PLoS ONE: Rolle Androgen receptor i Progression af LNCaP prostatakræft Celler fra G1 til S Phase

Abstrakt

Baggrund

androgen receptor (AR) spiller en afgørende rolle i spredningen af ​​prostata kræftceller. Men dens virkningsmekanisme i proliferation fortsat ukendt. En forståelse af mekanismen for AR handling i spredning kan føre til udvikling af effektive strategier til behandling af prostatacancer.

Metodologi /vigtigste resultater

I denne undersøgelse vi rapportere, at puls behandling af synkroniseret LNCaP-celler med bicalutamid, en AR-antagonist, i 4 timer i midten af ​​G

1 fase var tilstrækkelig til at forhindre celler i at komme ind i S-fasen. Da samlingen af ​​præ-replikation kompleks (præ-RC) i G

1 er krævet til progression af celler fra G

1 til S-fasen, virkningen af ​​bicalutamid under midten-G foreslog

1 at rolle AR i proliferation kunne være at regulere samlingen af ​​præ-RC. For at teste denne mulighed, vi undersøgte samspillet mellem AR og Cdc6, en væsentlig del af præ-RC i LNCaP celler. AR co-lokaliserede og co-immunpræcipiteret med Cdc6, og Casodex behandling forstyrret denne interaktion. AR-immunpræcipitat (AR-IP) indeholdt også cyclin E og cyclin A, der spiller en kritisk rolle i præ-RC montering og cellecyklus trådt i S-fasen, og DNA-polymerase-α, PCNA, og ribonukleotidreduktase, som er afgørende for initiering af DNA-syntese. Desuden i celler i S-fase, AR co-sedimenterede med komponenter af DNA-replikation maskiner af celler, der trådte S-fase.

Konklusioner /Signifikans

Tilsammen disse observationer tyder på en hidtil ukendt rolle af AR som et element i den præ-RC at udøve kontrol over progression af LNCaP celler fra G

1 til S-fasen gennem en mekanisme, der er uafhængig af dens rolle som en transskription faktor

Henvisning:. Murthy S, Wu M, Bai VU, Hou Z, Menon M, Barrack ER, et al. (2013) Rolle Androgen receptor i Progression af LNCaP Prostata Cancer Cells fra G

1 til S Phase. PLoS ONE 8 (2): e56692. doi: 10,1371 /journal.pone.0056692

Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italien

Modtaget: August 16, 2012; Accepteret: 14 januar 2013; Udgivet: 20 Februar 2013

Copyright: © 2013 Murthy et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud W81XWH-05-1-0071 fra Institut for Defense til GPR. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den hyppigst diagnosticerede ikke-hudkræft og anden hyppigste årsag til kræftdødsfald i amerikanske mænd [1]. Androgen, ved at aktivere androgen receptor (AR), spiller en vigtig rolle i både udviklingen og progressionen af ​​prostatacancer. Derfor androgen ablation ved farmakologisk eller kirurgisk [2] kastration forbliver frontline terapi til behandling af lokalt fremskreden eller dissemineret prostatacancer. Men selv om sygdommen oprindeligt regresses som reaktion på androgene ablation, det i sidste ende tilbagefald bliver kastrationsresistent [3], [4]. Bemærkelsesværdigt dog trods den fortsatte brug af denne behandling strategi i over 70 år, meget lidt er kendt om den mekanisme, hvormed AR regulerer prostatakræft celleproliferation. En forståelse af mekanismen for AR indsats proliferation kan føre til udviklingen af ​​mere effektive strategier til behandling af prostatacancer.

kastrationsresistent vækst af prostatakræft er ofte forbundet med forøget ekspression af AR [5] [6], [7]. AR er stadig uundværlig for spredning af prostata cancer celler, der er blevet kastrat-resistente; AR-specifikke shRNA eller siRNA blokerer proliferation af androgen-sensitive såvel som kastrationsresistent AR-positive prostatacancerceller [8], [9], [10], [11], [12]. Desuden mikroinjektion af AR-specifikt antistof ind i kernen eller behandling af celler med AR mRNA hammerhovedribozym inhiberer proliferation af AR-positive, men ikke AR-negative, prostatacancer celler [13], hvilket indikerer en kritisk rolle AR i proliferation af AR-udtrykkende prostatacancerceller. Interessant forekommer rolle AR i proliferation af prostatacancerceller at være uafhængig af dens funktion som transkriptionsfaktor, i det mindste i kastrationsniveauer resistente CWR22R3 humane prostatacancerceller (afledt af CWR22 xenografter), hvori AR-afhængig proliferation er ligand uafhængige, men AR transkriptionsaktivitet forbliver ligand-afhængig [11]. Kollektivt, påberåbe disse observationer muligheden for, at, ud over sin rolle som en transkriptionsfaktor, kan AR spille en direkte rolle i cellecyklusregulerende begivenheder, der kræves for spredning af prostata cancer celler. En direkte rolle AR i reguleringen spredning kontrast til begrebet en indirekte rolle, hvor AR transkriptionsaktivitet regulerer ekspressionen af ​​faktorer, der kræves for cellecyklusprogression.

cellecyklusprogression fra G

1 til S-fasen er grundlæggende for spredning. Vi rapporterede tidligere, at Casodex (bicalutamid), en specifik hæmmer af AR, blokerer evne G

1 fase AR-positive LNCaP prostata kræftceller til at indtaste S fase [14], [15], hvilket indikerer en rolle AR i cellecyklusprogression fra G

1 til S-fasen. Progression af celler fra G

1 til S-fasen kræver en kaskade af sekventielle hændelser i G

1 fase, som bidrager til samlingen af ​​DNA-replikation maskiner i celler, der kommer ind i S-fase. Disse hændelser omfatter a) ladning af Cdc6, replikation licenser faktor RLF-B /Cdt1, og mini-kromosom vedligeholdelse (Mcm) proteiner onto oprindelsen anerkendelse kompleks (ORC) til dannelse pre-replikation kompleks (præ-RC), og b) afvikling af DNA ved helicase (Cdc45) i forbindelse med præ-RC, og montering af enzymer af DNA-syntese til dannelse mega-komplekser, der er nødvendige for initiering af DNA-syntese på oprindelsen af ​​DNA-replikation (se Reddy et al [16] for en revision ).

I denne undersøgelse har vi undersøgt, om AR interagerer med komponenterne i præ-RC og DNA-replikation maskiner. Vore undersøgelser viser for første gang, at AR er påkrævet i midten af ​​G

1 fase, på det tidspunkt, hvor præ-RC samling er kendt for at begynde, for LNCaP-celler til at indtaste S-fasen, og at AR er forbundet med regulerende proteiner og enzymer af DNA-syntese i en multienzymkoblede kompleks isoleret fra S-fase celler. Disse observationer tyder AR involvering i proliferation gennem dets interaktion med regulerende proteiner og enzymer af DNA-syntese er nødvendige for indtræden af ​​DNA-syntese og progression af LNCaP-celler fra G

1 til S-fasen.

Materialer og Methods Salg

Cellekultur

LNCaP-celler blev opretholdt i RPMI-medium (Gibco BRL, Rockville, MD) indeholdende 10% føtalt kalveserum (FCS), 2,5 mM glutamin, 100 ug /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin (komplet medium) i en fugtig inkubator med 5% CO

2 og 95% luft ved 37 ° C.

RNA Isolation, RT-PCR, og Real-time RT -PCR (QRT-PCR)

RNA blev isoleret fra kontrol- og Casodex behandlede celler og udsat for RT-PCR til at bestemme PSA og GAPDH-ekspression som tidligere [14] beskrevne. Primersekvenserne anvendes til PSA er: 5′-gcacccggagagctgtgt (frem) og 5-gatcacgcttttgttcctgat (tilbage) primere, og for GAPDH er 5′-gagatccctccaaaatcaagtg (frem) og 5′-ccttccacgataccaaagttgt (tilbage). GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. Den densitometri af RT-PCR-bånd blev udført som tidligere [14] beskrevne. QRT-PCR blev udført på en Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) ved anvendelse af Taqman genekspression assays for PSA (Assay Id: Hs02576345_m1) og 18S RNA (Assay Id: Hs03928985_g1) som beskrevet tidligere [17]. Det relative niveau af PSA-ekspression blev kvantificeret ved hjælp af sammenlignende ΔΔC

t med 18S RNA som intern kontrol.

Synkronisering af LNCaP celler af Isoleucin Berøvelse

Isoleucin afsavn blev udført af vores tidligere offentliggjort fremgangsmåde [15]. Cellerne blev dyrket til 60% til 70% konfluens, og derefter blev mediet udskiftet med isoleucin-frit RPMI 1640 (Life Technologies, Carlsbad, CA) suppleret med 6% dialyseret FCS (Life Technologies, Carlsbad, CA), 2,5 mM glutamin, 100 ug /ml streptomycin og 100 enheder /ml penicillin. Celler blev holdt i isoleucin-frit medium i 36 timer i en inkubator som ovenfor. Celler blev frigivet fra isoleucin-blok ved at erstatte mediet med komplet medium indeholdende 10% FCS og behandles med Casodex (bicalutamid, gave fra Astra Zeneca, England, UK) som angivet.

Siden indtrængen af ​​celler i S fase er præget af indtræden af ​​DNA-syntese, progression af synkroniserede celler fra G

1 til S-fase blev overvåget ved at bestemme cellernes evne til at inkorporere

3H-thymidin i DNA som tidligere beskrevet [14], [ ,,,0],15]. Med regelmæssige intervaller efter frigivelse fra isoleucin-blok blev cellerne puls-mærkede med 2 uCi /ml

3H-thymidin (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA) i 30 minutter ved 37 ° C i en fugtig inkubator. Radioaktiviteten inkorporeret i syreudfældelig materiale blev derefter bestemt som beskrevet [15].

Fremstilling af celleekstrakter og Immunopræcipitation

Eksponentielt voksende LNCaP-celler høstet ved at skrabe i phosphatbufret saltvand (PBS) blev pelleteret ved centrifugering i 10 minutter ved 4 ° C ved 2000 rpm i en Sorvall RT7 centrifuge og resuspenderes i immunpræcipitering (IP) puffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 0,1% Triton X-100, 5 mM EDTA, 250 mM NaCl, 2 mM CaCI

2, 50 mM NaF og 0,1 mM Na

3VO

4) suppleret med proteasehæmmer cocktail (P-8340, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ved en densitet omtrent 1 × 10

7 celler /ml. Cellesuspensionen blev derefter udsat to gange til 30 pulser af lydbehandling ved hjælp af en Branson Sonifier 250 (Branson Sonic Power Co., Danbury, CT), indstillet på en udgang kontrol over to og en duty cycle på 20, med intermitterende afkøling på is. Den sonikeret celleekstrakt blev klaret ved centrifugering i en Eppendorf Centrifuge 5415R ved 6.000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C. proteinkoncentration i ryddet ekstrakter blev bedømt under anvendelse af BioRad Protein Assay-reagens (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

I immunopræcipitation blev celleekstrakter fortyndet 5 gange i IP-buffer suppleret med protease inhibitor cocktail og inkuberet ved 4 ° C natten over med 4 ug /ml anti-AR antistoffer (AR-N20 eller Ar-441) eller anti-Cdc6-antistoffer (H-304) (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA). Immunkomplekser blev derefter adsorberet til Pierce Protein A /G agaroseperler (Thermo Scientific, Philadelphia, PA) i 2 timer ved 4 ° C under forsigtig omrøring. De adsorberede komplekser blev vasket tre gange med IP puffer ved centrifugering i en Eppendorf Centrifuge 5415R ved 6.000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C, og derefter elueret med PAGE loading buffer (Bio-Rad, Richmond, CA). Kontrol- immunpræcipitater blev fremstillet ved anvendelse af 4 ug /ml oprenset muse eller kanin IgG (Antibodies Incorporated, Davis, CA) i stedet for anti-Ar eller anti-Cdc6-antistoffer.

Isolering af DNA Replication Complex fraktion fra Nuclear lysat

Synkroniserede LNCaP celler i G

1 fase (1 time efter frigivelse fra isoleucin-blok) eller i S-fasen (24 timer efter frigivelse fra isoleucin-blok) blev høstet, og det nukleare lysat blev udarbejdet af en let modifikation af metoden ifølge Subramanyam et al [18]. Høstede celler blev pelleteret ved centrifugering i 10 minutter ved 4 ° C ved 2000 rpm i en Sorvall RT7 centrifuge og resuspenderes i buffer A [0,16 M saccharose, 50 mM Tris-HCI (pH 7,6), 25 mM KCI, 10 mM MgC

2, 70 mM HEPES (pH 7,6), 0,025 mM CaCl

2, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 2 mM DTT, 1 mM EDTA] ved en densitet på 2 x 10

7 celler /ml. Cellesuspensionen blev derefter homogeniseret i en motordrevet Wheaton homogenisator (Wheaton Co., Wheaton, IL), indtil -90% af cellerne blev farvet med trypanblåt (som regel tre slag på en rotation indstilling af 3). Den cytosoliske supernatant blev derefter separeret fra den nukleare pellet ved centrifugering i en Eppendorf Centrifuge 5415R ved 6.000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C. Den nukleare pellet blev suspenderet i et volumen buffer A lig med det, der anvendes til homogenisering og to gange underkastet 30 impulser af lydbehandling med en Branson Sonifier 250 (Branson Co., Danbury, CT) sat på en udgang kontrol over 2 og en arbejdscyklus af 20, med intermitterende afkøling på is. Den lydbehandlet kerneekstrakt blev klaret ved centrifugering i en Eppendorf Centrifuge 5415R ved 6.000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C. DNA-replikation kompleks fraktion blev derefter isoleret ved at underkaste den nukleare lysat til saccharosedensitetsgradientcentrifugering væsentlige som beskrevet af Reddy og Pardee [19]. Nuklear lysat (0,5 ml) blev lagt over en 4,8 ml lineær gradient af 20-40% (vægt /volumen) saccharose i buffer A, der igen blev lagt over en sucrose pude 66% (0,5 ml) og centrifugeret i en Beckman SW 50.1 rotor ved 4 ° C i 16 timer ved 35.000 rpm. Gradienten blev derefter opløst i 0,5 ml fraktioner og den hurtigt sedimenterende fraktion, der indeholdt DNA-polymeraseaktivitet er benævnt replitase kompleks fraktion som beskrevet af Murthy og Reddy [20]. Den sammensatte fraktion fra G

1 eller S-fase-celler blev derefter underkastet Western blot-analyse for at vurdere tilstedeværelsen af ​​enzymer af DNA-syntese og regulerende proteiner.

Western blot-analyse

prøver blev opløst i PAGE loading buffer (Bio-Rad, Richmond, CA) og underkastet denaturerende 10% polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og derefter overført til nitrocellulosemembraner. Individuelle membraner blev probet med antistoffer mod AR (AR-N20 eller AR-441), Cdc6 (H-304), prostataspecifikt antigen (PSA, C-19), Lamin B, DNA-polymerase-α (STK1), PCNA (PC10 ), ribonukleotidreduktase (R2, E-16), cyclin A (H-432), cyclin E (C-19) (alle fra Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), p27

Kip-1, cyclin B (BD Transduktion Lab, San Jose, CA), caspase 3 (Cell Signalling, Danvers, MA), eller GAPDH (Chemicon, Temecula, CA). Immunoreaktive bånd blev udviklet ved hjælp af peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer og SuperSignal WestPico kemiluminescerende substrat (Pierce, Rockfold, IL) og visualiseret ved hjælp af X-ray film.

immunfluorescensfarvning og konfokalmikroskopi

LNCaP celler dyrket på objektglas blev vasket en gang med PBS, efterfulgt af fiksering i 3,7% (vol /vol) formaldehyd i 20 minutter ved 22 ° C. Celler blev permeabiliseret i 0,5% (vol /vol) Triton X-100 i 15 minutter og blokeret i 1 time i 2% (vægt /volumen) BSA ved 22 ° C. Objektglas blev derefter inkuberet i 1 time ved 22 ° C med antistoffer mod AR (AR-N20 eller Ar-441) og Cdc6 eller DNA-polymerase-α efterfulgt af både gede-anti-muse-fluorescein (FITC) – og gede-anti -rabbit-tetramethylrhodamin B isothiocyanat (TRITC) -mærket sekundære antistoffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Efter fire vaske med PBS blev objektglassene monteret med Aqua-Poly /Mount (Polysciences Inc., Warrington, PA). Konfokal laser scanning mikroskopi blev udført med et Zeiss LSM 410 opretstående konfokal mikroskop. Billeder blev forarbejdet, og co-lokalisering analyse (der er farvet gul) blev udført med et Zeiss LSM 410 Meta Magnetiseringssystem med indsamling ved 488 og 543 nm. Intensitet Korrelation Kvotienten (ICQ) analyse til beregning AR colokalisering med Cdc6 eller DNA-polymerase-α blev udført ved anvendelse ImageJ software (NIH, Bethesda, MD).

Immunfluorescerende Påvisning af bromdeoxyuridin (BrdU) inkorporeret i DNA

LNCaP-celler dyrket på objektglas blev mærket med 10 uM BrdU (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 30 minutter, vasket en gang med PBS og fikseret i 3,7% formaldehyd i 20 minutter ved 22 ° C. Celler blev permeabiliseret i 0,5% (volumen /volumen) Triton X-100 i 15 minutter og blokeret i 1 time i 2% (vægt /vol) bovint serumalbumin ved 22 ° C. Celler blev derefter farvet med monoklonale muse-antistoffer mod BrdU (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), efterfulgt af gede-anti-muse-FITC-mærket sekundært antistof. Slides blev monteret med Vectashield Mounting Medium indeholdende DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og fotomikrografi blev udført med et Zeiss Axiofot mikroskop udstyret til epifluorescens.

Resultater

Anvendelse af bicalutamid at fastlægge den rolle, af AR i cellecyklus synkroniserede LNCaP celler

AR knockdown strategier er blevet brugt til at vise, at AR er nødvendig for spredning af prostatacancerceller [8], [9], [10], [11], [12]. Men AR knockdown af siRNA eller shRNA kræver behandling af prostata kræftceller over en periode på flere dage. Således kan denne fremgangsmåde ikke anvendes til at identificere, når i cellecyklus (dvs. G

1, S eller G

2 /M faser) AR er påkrævet for proliferation af LNCaP-celler, som hver fase af celle cyklus varer ikke mere end nogle få timer. Derfor brugte vi det ikke-steroide anti-androgen Casodex (bicalutamid) til selektivt og akut inhiberer AR for at bestemme den rolle, AR i progression af synkroniserede LNCaP-celler via G

1 og S faser.

Casodex er normalt bruges ved 10 til 20 uM at hæmme androgen-induceret AR transkriptionel aktivitet; men i disse eksperimenter, er cellerne i kul-strippet serum (CSS) -holdige medium [21], [22]. Dog vil synkroniserede celler frigives til CSS medium ikke fremskridt gennem cellecyklussen. Vi sammenlignede virkningen af ​​bicalutamid på ekspressionen af ​​prostataspecifikt antigen (PSA), et specifikt AR-målgen [23], i LNCaP-celler i FCS- vs. CSS- medium. Androgen-berøvelse af celler i CSS-medium faldt PSA udtryk til -50% af det i kontrol- celler i FCS-medium og Casodex forårsagede et yderligere fald (fig. 1A og 1B). Casodex på 75-100 uM i FCS-medium havde samme effekt på PSA udtryk som 25-50 uM Casodex i CSS-medium (fig. 1A og 1B). Især når den dosisafhængige respons på Casodex afbildes i forhold til sin egen kontrol (i FCS vs. CSS), kurverne overlapper hinanden, hvilket indikerer, at IC

50 at inhibere AR aktivitet er ≈50 uM Casodex i enten FCS eller CSS (fig. 1C). Celler behandlet med 100 pM Casodex i FCS-medium var morfologisk ligner dem behandlet med 20 pM Casodex i CSS-medium, og 100 uM Casodex i FCS-medium forårsagede ingen mærkbar celledød, som bestemt ved ekskluderingsmetode trypanblåt (data ikke vist). Derfor brugte vi 100 uM Casodex, en maksimalt effektiv koncentration, som inhiberer AR-aktivitet, for at bestemme den rolle, AR i proliferation af LNCaP-celler i FCS-medium. Denne koncentration svarer til den, der anvendes til at inhibere PSA ekspression eller væksten af ​​LNCaP-celler i nærvær af FCS [24], [25], [26].

Eksponentielt voksende LNCaP-celler blev vasket to gange med serum- og hormon frit medium og overført til RPMI-medium indeholdende 10% føtalt kalveserum (FCS) eller 6% trækul-strippet serum (CSS). Efter 24 timer blev Casodex tilsat, og cellerne blev inkuberet i yderligere 24 timer. RNA isoleret fra kontrol- og Casodex behandlede celler blev underkastet RT-PCR og QRT-PCR-analyse af PSA som beskrevet i Materialer og Metoder. (A) RT-PCR-produkter af PSA og GAPDH separeret på 1% agarosegel. Forholdet mellem båndet densitet PSA /GAPDH (P /G-forhold) af celler i FCS uden Casodex blev sat til 1,0 og P /G-forhold på andre betingelser behandlingsmuligheder er udtrykt i forhold til denne kontrol. (B) Relativ PSA niveauer som bestemt ved QRT-PCR, er plottet som en funktion af bicalutamid koncentration. Og (C) i forhold PSA niveauer i fig. 1B er plottet som en procentdel af kontrol uden Casodex beregnes særskilt for FCS- og CSS- medium. Lukket cirkel, FCS-medium; og åbne cirkler, CSS-medium. Dataene er repræsentative for to uafhængige forsøg.

LNCaP Cell Ikrafttræden S Phase Kræver Funktionel AR under Mid-G

1 Fase

Vi har tidligere vist, at isoleucin afsavn årsager LNCaP celler til at arrestere i G

0 /G

1 fase [15], [27]. Ved frigørelse fra isoleucin-blok, dvs. overførsel til komplet medium indeholdende FCS (FCS-medium), fremskridt disse celler gennem G

1 og indtast S fase 12 timer efter udgivelsen, og når et højdepunkt af S fase 10-12 timer derefter [15]. Vi har også vist, at bicalutamid behandling i 24 timer fra det tidspunkt, hvor frigivelsen fra isoleucin-blok ophæver cellernes evne til at indtaste S fase [14], [15]. Mens dette foreslog en rolle AR i cellecyklus, kan denne eksperimentelle design ikke skelne mellem en rolle AR i G

1 vs. S-fase. Derfor, for at skelne mellem en inhiberende virkning af Casodex i G

1 vs. i S-fase, behandlede vi synkroniseret LNCaP-celler med Casodex starter ved 0, 4, 8, 12, eller 16 timer efter frigivelse fra isoleucin-blok og bestemte cellers evne til at inkorporere

3H-thymidin (

3H-TdR) ved 20 timer efter frigivelse, en tid, hvor kontrolceller er i S-fasen (se skematisk i fig. 2A). Som vist i fig. 2A, Casodex maksimalt inhiberet

3H-TdR inkorporering hvis tilsat helst under G

1 fase (dvs. 0, 4 eller 8 timer efter frigivelse), hvilket indikerer en rolle AR i G

1. Derimod blev Casodex effekten stumpe hvis behandlingen blev udskudt til 12-16 timer efter frigivelse fra isoleucin-blok, en tid, hvor cellerne har allerede forpligtet sig til at indtaste S fasen. Casodex behandling af celler, der allerede havde indtastet S fase (16 timer efter frigivelse fra isoleucin-blok) havde meget lille effekt på

3H-TdR inkorporering (Fig. 2A). Således den inhiberende virkning af Casodex forekommer i G

1 fase, når celler forbereder at komme ind i S-fasen, og ikke i S-fase. Derfor er AR påkrævet i G

1 for celler til at indtaste S fasen.

LNCaP celler blev synkroniseret med isoleucin-afsavn og frigives i komplet medium. A) Casodex blev tilføjet på det angivne tidspunkt efter frigivelse fra isoleucin-blok og vedligeholdes i mediet, indtil

3H-TdR inkorporering blev bestemt ved 20 timer efter frigivelse fra isoleucin-blokken. Resultaterne er udtrykt som en procentdel af

3H-TdR inkorporering i kontrol celler, der blev frigivet i komplet medium i fravær af bicalutamid. A) Casodex blev sat for en 4-timers periode, som vist i det øverste panel, og

3H-thymidin (

3H-TdR) inkorporering i DNA blev bestemt hver 4 timer efter frigivelse fra isoleucin-blok og efter fjernelse af bicalutamid. Hvert datapunkt er gennemsnittet af tredobbelte prøver med 10% variation; viste data er repræsentative for to uafhængige forsøg.

Vi bestemmes derefter når i G

1 fase Casodex er mest effektive til at undertrykke celle indrejse i S-fasen. Vi pulsstyrede behandlet synkroniserede LNCaP celler med Casodex under den første, anden eller tredje 4-timers interval efter frigivelse fra isoleucin-blok, svarende til tidlig-G

1, mid-G

1, eller sent-G

1, henholdsvis og bestemmes hastigheden af ​​

3H-TdR inkorporering i DNA ved 4-timers intervaller i 24 timer (se skematisk af fig. 2B). Vi har tidligere vist, at

3H-TdR inkorporering tilbyder en pålidelig og reproducerbar metode til at overvåge udviklingen af ​​synkroniserede celler fra G

1 til S-fasen og bekræftes af flowcytometri analyse samt ekspression af S fase- specifikke cycliner og aktiveringen af ​​cyclinafhængige kinaser [14], [15]. Som vist i fig. 2B, behandling med bicalutamid i midten af ​​G

1 (4-8 timer efter frigivelse fra isoleucin-blok) var mere effektiv til at blokere adgang til S-fasen, end det var behandling i den tidlige-G

1 (0-4 timer efter frigivelse fra isoleucin-blok) eller sent-G

1 fase (8-12 timer efter frigivelse fra isoleucin-blok). Dette tyder på AR involvering i cellecyklus regulerende begivenheder i midten af ​​G

1 fase, der er kritiske for LNCaP celler til at komme videre fra G

1 til S.

AR interagerer med Cdc6, en kritisk komponent i Pre-RC kræves for forsamlingen af ​​Replication Maskiner i S-fasen LNCaP celler

Siden Casodex behandling i midten af ​​G

1 blokerede evne synkroniserede LNCaP celler til at indtaste S-fasen (fig. 2), vi testede, om AR interagerer med regulerende proteiner involveret i samlingen af ​​præ-RC, som samlingen af ​​præ-RC i midten til slutningen-G1 er påkrævet for celler til at komme ind i S-fasen og initiere DNA-syntese. Cdc6 binding til oprindelsesstedet anerkendelse kompleks (ORC) er det første trin i processen af ​​præ-RC samling [16]. Vi observerede, at en immunpræcipitat fremstillet ved anvendelse Cdc6-specifikke antistoffer (Cdc6-IP) indeholdt AR, hvilket tyder AR interaktion med Cdc6 (fig. 3A). Denne interaktion er specifik, da en af ​​de mest rigeligt udtrykte proteiner, prostata-specifikt antigen (PSA), blev i LNCaP-celler ikke forbundet med Cdc6-IP (fig. 3A). Vi har tidligere vist, at interaktionen mellem cellecyklusregulerende proteiner og enzymer af DNA-syntese i en række celler fører til samling af et multienzymkoblede kompleks kaldet replitase eller DNA-replikation maskiner [28], [29], [30]. Disse komplekser er let påviselige i celler, der er i S-fase, men ikke noget tidspunkt under G1-fasen [29], [30]. Derfor testede vi, om AR-Cdc6 interaktion er en cellecyklus-afhængig fænomen. Som vist i fig. 3B, skønt Cdc6 var til stede på et lavt niveau i G 1-fase celler

, blev dets associering med AR-IP set i synkroniserede LNCaP-celler, der var i S-fase, men ikke i dem, der var i G

1 fase. Til sammenligning lamin B, en nuklear protein, viste meget lille forskel i samarbejde med AR-IP fra G

1 vs S fase celler (fig. 3B). Således AR udviser en cellecyklus-afhængig interaktion med Cdc6.

A) Cdc6-IP blev fremstillet ud fra eksponentielt voksende LNCaP-celler og blev underkastet Western blot-analyse. B) AR-IP’er blev fremstillet fra synkroniseret G

1 fase (1 time efter frigivelse fra isoleucin-blok) eller S-fase (20 timer efter frigivelse fra isoleucin-blok) LNCaP-celler og underkastet Western blot analyse. IgG tung kæde i AR-IP og IgG-IP er angivet med pilen.

Casodex afbryder AR-Cdc6 Interaktion

Da AR er impliceret at spille en rolle i reguleringen af ​​Cdc6 udtryk [14], [31], testede vi, om Casodex-induceret blokade af indførelsen af ​​LNCaP-celler i S-fase skyldes et fald i Cdc6- proteinniveauer. Faktisk under de eksperimentelle betingelser, der anvendes i den foreliggende undersøgelse, Casodex havde ingen mærkbar virkning på hverken Cdc6 eller AR proteinniveauer i eksponentielt voksende LNCaP-celler (fig. 4A, input). Alligevel Casodex forstyrret AR interaktion med Cdc6 som indikeret ved tilstedeværelsen af ​​Cdc6 i AR-IP kontrol- celler, men ikke i den af ​​bicalutamid behandlede celler (fig. 4A, AR-IP). Denne Casodex-induceret afbrydelse af AR association med Cdc6 blev yderligere understøttet ved konfokal mikroskopi (figur 4B.); vi observeret en mærkbar nedgang i colokalisering af AR med Cdc6 i kernerne i Casodex behandlede celler (ICQ = 0,059 ± 0,022 SD) sammenlignet med kontrolceller (ICQ = 0,152 ± 0,047 SD). Således Casodex-induceret suppression af indførelsen af ​​LNCaP-celler i S-fasen er forbundet med forstyrrelser af AR-Cdc6 interaktion.

A) Eksponentielt voksende LNCaP-celler blev behandlet med bicalutamid eller vehikel (kontrol) i 24 timer og AR-IP forberedt fra behandlede og kontrolceller blev underkastet Western blot-analyse til påvisning af AR og Cdc6. B) LNCaP-celler dyrket på objektglas blev synkroniseret ved isoleucin-berøvelse og frigives til komplet medium i nærvær af bærer (kontrol) eller bicalutamid. 24 timer efter frigivelse fra isoleucin-blok (når kontrolceller forventes at træde S-fase), blev celler fikseret og forarbejdet til immunoflourescent farvning ved anvendelse af anti-AR (AR-441) monoklonalt muse og anti-Cdc6 (H-304) kanin polyklonale antistoffer.

AR interagerer med S Phase cycliner

Udover Cdc6, nogle af cellecyklus regulerende proteiner, såsom cycliner E og A, spiller også en vigtig rolle i forsamlingen af præ-RC i G

1 [16]. Derfor testede vi, om AR interagerer med nogen af ​​de cycliner, der vides at være involveret i progression af celler fra G

1 til S-fasen (viz., Cycliner E og A) og G

2 /M ( nemlig., cyclin B) faser i LNCaP-celler. Vi observerede, cyclin E og cyclin A, men ikke en mitotisk cyclin, cyclin B, var forbundet med AR-IP forberedt fra eksponentielt voksende LNCaP-celler (fig. 5). Til sammenligning GAPDH, et cytosolisk markør, var ikke forbundet med AR-IP. Således AR udviser en specifik interaktion med cellecyklus regulerende proteiner, der er involveret i reguleringen af ​​celle indrejse i S-fasen.

AR-IP forberedt fra eksponentielt voksende LNCaP celler blev udsat for Western blot analyse.

AR interagerer med enzymer af DNA Synthesis

da CDC-6-afhængige samling af præ-RC fører til rekruttering af enzymer af DNA-syntese til de steder, hvor DNA-replikation [16], og siden AR interagerer med Cdc6 (fig. 3), testede vi, om AR-IP indeholder også enzymer af DNA-syntese. Som vist i fig. 6, observerede vi, at AR-IP fremstillet under anvendelse af to forskellige AR antistoffer (AR-N20 og AR-441) indeholdt DNA-polymerase-α, et nøgleenzym involveret i initiering af DNA-syntese (fig. 6A). AR interaktion med DNA-polymerase-α blev yderligere bekræftet ved immunoflourescent konfokal mikroskopi (figur 6B.); vi observeret en stærk co-lokalisering af AR med DNA-polymerase-α (ICQ = 0,45 ± 0,016 SD) i kernerne i LNCaP-celler. Ud over DNA-polymerase-α, AR-IP fremstillet ved anvendelse AR-441 og AR-N20 antistoffer indeholdt prolifererende cellekerneantigen (PCNA), en ekstra protein af DNA-polymerase, og den katalytiske underenhed af ribonukleotidreduktase (RNR2), som omdanner ribonukleotider til deoxyribonukleotider kræves til DNA-syntese (fig. 6C). Ud over sin rolle i proliferation [8], [9], [10], [11], [12], AR er også rapporteret at spille en kritisk rolle i overlevelsen af ​​LNCaP-celler, som AR knockdown fører til apoptotisk celledød [32]. testede vi derfor, om den rolle, AR i regulering af apoptose involverer også sin interaktion med apoptotiske proteiner. Som vist i fig. 6A, caspase-3, en apoptotisk enzym, blev ikke påvist i AR-IP’er. Således AR udviser en selektiv vekselvirkning med enzymerne DNA syntese er nødvendig for proliferation af LNCaP-celler.

AR-IP indeholder DNA-polymerase-α. AR-IP forberedt fra eksponentielt voksende LNCaP-celler ved anvendelse af anti-AR muse monoklonal (441) eller kanin polyklonalt (N-20) antistoffer blev underkastet Western blot-analyse. B) AR er colocalized med DNA-polymerase-α i LNCaP-celler. Eksponentielt voksende LNCaP-celler på objektglas blev fikseret og farvet med anti-AR (N-20) kanin polyklonalt og anti-DNA-polymerase-α (STK1) monoklonale museantistoffer og konfokal mikroskopi blev udført. C) AR-IP indeholder PCNA og ribonukleotidreduktase.