PLoS ONE: Udnyttelse Opløselig NK Cell Killer Receptorer for Generation of Novel Cancer Immun Therapy

Abstrakt

De naturlige cytotoksiske receptorer (NCRs) er et unikt sæt af aktiverende proteiner udtrykkes primært på overfladen af ​​naturlige dræberceller ( NK) celler. De NCRs, som omfatter tre medlemmer; NKp46, NKp44 og NKp30 er kritisk involveret i NK cytotoksicitet mod forskellige mål, herunder en bred vifte af tumorceller afledt af forskellige oprindelser. Selvom tumor ligander af de NCRs ikke er blevet identificeret endnu, kan selektiv måde, hvorpå disse receptorer målrette tumorceller giver et fremragende grundlag for udviklingen af ​​hidtil ukendte anti-tumor-terapier. For at teste den potentielle anvendelse af de NCRs som antitumormidler, genereret vi opløselige NCR-Ig-fusionsproteiner, hvori den konstante region af human IgG1 blev fusioneret til den ekstracellulære del af receptoren. Vi demonstrerer, ved hjælp af to forskellige humane prostatakræft-cellelinier, at behandling med NKp30-Ig, dramatisk hæmmer tumorvækst

in vivo

. Aktiverede makrofager blev vist at mediere en ADCC respons mod de NKp30-Ig coated prostatacellelinjer. Endelig blev Ig-fusionsproteiner også vist at skelne mellem godartet prostatahyperplasi og prostatacancer. Det kan give en roman diagnostisk modalitet i den vanskelige opgave at skelne mellem disse meget almindelige patologiske tilstande

Henvisning:. Arnon TI, Markel G, Bar-Ilan A, Hanna J, Fima E, Benchetrit F, et al . (2008) Udnyttelse Opløselig NK Cell Killer Receptorer for Generation of Novel Cancer Immunterapi. PLoS ONE 3 (5): E2150. doi: 10,1371 /journal.pone.0002150

Redaktør: Fu-Sheng Wang, Beijing Institute of Infectious Diseases, Kina

Modtaget: 12. februar 2008; Accepteret: April 1, 2008; Udgivet: May 14, 2008

Copyright: © 2008 Arnon et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Immun mekanismer menes at yde væsentlig beskyttelse mod. udvikling af kræftsygdomme. Studier af humane patienter og musemodeller har vist, at mangler i vigtige immunologiske komponenter fører til øget følsomhed over for udviklingen af ​​kræft [1] – [3]. Naturlige dræberceller (NK) celler er en vigtig undergruppe af cytotoksiske lymfocytter, der hører til det medfødte immunrespons og er bedst karakteriseret ved deres evne til spontant at dræbe virusinficerede og tumorceller [4]. Effektiviteten hvorved NK-celler ødelægge en lang række cellelinier antyder en vigtig rolle i immunosurveillance. Faktisk akkumulerende kliniske og eksperimentelle data viser betydningen af ​​NK-aktivitet i kræft elimination

in vivo

; i mus, til udtømning af NK celler resulterer i en signifikant forøget modtagelighed kemisk induceret kræft [1], mens i leukæmipatienter reduceret NK cytotoksicitet blev vist til nøje korrelerer med øget sygdomsprogression [5].

aktivering af NK-celler reguleres af et sæt af overfladereceptorer, der enten inducerer eller inhiberer den cytotoksiske respons [4], [6]. Den vigtigste mekanisme, der styrer NK hæmning er baseret på anerkendelsen af ​​MHC klasse I molekyler ved NK-hæmmende receptorer, såsom killer-Ig-lignende receptorer (Kirs) og CD94 /NKG2A kompleks. Denne mekanisme sikrer, at NK-celler kontinuerligt inhiberes fra at dræbe raske celler, der udtrykker normale niveauer af MHC klasse I proteiner [7]. Men mens MHC klasse I-ekspression er vigtig for at inhibere NK cytotoksicitet, nedregulering er ikke nok til at fremkalde en reaktion, som specifikke aktiveringssignaler også er nødvendige. Disse signaler tilføres af et sæt af lysis receptorer, som genkender ikke-MHC klasse I-ligander udtrykt på målceller [8]. Således NK-celler er ikke kun i stand til at afføle fraværet af MHC klasse I proteiner, men er også udstyret med overfladereceptorer, der tillader specifik påvisning af deres mål.

Den vigtigste NK aktiverende receptorer er involveret i genkendelse og drab af tumorer omfatter NKG2D homodimer og de tre naturlige cytotoksiske receptorer (NCRs) NKp46, NKp44 og NKp30 [8]. Det relative bidrag fra hver af disse receptorer til NK cytotoksicitet mod tumorer varierer, hvilket indikerer, at der findes forskellige specifikke lysis ligander [9]. Faktisk har flere inducerbare cellulære proteiner blevet identificeret som ligander til NKG2D receptor:. MHC klasse I kæden relaterede antigener (glimmer samt MICB) og UL16-bindende proteiner (ULBP1-4) [10]

kontrast til NKG2D, de cellulære ligander af NCRs er i øjeblikket ukendt, og de eneste NCRs ligander identificeret hidtil er viralt afledte proteiner [11] – [14]. betydelige beviser indikerer imidlertid, at cellulære ligander for de NCRs findes, og at deres ekspression er kritisk for evnen af ​​NK-celler til at ødelægge tumorer [9], [15] – [17]. Disse resultater understøttes af kliniske undersøgelser, der viser for flere tilfælde af AML en sammenhæng mellem lave niveauer af NCRs ligander i AML-patienter og en dårlig prognose af sygdommen [18]. Desuden har vi for nyligt vist, at deletion af et enkelt NCR genet, NKp46 muse homologen (NCR1), reducerer evnen af ​​NK-celler til at rydde tumorceller

in vivo

[19].

i det sidste årti, har cancerimmunterapi undersøgelser udførligt fokuseret på forsøg på at udnytte den meget specifikke karakter af den adaptive immunreaktion til udvikling af nye behandlinger. Denne fremgangsmåde førte til generering af flere humaniserede antistoffer rettet mod specifikke tumorantigener. Den imponerende kliniske succes af antistoffet-baseret behandling åbnede porten for en intensiv søgning efter yderligere meget specifikke tumormarkører og siden 1995 flere antistoffer er blevet godkendt til klinisk brug, mens flere er ved at blive evalueret i onkologi forsøg [20], [21] .

for at udvide denne metode, har forskellige værktøjer er anvendt i et forsøg på at identificere nye tumorantigener, der ville være egnet til en bredere vifte af kræft og stadig bevare selektiv anerkendelse. De NCRs repræsenterer et enestående eksempel for proteiner, der har erhvervet en sådan bred specificitet og er meget tilpasset til at genkende cancerceller. At omsætte dette potentiale til et terapeutisk værktøj, har vi frembragt immunglobulin (Ig) fusionsproteiner, der indeholder den ekstracellulære del af receptoren fusioneret til den konstante region af human IgG1. Således ligner det antistofbaserede tumorterapi tilgang, vi hypotese de NCR-Ig-fusionsproteiner kan anvendes som “målrettede missiler«; den ekstracellulære del tilvejebringer tumorspecificitet mens den konstante region af den humane IgG1 (Fc) tillader rekruttering af immune komponenter, som øger specifik tumor elimination. Her viser vi den potentielle anvendelse af sådan terapi under anvendelse af humane prostatakræft modeller.

Materialer og metoder

Celler

Vi bruges human prostatacancer-cellelinie DU145 og den humane prostata cancer cellelinje PC3 /

Luc

, der blev fremstillet som beskrevet før [14]. Kort fortalt PC3.38, en klon af den humane prostata-adenocarcinom-cellelinie, afledt af PC3 (ATCC, CRL-1435), blev inficeret med rekombinant rLNC /

Luc

retrovirus (udtrykkende luciferasegenet nedstrøms til CMV-promotoren) og udvalgt af G418 (400 ug /ml) generering PC3 /

Luc

klon. Stabil udtryk for luciferase i cellekultur blev rutinemæssigt bekræftet ved hjælp af CCCD kameraet.

Fusion proteiner og flowcytometri analyse

Produktionen af ​​NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, NKp46D1-Ig og CD99- Ig blev beskrevet før [13]. Styr humant IgG1 protein (hlgG1 kappa, PHP010) blev købt fra Serotec (Oxford, UK).

Immunhistokemi

prostata væv, både hyperplasisk og maligne, er fastsat i bufferet formalin. Mikrobølgeopvarmning af de formalinfikserede, paraffinindlejrede vævssnit i citratbuffer blev udført for at hente antigener. Sektioner blev derefter farvet med forskellige NCR-Igs eller kontrol-Ig (8 pg /ml, slutkoncentration) efterfulgt af biotinyleret ged-anti-human-Fc (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Til detektion blev avidin-biotin peroxidase-kompleks metode anvendt med Vectastain kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Farvning blev gradueret som procentdelen af ​​positive prostataceller (hyperplasisk eller maligne) fra i alt 100 celler. Vi evaluerede også intensiteten af ​​farvningen som 0 = ikke, 1 = svag, 2 = moderat og 3 = stærk. Farvede snit blev analyseret ved to patologer. Immunohistokemiske resultater blev betragtet som positive, når procentdelen af ​​positivt farvede prostata celler overgik 50%, og intensiteten var højere end 1.

Tumor implantation og behandling

For DU145 model, vi s.c. injiceret mandlige nøgne mus med det humane prostata tumor line DU145 (4 × 10

6). To uger efter injektion, når tumorerne blev synlige, blev mus behandlet med NKp30-Ig, NKp46D2-lg, kontrol humant IgG1 eller PBS. Behandlinger blev administreret 5 gange (dag 2, 7, 15, 25 og 34) og omfattede en initial større dosis af proteinerne (20 mg /kg) efterfulgt af lavere doser (10 mg /kg). Tumorudvikling blev vurderet hver tredje dag ved at måle diameteren af ​​tumorerne.

I PC3 /

Luc

model, mandlige nøgne mus (4-8 uger gamle) blev injiceret med 15 × 10

6 PC3 /

Luc

celler i sc rum i venstre flanke af hver mus. Tre uger efter tumorimplantation blev musene injiceret i.p. med 4 ug /kg NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, kontrol humant IgG1 eller PBS hver anden dag over en periode på 3-4 uger.

Imaging tumor PC3 /

Luc

xenografter

Alle mus blev overvåget for tumor ekspression før og ved afslutningen af ​​behandling procedurer. Kun de mus, der inden for 21 dage fra injektion udtrykte en detekterbar størrelse tumor, som bedømt ved den CCCD kamera, blev valgt til yderligere manipulationer. Før billeddannelse blev mus bedøvet med 4% chloralhydrat (Fluka-Sigma, Israel). Fem minutter før billeddannelse blev mus injiceret i.p. med 126 mg /kg legemsvægt af vandig opløsning af Beetle lucifering (Promega Corp., Madison, WI). Musene blev derefter anbragt i et lystæt kammer i et CCCD kamerasystem (Roper Scientific, Princeton Instrument, Trenton NJ) og fotograferet først med en suppleret kontrolleret lys for at tage en grå-skala organ referencebilledet. Fotoner udsendt fra musen blev derefter detekteret i fuldstændig mørke, opsamlet og integreret i en periode på 2 min. En pseudo farve repræsenterer lysintensiteten (blå som mindst intens og rød som den mest intense). Målinger er en integration af den samlede sum af signaler detekteret, trækkes af baggrunden integreret lys, der udsendes fra en tilsvarende område i den samme mus.

Farmakokinetisk analyse

in vivo

Kvindelige CB17.SCID mus injiceret ip med en enkelt dosis (5 mg /kg legemsvægt) af NKp46D2-lg eller NKp30-lg. Niveauer af fusionsproteiner i serum blev bestemt på forskellige tidspunkter, herunder 0 (før dosis) 0,25, 0,5, 1, 2, 6, 24, 48, 96, 168, 216, 264 og 336 timer efter dosis-indgivelse. På hvert tidspunkt blev 3 mus blev aflivet blodprøver opsamlet i separation rør, som blev inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter før centrifugering (for at tillade størkning). Efter 30 minutter blev rørene straks centrifugeret (10 minutter ved 10.000 rpm ved stuetemperatur), og serum blev opsamlet. Niveauer af NKp30-Ig eller NKp46D2-Ig fusionsproteiner i serum blev analyseret ved hjælp af en standard ELISA-assay.

Apoptose assay

PC3 /

Luc

eller DU145 celler (50.000 /ml) blev inkuberet med 5, 10 eller 50 ug /ml NKp30-lg, NKp46D2-lg, NKp46D1-Ig eller PBS i 2 timer på is. Cross -linking antistof (mod humant IgG1) blev derefter tilsat ved slutkoncentrationer, der er lig med 1/10 af mængden af ​​fusionsprotein tidligere tilsat (0,5, 1 eller 5 ug /ml). Celler blev derefter inkuberet ved 37 ° C i 48 timer, og procentdelen af ​​apoptotiske celler blev bestemt ved anvendelse af en standard Annexin V /PI analyse.

Makrofager-medieret drab assays

Som effektorceller vi brugte peritoneale makrofager afledt af CD1 nøgne mus 5 dage efter Thioglycolat injektion. Hentede makrofager var end aktiveres i 2 timer med LPS (1 mg /ml). Radioaktivt mærkede PC3 /

Luc Salg eller DU145 celler (1 * 10

4 /brønd ved flad plade med 96 brønde) blev inkuberet med LPS-aktiverede makrofager ved de angivne E:T nøgletal. Specifik lysis blev bestemt efter 48 timer.

Resultater

Anerkendelse af maligne primære humane prostata kræft ved NKp30 og NKp46

NKp46 og NKp30 er constrictively udtrykkes på overfladen af ​​hvile som samt aktiverede NK-celler og er overvejende involveret i drabet på forskellige tumorcellelinjer

in vitro

. Men da de cellulære ligander af disse receptorer er stadig ukendt, lidt om deres udtryk mønster og fordeling i forskellige patologiske indstillinger.

Prostatakræft er den hyppigst diagnosticerede solid tumor blandt mænd i USA og næststørste årsag til kræftdødsfald i vestlige lande [22]. Desværre findes der ingen effektive terapier til rådighed i dag for den fatale hormonresistent fase af sygdommen. For at teste, om humane prostata tumorer er anerkendt af NCRs vi farves PC3 /

Luc

og DU145 cellelinier med NKp30 og NKp46 proteiner fusioneret til humant IgG1. Vi har tidligere vist, at bindingsstedet for NKp46 til forskellige tumorer er placeret på membranen proximale domæne og dampen region af receptoren (D2), og at ekspressionen af ​​D2 fusioneret til humant IgG (NKp46D2-Ig) muliggør bedre anerkendelse af mål celler [13]. Som vist i figur 1a og b, både PC3 /

Luc Salg og DU145 celler blev specifikt farvet med NKp30-lg og NKp46D2-Ig, men ikke af de kontrol CD99-Ig (grå histogrammer), hvilket tyder ekspressionen af ligander til disse to NK aktiverende receptorer på prostata tumorcellelinier.

(a, b) NKp30-lg og NKp46D2-Ig binder specifikt til humane prostatacellelinjer. PC3 /

Luc

(a) og DU145 (b) cellelinier blev farvet med NKp30-Ig, NKp46D2-Ig eller kontrol CD99-lg, efterfulgt af PE-konjugeret muse-anti-humant IgG1 antistof. Grå histogrammer repræsenterer baggrundsfarvning af kontrolsystemet CD99-lg-fusionsproteinet og de sorte tomme histogrammer repræsenterer farvning med enten NKp30-lg eller NKp46D2-Ig, som angivet i toppen af ​​hvert histogram. Dette tal repræsenterer et eksperiment ud af tre udført. (C) immunhistokemisk farvning af primære humane prostata-adenocarcinom og godartet prostatahyperplasi (BPH) ved NKp30-lg og NKp46D2-Ig. Cuts fra formalin-fikseret og paraffin-indstøbt menneskelige prostata adenokarcinom (øverste panel) og BPH (nederste panel) blev antigen-hentes af mikrobølge-citrat behandling. Objektglas blev derefter farvet med NKp30-Ig, negativ kontrol CD99-lg eller NKp46D2-lg, efterfulgt af biotinyleret ged-anti-human-Fc og avidin-biotin-HRP-kompleks. Substrat for HRP var AEC (rød farve) og dias blev counter-farvet med Hematoxylin. Figuren viser et repræsentativt farvning på X400 forstørrelse. Arrow i NKp30-Ig-farvning af adenocarcinom (øverste venstre panel) peger på en repræsentativ membran farvning. Farvningsintensitet for øverste til venstre og højre felter betragtes som 2 (se fremgangsmåder). (D) Angivelse af NKp30 og NKp46 ligander er rigelige på maligne prostata tumorer. Udskæringer fra forskellige patienter, der lider af godartet (

n

= 8) eller ondartet (

n

= 9) prostatatumorer blev fremstillet og farvet som ovenfor. Farvning blev udført i triplikater. Analyse af farvningsintensitet (0-3) og procentdelen af ​​farvede tumorceller blev udført ved to patologer. Positiv farvning blev defineret, da farvning intensitet var over 1 og omfattede mindst 50% af cellerne, som beskrevet i “materialer og metoder”.

For at besmykke vores observationer, vi analyserede udtryk for ligander til NKp30 og NKp46 på primær prostataadenocarcinom og benign prostatahyperplasi (BPH) afledt af humane patienter. Formalin-fikserede paraffin-indlejrede prostatacancerformer blev farvet med NKp30-Ig, NKp46D2-Ig eller kontrol fusionsproteiner (såsom CD99-Ig). Figur 1c viser repræsentative eksempler på farvede væv og figur 1d opsummerer de opnåede resultater fra 9 adenokarcinom og 8 godartede prostata cancer væv. Som vist, blev 7/9 og 5/9 prostata adenokarcinomer positivt farvet af NKp30-Ig og NKp46D2-Ig, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​ligander for NKp30 og NKp46 på de maligne celler. Udtrykket af disse antigener omfattede 50-95% af tumorceller med forskellige grader af intensitet og viste både intracellulære og membranal fordeling (figur 1c, pil øverst til venstre panel peger på membran farvning). I modsætning hertil alle BPH sektioner testes, blev negativt farvet af NKp30-lg eller NKp46D2-Ig, som i de fleste tilfælde mindre end 10% af cellerne blev farvet og intensiteten var bellow 1. Det er vigtigt, hverken adenocarcinomer eller de BPH snit blev farvet ved kontrol Ig fusionsproteinet CD99-Ig (og andre kontrol proteiner, data ikke vist). Disse resultater viser, at på samme måde til prostatakræft-cellelinier dyrkes i kultur, primær afledte tumorer selektivt udtrykke ligander for NK lysis receptorer NKp30 og NKp46D2. Desuden er udtryk for disse ukendte ligander inducerede kun på senere stadier af sygdommen, hvor adenocarcinom allerede har udviklet sig.

NKp30-Ig hæmmer væksten af ​​prostatakræft cellelinie DU145

in vivo

Ig-fusionsproteiner er tidligere blevet anvendt som effektive terapeutiske midler i klinisk praksis [23]. Her demonstrerer vi, at både NKp30-Ig og NKp46D2-Ig binder specifikt humane væv afledt af patienter med prostatacancer, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​specifikke (selvom ukendt) ligander (figur 1b og c).

For at bestemme om NKp30 og NKp46D2 fusioneret til humant IgG1 kunne mediere effektiv anti tumorrespons

in vivo

injicerede vi nøgne mus med det humane prostata tumor line DU145. To uger efter injektion, når tumorerne blev synlige, (defineret som dag 1 i figur 2) mus blev behandlet med NKp30-Ig, NKp46D2-lg, kontrol humant IgG1 eller PBS (note legenden til figur 2 for behandlingsforløb og evaluering vækst) . I begge kontrolgrupper modtager humant IgG1 (

n

= 10) eller PBS (

n

= 10), demonstrerede dyrene en hurtig vækst af tumorer (figur 2). Tilsvarende NKp46D2-Ig-behandlede mus (

n

= 9) viste en gradvis stigning i tumorer størrelse, hvilket indikerer nogen terapeutisk virkning. I modsætning hertil behandling med NKp30-Ig (

n

= 10) resulterede i en bemærkelsesværdig undertrykkelse af tumorudvikling; fra andet administration af NKp30-Ig (på dag 7), tumorer størrelse forblev konstant i tre uger, og kun en moderat progression blev påvist i de følgende dage (figur 2). Desuden i 5 ud af 10 mus, der blev injiceret med NKp30-Ig, tumorer forsvandt efter den anden injektion (dag 7) og ikke igen selv op til to måneder efter den sidste injektion.

Male nøgne mus injiceret med den humane prostata tumor line DU145 (4 × 10

6), blev behandlet med NKp30-Ig (

n

= 10), NKp46D2-Ig (

n

= 9) , styre humant IgG1 (

n

= 10), eller PBS (

n

= 10). Dag 1 er defineret på to uger efter injektion, når tumorer blev synlige. Behandlinger blev administreret 5 gange (dag 1, 7, 15, 25 og 34, markeret med pile) og omfattede en initial større dosis af proteinerne (20 mg /kg) efterfulgt af lavere doser (10 mg /kg). Tumorudvikling blev vurderet hver tredje dag ved at måle diameteren af ​​tumorerne. Graferne viser den gennemsnitlige diameter (mm) af tumorerne i hver gruppe målt i dage 1-45.

Behandling med NKp30-Ig reducerer PC3 /

Luc

tumorvækst

in vivo

at studere en kompleks biologisk proces, såsom tumorvækst og terapi effekt

in vivo

kræver en model, der er både følsom og præcis nok til at opdage selv subtile udvikling. For nylig, en ny bioluminescens baseret imaging teknologi, der tillader ikke-invasiv påvisning af tumorceller

in vivo

blev rapporteret [14], [24]. Denne strategi bygger på engraftment af menneskelige kræftformer, der stabilt udtrykker et reportergen, såsom

luciferase

(

Luc

), i mus. Ekspression af luciferase muliggør

in vivo

overvågning af den relative størrelse og fordeling af tumorer og kan derfor også opdage metastatisk udvikling. Desuden er dette system er meget følsomt og pålideligt i detektering af mindre tumorer, der er vanskeligt eller endog umuligt at sanse i andre fremgangsmåder, såsom direkte tumorstørrelse målinger eller FACS-analyse af tumorekstrakter [24]. Af denne grund har vi benyttet human prostatacancer-cellelinie PC3 mærket ved stabil ekspression af luciferasegenet (PC3 /

luc

), som tidligere blev anvendt i andre lignende

in vivo Salg modeller [14 ].

for at overvåge effekten af ​​NKp30-Ig og NKp46D2-Ig fusionsproteiner på progression af PC3 /

luc

prostatakræft cellelinje

in vivo

, vi injicerede mandlige nøgne mus med PC3 /

luc

celler. Tre uger efter injektion (betegnet som “startpunkt”) blev tumorvækst vurderet af CCCD kamera og de mus udtrykkende tumorer, der var stort nok til at transmittere et integreret signal intensitet på 100 fotontællinger og derover, blev valgt til yderligere behandling med NKp30 -lg (

n

= 16), NKp46D2-Ig (

n

= 9) eller med PBS som kontrol (

n

= 8). Behandlingen omfattede en i.p. injektion af PBS eller 4 mg /kg legemsvægt af det relevante fusionsprotein, gives hver anden dag i en måned. I slutningen af ​​behandlingsperioden (betegnet som “slutpunkt”), blev tumorstørrelse igen evalueret i CCCD kameraet.

Som vist i figur 3a og sammenfattet i figur 4b, behandling af mus med NKp30-Ig havde en dramatisk effekt på tumorvækst. Mens i kontrolgruppen (figur 3c og 4), hurtig stigning i tumorstørrelse blev observeret i næsten alle dyr (87,5%), NKp30-Ig-treatement ført til en betydelig reduktion i tumorudvikling; i 50% af de mus behandlet med NKp30-Ig tumoren blev drastisk reduceret til 20% eller bælg af den oprindelige størrelse (betragtes som »effektive behandling«), 25% viste partiel effekt, mens 25% ikke reagerede og udviklet progressive tumorer. Desuden er der i de mus, hvor effektiv behandling blev opnået, blev der ikke observeret tilbagefald endda 3 måned efter den sidste NKp30-lg administration. Vigtigere, NKp30-Ig terapeutisk virkning var ikke afhængig af den oprindelige størrelse af tumoren, som reaktionsevne eller passivitet ikke korrelerer med det første signal detekteres fra tumoren, som målt i »start point ‘(angivet i Tallene over hver kolonne) .

Mandlige nøgne mus blev injiceret med PC3 /

luc

tumorceller (15 × 10

6) ind i SC venstre flanker. Tre uger efter tumor implantering blev mus injiceret (ip) hver anden dag over en periode på en måned med 4 mg /kg NKp30-Ig (

n

= 16) (a), NKp46D2-Ig (

n

= 9) (b) eller PBS (

n

= 8) (c). Tumorprogression blev overvåget ved måling af lysemissionen fra hver individuel mus i indledningen ( »startpunkt”) og i sidste ende (enden punkt «) i behandlingsperioden. Y-akser repræsenterer de relative (i procent) ændringer i tumorstørrelse efter behandling, som beregnes ud fra den integrerede lys emission målt i hvert tidspunkt (angivet tal over kolonner). Krympning af tumoren med 20% eller under dets oprindelige størrelse blev omtalt som “effektiv behandling”. Dette tal er et sammendrag af to eksperimenter og omfatter alle de mus, der blev testet.

NKp30-Ig behandling signifikant undertrykt vækst i både DU145 og PC3 /

Luc

, men med en mere fremtrædende effekt på PC3 /

Luc

(tallene 2-4). Dette kunne ikke tilskrives forskelle i ligand udtryk (figur 1a) og kunne afspejle den øgede progressive vækst i DU145 forhold til PC3 /

Luc

. I modsætning til NKp30-Ig og i forståelse med de resultater, der præsenteres ovenfor (figur 2), NKp46D2-Ig behandling havde kun en marginal effekt (figur 3b og 4); 66,6% af de mus behandlet med NKp46D2-Ig viste progressiv tumorvækst, mens 22,2% og 11,1% delvist blev helbredt eller behandles effektivt, hhv.

(a) Visualisering af tumor progression og distribution

in vivo

. Figuren viser et billede visualisering af en repræsentant dyr af hver behandling. Skalaen på højre side af hver figur beskriver farven kort over fotontælling. Den integrerede lys emission ( ‘I’) er angivet i venstre side af hvert foto. (B) Resume af behandlingseffekt. Tabel beskriver den samlede virkning af behandlinger, som vist i detaljer i figur 3.

Figur 4a viser en illustration af en repræsentant mus fra hver behandlingsgruppe. I de fleste tilfælde blev der ikke observeret nogen metastaser. De tumormålinger beskrevet ovenfor (figur 3) repræsentere hele tumormasse detekteret i hvert dyr.

Disse resultater viser klart det terapeutiske potentiale af NKp30-Ig fusionsprotein til human prostatacancer behandling

in vivo

.

farmakokinetik NKp30-Ig og NKp46D2-Ig

samlet set vores resultater viser, at NKp30-Ig, men ikke NKp46D2-Ig, kan undertrykke tumorvækst

in vivo

. Denne selektive effekt var overraskende, da både NKp30-Ig og NKp46D2-Ig tilsvarende bindes til PC3 /

Luc

, DU145 (figur 1a og b) og menneskelige prostatakræft prøver

in vitro

(figur 1c ). Således må forskellene mellem det terapeutiske potentiale af NKp46D2-lg og NKp30-Ig skyldes andre egenskaber af proteinerne, der påvirker effektiviteten af ​​behandlingen.

En af de vigtigste faktorer i cancerterapi er t

1/2 af det terapeutiske middel. For at mægle en betydelig anti-tumor effekt fusionsproteinerne skal være i stand til at nå serum og forblive stabil i flere timer.

For at estimere den relative stabilitet i fusionen proteiner

in vivo

blev musene givet en enkelt dosis (5 mg /kg legemsvægt) af enten NKp30-lg eller NKp46D2-lg og overvåges så for specifikke proteinniveauer i serummet hvert par timer i 14 dage. Den maksimale niveau af proteiner målt i serum var ens for både NKp46D2-lg og NKp30-Ig (figur 5a og b). Imidlertid blev observeret i kinetikken og stabiliteten af ​​de to fusionsproteiner, klare forskelle; høje niveauer af NKp46D2-Ig, blev identificeret i serummet efter 1 time fra injektion, omend faldt hurtigt i blodet og i løbet af 2 timer næsten 50% af proteinet blev nedbrudt. Endvidere efter 24 timer, kun små spor af NKp46D2-Ig blev fundet (figur 5b). I modsætning hertil påvistes højeste niveauer af NKp30-Ig i serum allerede 30 minutter efter injektion og blev opretholdt i næsten 2 dage faldende først efter 120 timer (figur 1a). Disse observationer demonstrerer den relative stabilitet i NKp30-Ig

in vivo

og kan forklare, i det mindste delvist, den fejlslagne NKp46D2-Ig til at producere en terapeutisk effekt.

Mus blev injiceret intraperitonealt med en dosis (5 mg /kg) af NKp30-lg (a) eller NKp46D2-Ig (b). Serumprøve blev opsamlet (ved 0, 0,5, 1, 2, 6, 25, 48, 120, 168, 264 og 312 timer efter injektion) og niveauer af NKp30-lg eller NKp46D2-Ig blev bestemt i et standard ELISA-assay. Figuren viser den gennemsnitlige mængde fusionsproteiner detekteret i serum fra tre mus, måle på hvert tidspunkt. Fejllinjer repræsenterer gennemsnit ± SD af tre eksemplarer.

NKp30-Ig forbedrer makrofager cytotoksicitet mod tumorceller

in vitro

Der foreslås en række mekanismer for evne tumor antistoffer til at formidle deres virkning

in vivo

. En mulig måde, hvorpå sådanne antistoffer kan inhibere tumorvækst er ved binding til overfladereceptorer, der er involveret i cellecyklusregulering [25]. Vi har derfor først afprøvet, om binding af NKp30-Ig til sine ukendte tumor-ligander kan fremkalde direkte apoptose eller vækst anholdelse af tumorceller i kultur. PC3 /

luc

og DU145 celler blev inkuberet med stigende koncentrationer af NKp30-lg, NKp46D2-Ig eller kontrol Ig-fusionsprotein i 48 timer i nærvær af en tværbinding antistof. Efter behandling blev procentdelen af ​​apoptotiske celler bestemt ved Annexin V og propidiumiodid (PI) farvning. Inkubation af enten PC3 /

luc

eller DU145 celler med de forskellige fusionsproteiner havde ingen effekt på de apoptose satser (figur 6a og b) som den gennemsnitlige spontane apoptose af PC3 /

luc

og DU145 celler (ca. 25% og 8%) forblev ens og blev ikke påvirket af nogen af ​​behandlingerne. Desuden blev ingen cellecyklusstandsningen observeret, som vurderet ved thymidininkorporering assays (data ikke vist). Lignende resultater blev opnået efter inkubation i 24 timer eller 72 timer (data ikke vist).

(a, b) NKp30-Ig ikke inducere apoptose i tumorceller. PC3 /

luc

(a) eller DU145 (b) celler blev inkuberet med stigende koncentrationer af NKp30-lg, NKp46D2-Ig, kontrollerer Ig eller PBS i nærvær af en tværbindende antistof. Efter 48 timer blev procentdelen af ​​apoptotiske celler bestemt ved Annexin V og PI-farvning. Figuren viser en ud af tre udførte forsøg. (C, d) NKp30-Ig kan mediere tumor opsonisering af makrofager. Radioaktivt mærkede PC3 /

Luc

(c) eller DU145 (d) celler blev inkuberet med LPS-aktiverede makrofager ved de angivne E:T nøgletal. Specifik lysis blev bestemt efter 48 timer. Fejl- søjler repræsenterer middelværdi ± standardafvigelse af tredobbelte bestemmelser. Tal repræsenterer en ud af tre udførte forsøg. (E) infiltration af makrofager til tumorvævet. Humane prostatatumorer (DU145) dyrket i nøgne mus blev fikseret i 10% pufret formalin. Paraffinindstøbte snit blev farvet i hæmatoxylin og eosin. Pilene angiver tumor associated- makrofager (X380). Dette tal repræsenterer en ud af fem sektioner testes.

Da tumorcellerne ikke påvise nogen iboende følsomhed over for NKp30-Ig

in vitro

, vi næste testede kapacitet NKp30- ig at inducere effektor-medieret drab af tumorceller. Makrofager har tidligere været impliceret som store aktører i antistof-afhængig tumor kontrol

in vivo

[26], [27]. For at evaluere evnen hos NKp30-Ig kan forbedre makrofager-medieret lyse af tumorceller, blev mus først injiceret (i.p.) med thioglycolat for at bevirke en lokal ikke-patogen inflammation og rekruttere stort antal makrofager i peritoneum hulrum. Fem dage senere blev musene aflivet, og makrofager blev isoleret.