid var 1 s. Data afhængige MS /MS-scanninger blev erhvervet for de fem mest intense ioner fra fuld scanning ved hjælp af en isolation bredde på 2 m /z, en aktivering på 30 ms, en 30% normaliseret kollision energi, og en maksimal indsprøjtning tid på 150 ms .

For at forbedre påvisningen af ​​phosphopeptider, en ekstra data-afhængig algoritme i Xcalibur software blev aktiveret, hvor tilstedeværelsen af ​​en dominerende fosfat neutral tab (97,97, 48,99, og 32,66 m /z enheder) ville udløse erhvervelse af en MS /MS /MS [32]. For at tillade samling af MS /MS spektre af lavere overflod peptider, blev tidligere mål ioner udvalgt til MS /MS dynamisk udelukket med en liste længde på 150 ioner og en tid på 60 s. “Monoisotopisk forløber valg” var aktiveret og opkræve stater 1+ og 4+ blev ikke i betragtning til MS /MS. Instrumentet blev drevet i preview for at muliggøre samtidig samling af MS /MS spektre under Orbitrap scanning. Generelle massespektrometriske betingelser var som følger: spray spænding, 2,2 kV; ingen kappe og hjælpeudstyr gasflow; ion overføringsrøret temperatur, 200 ° C; og rør linse spænding 80 V.

Database søgning, filtrering, og falsk-discovery rate beslutsomhed

Metoder svarede til databasesøgning strategier beskrevet tidligere [28], med mindre modifikationer. Thermo RAW filer blev omdannet til DTA filer ved hjælp af ScanSifter algoritme (Vanderbilt University), derefter søgte ved TurboSEQUEST V.27 (rev. 12) algoritme (Thermo Electron) mod muse /humant delmængde af UniRef100 database, der blev vendt til at beregne falsk-discovery sats. Søgningerne blev udført så de følgende differentierede ændringer: 57 om cystein (for carboxyimidomethylation fra iodacetamid), 16 om methionin (oxidation), og 80 om Ser, Thr eller Tyr (phosphorylering). MS /MS /MS-spektre blev også søgt efter en -18 masseskift på Ser, Thr, eller Tyr til regnskab for tabet af vand, hvilket resulterer fra den neutrale tab af phosphorsyre. Peptid- og fragment ion tolerancer blev sat til 2,5 Da og 1,0 Da.

Falsk-discovery satsen blev derefter estimeret ud fra peptid kampe til de omvendte sekvenser ganget med to og divideret med det samlede antal af peptid hits. Peptider hentes fra database søgealgoritmer med 5% falsk-discovery satsen blev yderligere filtreret af tre yderligere trin. Først var stillingen tærskelværdi afhængigt af peptid kategori. For charge 1-peptider, blev peptider udvalgt med xcorr større end eller lig med 1, RSP mindre end eller lig med 5, og Sp større end eller lig med 350; for charge 2 peptider blev tærskel på xcorr 1.8, RSP 5, og Sp 350; for charge 3 peptider, blev tærskel på xcorr 2.5, RSP 5, og Sp 350. For det andet blev der kun peptider med mindst en tyrosin og en phosphorylering bevares. Endelig af de resterende peptid hits, kun pTyr-holdige peptider med mindst en af ​​tre yderligere kriterier blev bibeholdt: (1) mindst to matchende spektre havde xcorr værdier over høj tærskel (3,3 til ladning af 3, 2,2 til opladning af 2 og 1,5 for gebyr på 1), (2) den pTyr webstedet blev uafhængigt identificeret fra to eller flere særskilte peptider, eller (3) pTyr stedet var blevet selvstændigt identificeret andetsteds og indgår i PhosphoSite online ressource af

in vivo

phosphoryleringssites, version 1.5 (https://www.phosphosite.org), vedligeholdes af Cell Signaling Technology, Inc.

Alle oprindelige massespektrometri data fra xenograf tumor eksperimenter er blevet gjort offentligt tilgængelige gennem chorus online massespektrometri data ressource (https://chorusproject.org/). Med en chorus brugerkonto, kan enhver delmængde af disse rådata downloades eller ses online. Alternativt kan disse data hentes direkte som en 2,8 GB fil uden at registrere på:. Https://chorusproject.org/anonymous/download/experiment/-2997969850554343767)

Antistoffer og immunblotting

celleprøver blev opsamlet efter 24 timer af dasatinib eksponering. Xenograft-tumor prøver blev indsamlet 4 timer eller 24 timer efter den endelige administration af dasatinib. Tumorer blev hurtigt nedfrosset i flydende nitrogen og derefter homogeniseret og fortyndet til 1 pg /pl i lysepuffer. Mellem 20 og 40 ug totalt protein fra hver prøve blev fyldt i 7,5 til 12% SDS PAGE geler og opløst ved elektroforese før overførsel til PVDF-membraner (PerkinElmer). Membraner blev blokeret natten over ved 4 ° C i tris-bufret saltvand 0,1% Tween-20 (TBST) indeholdende 5% w /v fedtfri tørmælk pulver. Efterfølgende blev membranerne immunoblottet med antistoffer mod p-Src Y416 (Cell Signaling # 6943S), total Src (Cell Signaling # 2107), p-PKCδ Y313 (Cell Signaling # 2055S), total PKC (Cell Signaling # 2058), p- RPTP Y789 (Cell Signaling # 4481S), total RPTP (Upstate # 07-472), β-actin (Cell Signaling # 4967), og β-tubulin (Cell Signaling # 2128). Sondering forekom i 1 time ved stuetemperatur med antistoffer fortyndet som foreslået af leverandører i TBST med 3% bovint serumalbumin (BSA) efterfulgt af inkubation i 1 time ved stuetemperatur med arter-relevant peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Jackson ImmunoReserach) fortyndet 1: 5000 i TBST indeholdende 3% BSA. Western Lightning

TM Plus-ECL (PerkinElmer) substrat blev anvendt til påvisning på en Xenogen IVIS 200. Densitometri blev udført ved hjælp af Living Billede 3.2 software (Caliper).

Sfæroide vækstanalyse

Serielle mikroskopiske billeder af celle sfæroider fra 0, 24, 48 og 72 timer efter dasatinib behandling blev importeret til ImageJ softwarepakke (NIH). Billeder blev automatisk konverteret til binær og huller i det binære billede blev lukket ved hjælp af Fill Huller funktion i ImageJ. The Wand Selection værktøjet blev anvendt til segmentet alle tilsluttede pixels fra sfæroide og blev registreret antallet af pixels i dette område. Samlet areal for hver klumpformet var normaliseret til 24 timer tidspunkt.

Immunhistokemi

Umiddelbart efter offer, tumor prøver af udskårne tumor blev fikseret i 10% formalin i 24 timer og overført til 70% ethanol. Prøver blev derefter bearbejdet til paraffin indlejring og sektioneret før immunfarvning. Efter skæring blev vævsprøver deparaffineret, rehydreret, og antigen-genvinding trin blev udført under anvendelse af en citratpuffer (pH 6,0) påført i 20 minutter ved 105 ° C efterfulgt af 10 minutter ved stuetemperatur. Prøverne blev derefter behandlet med 3% H

20

2 for at eliminere endogen peroxidaseaktivitet. Snittene blev derefter blokeret med et serum-frit protein blokerende reagens i 20 minutter. Serielle snit blev inkuberet natten over med en 1: 100 fortynding af p-PKCδ pY313 (Cell Signaling # 2055S) antistof eller p-SHIP2 Y986 /987 (Cell Signaling # 2008). Påvisning af primære antistoffer anvendt Envision + Systems (Dako) med et peberrodsperoxidase-mærket polymer (30 minutters inkubation) efterfulgt af tilsætning af DAB-substrat (5 minutters inkubation). Farvede prøver blev afbildet ved 40x forstørrelse og analyseret for ekspression af histologiske markører. Salg

Resultater

Det phosphotyrosin proteomanalyse af dyrkede HCT-116 humane kolorektal celler

Vi har tidligere gennemført en omfattende analyse af phosphotyrosin proteomanalyse af Src- forvandlet musefibroblaster

i vitro

[28]. Formålet med denne undersøgelse var at foretage en tilsvarende analyse for at karakterisere pY proteom af den humane CRC cellelinje og derefter udvide strategien for at søge efter potentielle Py biomarkører for dasatinib-responsivitet i HCT-116 xenograft-tumorer.

I første omgang søgte vi at karakterisere pY proteomanalyse af dyrkede HCT-116 celler, i fravær af dasatinib-behandling. Fra 15 uafhængige LC-MS /MS kørsler (5 biologiske gentagelser, hver understøttes af 3 tekniske replikater), blev 249 distinkte py peptider identificeret. Disse peptider repræsenterer 162 distinkte Py sites på 116 forskellige proteiner. Kriterier for peptid fastholdelse inkluderet høj-tærskel xcorr værdi og identifikation i 1 biologisk kopiere. Tabel S1 viser de tilbageholdte peptider grupperet efter en funktionel klassificering, pY websted aminosyrestilling, antal uafhængige identifikationer (spektrale tæller), og højeste xcorr værdier. Listen over tilbageholdt Py peptider og spektral count data giver et samlet overblik over Py signalering aktiviteter HCT-116 celler under betingelserne i monolag cellekultur. Omkring halvdelen af ​​de Py sites opført repræsenterer proteinkinaser (44/162) og andre signalproteiner (38/162), mens en anden 25% af de steder er på proteiner forbundet med celleadhæsion og actincytoskelettet (40/162) (figur 1A).

I dyrkede HCT-116 celler, blev 162 py sites identificeret som repræsenterer 116 forskellige proteiner (A). Proteiner er klassificeret under de brede kategorier af Vedhæftning og Cytoskeleton, Protein kinaser, og andre signalsystemer konto for cirka tre fjerdedele af det samlede. Af de Py sites på proteinkinaser, langt de fleste er på konventionelle tyrosinkinaser og “CMGC Group” proteinkinaser der omfatter CDKer, ERK /MAPK’er, GSK-3 og andre dual-specificitet kinaser. Se tabel 1 og tabel 2 for en liste over de hyppigst identificerede lokaliteter ved spektral tæller i HCT-116 celler. Alle 162 lokaliteter er vist i tabel S1 sammen med vigtige oplysninger, herunder UniProt post nummer, phosphopeptider detekteret i LC-MS /MS-analyse, og de samlede spektrale id’er. I HCT-116 xenotransplantattumorer blev 71 py sites identificeret som repræsenterer 58 forskellige proteiner (B). Retention kriterier for de steder var 7 eller flere spektrale id’er i tumorer og detektion også i HCT-116 dyrkede celler. De 71 py sites repræsenterer 58 forskellige proteiner. Tumor steder, der opfylder kriterierne for lagring har en funktionel fordeling meget lig den af ​​udpegede lokaliteter i dyrkede celler. Se tabel 3 og tabel 4 for en liste over top sites ved spektral tæller i HCT-116-xenografter. Alle 71 lokaliteter er vist i tabel S2 sammen med vigtige oplysninger, herunder UniProt ID-nummer, phosphopeptider detekteret i LC-MS /MS-analyse, og antallet af spektrale ID’er fra ubehandlede

versus

dasatinib-behandlede tumorer.

Af de protein kinase Py sites, vi identificeret 24 steder på 14 forskellige tyrosinkinaser og 15 steder på 14 forskellige CMGC kinaser. CMGC kinaser (en bred klassificering gruppe, der omfatter CDK’er, ERK /MAPK’er, GSK-3, og familier med dobbelt specificitet kinaser) var fremtrædende blandt de hyppigst identificerede HCT-116 lokaliteter (tabel 1). CDK1 pY15 var den mest opdaget site med 146 spektrale tæller. En kinasedomæne aktivering loop websted (pY1234) om MET, hepatocytvækstfaktor receptortyrosinkinase, var den anden hyppigst identificerede site i HCT-116 dyrkede celle profil med 74 spektrale tæller. Andre top-rangerede steder på CMGC kinaser (herunder PRP4, ERK2, DYRK1, og GSK-3) også bor i kinasedomænet aktivering loops hvor fosforylering indikerer den aktiverede tilstand. Vi identificerede en række lokaliteter i HCT-116 celler, der ikke blev observeret i vores tidligere omfattende analyse af MEF’er [28], tabel 2.

Protein

funktionsklasse

Site

id’er

CDK1Protein kinase: CMGCY15146METProtein kinase: Tyrosin * Y123474PRP4Protein kinase: CMGC * Y84969CDCP1Adhesion: Cell /ECM Y70747PaxillinAdhesion: Cell /ECMY11841ERK2Protein kinase: CMGC * Y18736SHBOther SignalingY24632Annexin A2Other SignalingY2429DYRK1AProtein kinase: CMGCY32126SHBOther SignalingY26824LAP2 /ErbinOther SignalingY110424Catenin δ-1Adhesion: Cell /CellY22824GSK-3Protein kinase: CMGC * Y27922Table 1. Alle phosphotyrosin sites oftest identificeret i HCT-116 dyrkede celler

* stedet på protein kinase domæne aktivering loop Forkortelser:. CDCP1, CUB-domæne-holdige protein 1; CDK1, Cell division kontrolprotein 2-homolog; DYRK1A, Dual specificitet tyrosin-phosphorylering-kinase 1A; ERK2, mitogenaktiveret proteinkinase 1; GSK-3, Glycogensynthasekinase-3 (alfa og beta); MET, Hepatocytvækstfaktor receptor; PRP4, serin /threonin-proteinkinase PRP4 homolog; SHB, SH2 domæne-holdige adapter protein B. CSV Hent CSV Protein

funktionsklasse

Site

id’er

CDCP1Adhesion: Cell /ECMY70747DCBLD2MiscellaneousY75019PKCδProtein kinase: AGCY31318FAT1Adhesion: Cell /CellY424416MST1R /RONProtein kinase: Tyrosin * Y123815Annexin A2Other SignalingY3014DCBLD2MiscellaneousY73214TYK2Protein kinase: TyrosineY29213FYNProtein kinase: Tyrosin ** Y21311LYNProtein kinase: Tyrosin ** Y19311Table 2. Phosphotyrosin- sites ikke fundet i den tidligere omfattende analyse af dyrkede MEF’er

(28)

* stedet på protein kinase domæne aktivering loop ** stedet på Src-familien kinase SH2 domainAbbreviations: CDCP1, CUB-domæne-holdige protein 1; DCBLD2, Discoidin, CUB og LCCL domæne-holdige protein 2; -fedt1, Protocadherin Fat 1; FYN, tyrosin-proteinkinase Fyn; LYN, tyrosin-proteinkinase Lyn; MST1R /RON; Makrofag-stimulerende protein receptor; PKCδ, Protein kinase C delta typen; Tyk2, Ikke-receptor tyrosin-protein kinase Tyk2. CSV Hent CSV

Det phosphotyrosin proteomanalyse af HCT-116 xenotransplantattumorer

Efter at have opnået den pY profil HCT-116 celler i kultur, blev pY proteomics strategi derefter anvendes til at identificere HCT-116 Py websteder, der er fremtrædende i xenotransplantattumorer og som har potentiale til at tjene som biomarkører for dasatinib lydhørhed. Subkutane HCT-116 xenograft tumorer blev etableret i athymiske nøgne mus og pY-berigede tryptiske peptider blev fremstillet fra hver af 3 tumorer fra både vehikelbehandlede mus og fra mus behandlet 4 timer tidligere med 60 mg /kg dasatinib. Hvert peptid præparat blev analyseret gennem tre gentagne LC-MS /MS løber at opnå tumor Py profiler. Fra denne analyse, 71 py sites, der repræsenterer 58 forskellige proteiner, blev anerkendt som fremtrædende i xenotransplantattumorer samt at blive opdaget i de dyrkede celler (tabel S2). Svarende til den dyrkede celle profil, de fleste af disse steder var på signalering proteiner (herunder mange proteinkinaser) og vedhæftning /cytoskeleton-associerede proteiner (figur 1b). Tyrosinkinaser og CMGC proteinkinaser blev igen fremtrædende i tumoren profil. Steder på CMGC kinaser domineret listen over de hyppigst identificerede tumor steder, herunder CDK1 Tyr15, og aktiveringen loop sites på p38 MAPK, PRP4, ERK1, ERK2, og GSK-3 (tabel 3).

Protein

funktionsklasse

Site

ID’er (ubehandlet, 4 timers Das)

CDCP1Adhesion: Cell /ECM Y70790, 14CDK1Protein kinase: CMGCY1585, 80PKCδProtein kinase: AGCY31372, 10p38α MAPKProtein kinase: CMGC * Y18259 , 35PRP4Protein kinase: CMGC * Y84949, 45ERK2Protein kinase: CMGC * Y18735, 31ERK1Protein kinase: CMGC * Y20430, 27RPTPαOther SignalingY79827, 1β-actinCytoskeletonY5522, 24GSK-3Protein kinase: CMGC * Y27919, 22Annexin A2Other SignalingY3019, 5Histone H4MiscellaneousY8919, 17Table 3. Phosphotyrosin- sites hyppigst identificeret i ubehandlede HCT-116 xenotransplantattumorer: sammenligning dasatinib-behandlede dyr

* websted i aktivering loop af protein kinase domæne Forkortelser:. CDCP1; CUB-domæne-holdige protein 1; CDK1, Cell division kontrolprotein 2-homolog; ERK1, mitogenaktiveret proteinkinase 3; ERK2, mitogenaktiveret proteinkinase 1; GSK-3, Glycogensynthasekinase-3 (alfa og beta); p38a MAPK, mitogenaktiveret proteinkinase 14; PKCδ, Protein kinase C delta typen; PRP4, serin /threonin-proteinkinase PRP4 homolog; RPTPα, Receptor-typen tyrosin-proteinphosphatase alpha. CSV Hent CSV

CDCP1 pY707 (90 spektrale optællinger), PKCδ pY313 (72 spektrale tæller), og PKCδ pY334 (14 spektrale tællinger) var blandt de hyppigst identificerede steder i ubehandlede xenotransplantattumorer. Dasatinib behandling stærkt reduceret identifikation hyppigheden af ​​alle tre steder (tabel 3, tabel 4), i overensstemmelse med deres væsen mål for Src-familien kinaser. I modsætning hertil steder på CMGC kinaser (for at ikke betragtes phosphoryleres af dasatinib-sensitive kinaser) blev identificeret ved tilsvarende frekvenser i ubehandlede og dasatinib-behandlede tumorer. Andre tilsyneladende dasatinib-responsive sites blandt de hyppigst identificeret i bærerbehandlede tumorer inkluderet pY798 på RPTPα og pY30 på Annexin A2 (tabel 3). RPTPαpY798 blev identificeret i 27 spektre fra ubehandlede tumorer, men kun én gang i dasatinib-behandlede prøver.

Protein

funktionsklasse

Site

ID’er (ubehandlede, 4 timers Das)

RAIG-1Andre SignalingY34715, 1PKCδProtein kinase: AGCY33414, 0SHC1Other SignalingY42713, 0α-enolaseMetabolic EnzymeY4413, 3SHIP2Other SignalingY98611, 0Table 4. Andre bemærkelsesværdige dasatinib-responsive phosphotyrosin udpegede lokaliteter i ubehandlede HCT-116 xenotransplantattumorer: sammenligning dasatinib-behandlede dyr

Forkortelser: PKCδ, Protein kinase C delta typen;. PRP4, serin /threonin-proteinkinase PRP4 homolog; RAIG-1, Retinsyre-induceret protein 3; SHC1, SHC-transformerende protein 1; SHIP2, Phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat 5-fosfatase 2. CSV Hent CSV

Immunoblotting validerer dasatinib reaktionsevne PKCδ pY313 og RPTPα pY798 sites i HCT-116 xenotransplantattumorer

af de mest prominente dasatinib responsivt py udpegede lokaliteter fra phosphoproteomic analyse af HCT-116 xenotransplantattumorer (tabel 3, tabel 4), phospho-specifikke antistoffer er kommercielt tilgængelige for PKCδ pY313, SHIP2 pY986 /987 og RPTPα pY798. Disse antistoffer blev anvendt til at validere dasatinibs reaktionsevne disse steder i forhold til Src inhibition (bestemt ved anvendelse af et phosphospecifikt antistof mod Src pY416 autophosphorylering site). For både PKCδ pY313 og RPTPα pY798 sites, immunoblotting med phospho-specifikke antistoffer indikerede et markant fald i phosphorylering i 4 h dasatinib-behandlede tumorer samtidig med Src inhibition (figur 2A). Den fosforylering status for disse rester tilbage til nær baselineniveauer 24 timer efter behandlingen, hvilket tyder på holdbarheden af ​​Src hæmning i denne model var forbigående med en enkelt administration.

Immonoblot analyse af PKCδ pY313 og RPTPα pY798 i xenotransplantattumorer i forhold til Src pY416 efter en enkelt farmakologisk dosis (A) eller 5 daglige doser af dasatinib (B). Xenograft væv blev vurderet 4 timer og 24 timer efter dasatinib eksponering. Både PKCδ pY313 og RPTPα pY798 korrelerer med Src hæmning i HCT-116-xenografter. Ud over en enkelt dosis, steady-state behandlingsregimer (B) resulterede i forlænget Src hæmning målt 24 timer efter dasatinib eksponering og korreleret med nedsat mængde PKCδ pY313 og RPTPα pY798.

For at evaluere effekten af ​​dasatinib behandlingsvarighed på holdbarheden af ​​Src inhibition, HCT-116-tumorer behandlet med 5 daglige doser af dasatinib blev vurderet ved Western blot-analyse for at bestemme reaktion af identificerede rester under steady-state lægemiddeladministration.