PLoS ONE: Gli1 formidler Lung Cancer Cell Proliferation og Sonic Hedgehog-Dependent Mesenchymale Cell Activation

Abstrakt

Ikke-småcellet-Lunge-Cancer (NSCLC) udgør ca. 85% af alle lungekræfttilfælde og forbliver dårligt forstået. Mens signalveje operative under orgel udvikling, herunder Sonic Hedgehog (Shh) og tilhørende Gli transkriptionsfaktorer (Gli1-3), er for nylig blevet fundet at blive genaktiveret i NSCLC, deres funktionelle rolle er fortsat uklar. Her har vi den hypotese, at Shh /Gli1-3 kunne mediere NSCLC autonom proliferation og epitel /stromal signalering i tumorale væv. I denne sammenhæng har vi undersøgt aktiviteten af ​​Shh /Gli1-3 signalering i NSCLC i både, cancer og stromaceller. Vi rapporterer her, at inhibering af Shh signalering inducerer et signifikant fald i proliferation af NSCLC-celler. Denne effekt er medieret af Gli1 og Gli2, men ikke GLI3, gennem regulering af cyklin D1 og cyclin D2 udtryk. Mens exogent Shh var ikke i stand til at inducere signalering i enten A549 lungeadenocarcinom eller H520 lung squamous carcinomceller, blev begge celler fundet at udskille Shh-ligand, der inducerede fibroblastproliferation, overlevelse, migration, invasion, og collagensyntese. Endvidere Shh udskilles af NSCLC medierer produktionen af ​​proangiogene og metastatiske faktorer i lungefibroblaster. Vores resultater giver således dokumentation for, at Shh spiller en vigtig rolle i formidling epitel /mesenkymale krydstale i NSCLC. Mens selvstændig Gli aktivitet styrer NSCLC proliferation, forøget Shh udtryk ved NSCLC er forbundet med fibroblast aktivering i tumorassocieret stroma. Vores undersøgelse fremhæver relevansen af ​​at studere stromale-associerede celler i forbindelse med NSCLC vedrørende ny prognose og behandlingsmuligheder

Henvisning:. Bermudez O, Hennen E, Koch I, Lindner M, Eickelberg O (2013) Gli1 medierer Lung Cancer Cell Proliferation og Sonic Hedgehog-Dependent Mesenchymale Cell Aktivering. PLoS ONE 8 (5): e63226. doi: 10,1371 /journal.pone.0063226

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Modtaget: 9. oktober, 2012; Accepteret: April 1, 2013; Udgivet: 7. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Bermudez et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Helmholtz Association. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den mest dødelige kræft på verdensplan. I øjeblikket findes der ingen effektive behandlingsmuligheder for lungekræft og 5-års overlevelse er kun 14% for patienter med behandling [1] .Den manglende effektiv langtidsbehandling er relateret til kompleksiteten af ​​lungekræft og dermed med behovet for bedre at forstå biologi lunge carcinogenese. Lidt opmærksomhed har hidtil været rettet mod tumoren-omsluttende mikromiljø, som udgør det tumor-associerede stroma og fungerer som aktiv deltager i tumorigenese. I de seneste år har flere og flere beviser påpeget vigtigheden af ​​stroma i tumor initiering, progression og metabolisme af mange typer af kræft [2] – [7]. Ligeledes signalering i stromacellerne er blevet vist at være essentielle for den maligne transformation af epitelceller [2], [5], [6].

Pathways involveret i organogenese og lungeforgrening morfogenese, herunder Hedgehog ( Hh) signalering, er for nylig blevet identificeret som centrale aktører i human cancer [8]. Tre Hedgehog (Hh) gener eksisterer i pattedyr, med Sonic Hedgehog (Shh) som den mest bredt udtrykt gen. Secerneret Shh binder til receptorerne Patched (ptch) til stede i den cytoplasmatiske membran af den modtagende celle. Binding af Shh til ptch frigiver undertrykkelse, ptch udøver på Smoothened, en syv-transmembran-span receptor-lignende protein afgørende for transduktionen af ​​hedgehog signalering. Smoothened letter interaktionen af ​​forskellige Hedgehog nedstrømseffektorer i den primære cilier, hvilket resulterer i aktiveringen af ​​transkriptionsfaktorer Gli [9]. Hos mennesker, de tre Gli zink-finger proteiner (Gli1, Gli2 og GLI3) orkestrere Hedgehog-specifik reaktion i cellen ved at modulere genekspression. Gener af pindsvineoverføringsvejen selv herunder Gli1 og Ptch1 er mål for Gli, der repræsenterer et feedback loop, der tjener som udlæsning af Hedgehog aktivitet [10]. Aktivering af human kanoniske Hh pathway afhænger ekspressionen af ​​ptch receptorer (Ptch1, Ptch2) og afledningsindretningen receptor Hhip (Hedgehog-interagerende protein) [11]. Intracellulære proteiner, der regulerer Gli stabilitet, ligesom SUFU (Suppressor af smeltet) og SPOP (pletter typen POZ protein) spiller også en vigtig rolle i fastlæggelsen Gli aktivitet og dermed aktivering af kanoniske Hedgehog vej [12]. I de seneste år har undersøgelser vist, eksistensen af ​​en ikke-kanonisk Hedgehog vej, der ikke kræver den komplette Shh-ptch-SMO-Gli aksen. En ikke-kanoniske hedgehog signalering afhængig SMO men uafhængig af Gli, der regulerer tubulogenesis og apoptose, er blevet beskrevet i endotelceller [13] .Med tid, Gli transkriptionsfaktorer vises som en integrativ platform af talrige signaling input, indførelse af anden art af ikke-kanoniske Hedgehog signalering, afhængig af Gli men uafhængig af SMO. Dette er tilfældet for pancreas duktalt adenokarcinom, hvor Gli transkription reguleres af TGF-ß og K-ras [14].

pindsvinesignaleringsvejen spiller en kritisk rolle under hvirveldyr udvikling kontrollerende cellevækst, overlevelse, skæbne og mønsteret af kroppen planen. Ændringer i Shh pathway under lunge udvikling påvirker epitel /mesenkymale interaktioner og resultere i forgrening morfogenese defekter, forringer lungefunktionen. Mens Shh signalering er afgørende for lunge udvikling, den rolle, som denne signalvejen kan spille i voksne lunger forblev uklart og er netop nu ved at blive undersøgt. Nylige undersøgelser har understreget betydningen af ​​Hedgehog signalering i idiopatisk lungefibrose, en dødelig sygdom af ukendt ætiologi. Bolaños et al har rapporteret, at forskellige elementer pindsvineoverføringsvejen overudtrykkes i IPF lunger og IPF fibroblaster. Desuden blev fibroblaster fra IPF lunger fundet at reagere på Shh og dette svar korreleret med fibroblast aktivering

i

vitro

[15]. En uafhængig undersøgelse foretaget af Cigna et al [16] viste, at primære humane fibroblaster fra normale og IPF lunge udtrykke de vigtigste komponenter i Hedgehog signalvej, der er forbundet med celleproliferation og ekspression af myofibroblastisk markører i fibroblaster. Disse undersøgelser bringe betydningen af ​​hedgehog signalering i lungefibrose, forbliver uklart, hvilken rolle denne vej i forskellige former for lungekræft. Lungekræft er klassificeret efter histologisk seværdighed: de to mest udbredte former for lungekræft er ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og småcellet-carcinom (SCLC). NSCLC og SCLC ikke kun udviser forskelle i størrelse og udseende af kræftceller, men også forskellig prognose og kliniske behandling. På grund af heterogenitet af hver lungekræft undertype, er yderligere histologiske og molekylære karakterisering er nødvendig for at vælge en mere specifik behandling. Traditionelt blev NSCLC screenet og behandlet for EGFR og K-

ras

mutationer. Imidlertid har fremkomsten af ​​resistens over for disse behandlinger, og beskrivelsen af ​​nye molekylære signaturer understreget behovet for en bedre tumor molekylær-profil-rettet terapi. Nogle undersøgelser har beskrevet sammenhængen mellem nye mønstre for genekspression i specifikke delmængder af NSCLC [17], [18], og andre foreslår anvendelse af ny tumor molekylær profilering i fremtidige behandlinger. Eksempelvis er foreslået evaluering af MMP2 og b-catenin ekspression at have et potentiale i diagnosticeret NSCLC med forskellige clinicopathologic egenskaber [19]. I SCLC, en tumor med primitive neuroendokrine funktioner, blev Shh vist sig at blive aktiveret i neuroendokrine progenitorceller og i tumorceller i mus [20], [21]. Mens disse undersøgelser understøtter en juxtacrine /autokrin aktivering af Hh i SCLC, er det ikke klart, hvordan denne vej er aktiveret i NSCLC, den mest udbredte undertype af lungekræft. I betragtning af de kliniske og biologiske forskelle mellem NSCLC og SCLC, vi hypotese, at mekanismen for aktivering af Shh i NSCLC er forskellig fra SCLC. Vi havde til formål at undersøge aktiviteten af ​​Shh signalering i NSCLC i både cancerceller og stromaceller. For at vurdere betydningen af ​​Shh signalering i NSCLC celler, har vi udført knockdown af de tre Gli transkriptionsfaktorer (Gli1-3), der medierer intracellulær Shh signalering, og studerede virkningen heraf på NSCLC spredning. Desuden har vi vurderet, hvordan NSCLC celler og lungefibroblaster reagerede på eksogen Shh i form af spredning, celle migration, invasion, og ekstracellulære matrix remodeling.

Resultater

Cyclopamin, en Hedgehog Inhibitor, Reducerer NSCLC spredning og levedygtighed

En af de mest ugunstige karakteristika af kræft er deregulering i celleproliferation. Vi har derfor undersøgt den rolle, som Shh kan have i NSCLC proliferation, anvendelse af celler fra adenocarcinom og celler fra pladecarcinom, den første og anden hyppigste form for lungekræft henholdsvis. Oprindeligt anvendte vi Cyclopamin, en planteafledt steroidt alkaloid, der inhiberer Smoothened (SMO), en G-protein-koblede receptorer, der transducerer Shh signal i cellen, for at blokere Shh pathway i NSCLC-celler. Ved behandling med cyclopamin, A549 adenokarcinomceller og H520 pladecelle lungecarcinom viste et signifikant fald i celleantal især ved længere tidspunkter (figur 1A og B). Cyclopamin også reduceret celleoverlevelse (metabolisk aktivitet vurderet ved MTT-assay) (figur 1A og B), og denne virkning var vigtigere med stigende doser af inhibitoren (Figur S1A og fig S3E). For at udelukke, at cyclopamin ikke fremprovokere en cytotoksisk ikke-specifik effekt på NSCLC celler, blev apoptose bestemt ved cyclopaminbehandling. Selvom cyclopamin inducerede en svag stigning i omfanget af apoptotiske celler, andelen af ​​apoptotiske celler var ikke statistisk forskellige mellem behandlede-celler og ikke-behandlede celler (fig S1B og Figur S3F). For at bekræfte den specifikke virkning af cyclopamin på NSCLC proliferation og levedygtighed, blev SMO silencing udført. SMO knockdown inducerede et fald i både A549 og H520 celleproliferation og levedygtighed (data ikke vist). Alt i alt viser disse resultater, at blokering af pindsvineoverføringsvejen gennem SMO inhibering, reducerer NSCLC proliferation og levedygtighed.

lungeadenokarcinom A549-celler (A) og lunge pladecarcinom H520 celler (B) blev dyrket i nærvær eller fravær af 10 pM cyclopamin i 5 dage. Proliferation blev vurderet ved celletælling og celleoverlevelse ved MTT-assayet. * P 0,1; ** P 0,05. (C) The Hedgehog-reagerende transkription faktorer Gli1, Gli2 eller GLI3 blev slået ned med siRNA i A549 celler. RT-qPCR blev udført for at bekræfte den specifikke silencing af hver Gli og vurdere ekspressionen af ​​Hedgehog receptor Ptch1. Resultaterne præsenteres som fold forskelle i mRNA-niveauer (2

∧∧Ct) sammenlignet med celler transficeret med en negativ kontrol siRNA (NC siRNA), der har ingen homologi i hvirveldyr transkriptom. ** P 0,05, *** p 0,01. Virkningen af ​​silencing Gli1, Gli2 eller GLI3 i A549-celleproliferation blev bedømt ved celletælling (D) og i celleoverlevelse ved MTT-assay (E). Resultaterne er angivet i procent som relativ proliferation og relativ overlevelse sammenlignet med celler transficeret med den negative kontrol siRNA (NC). * P 0,1. (F) Repræsentant fase-kontrast mikroskopiske billeder efter 72 timer siRNA præsenteres. (G) RT-qPCR blev udført for at vurdere virkningen af ​​siRNA af Gli1, Gli2 og GLI3 i ekspressionen af ​​G1 /S-fase cycliner D (Cyc D1, Cyc D2, Cyc D3) og cyclin E (Cyc E1). Resultaterne præsenteres som fold af mRNA-niveauer (2

∧∧Ct) sammenlignet med celler transficeret med en negativ kontrol siRNA (NC siRNA), der har ingen homologi i hvirveldyr transkriptom. * P 0,1; ** P 0,05. (H) Western blot af cyclin D2 i A549-celler transficeret med Gli siRNA eller med en negativ kontrol siRNA (NC). Blotting af ß-actin blev anvendt som indlæsning kontrol.

Silencing af Gli1 Fald NSCLC Proliferation ved modulering Cyclin D Expression

Selvom Cyclopamin har vist sig at påvirke celleproliferation i andre typer af kræftceller, den specifikke mekanisme, hvorved Shh signalering regulerer NSCLC celle kræft spredning fortsat undvigende. For eksempel er det ikke kendt, hvor hver af de tre humane Shh-transskription faktorer Gli bidrager til NSCLC spredning. For at afhjælpe dette spørgsmål, vi brugte små interferens RNA (siRNA) til tavshed Gli1, Gli2 og GLI3. Efter en konkret og vigtig reduktion af mRNA niveauerne af Gli1, som ikke påvirker hverken Gli2 eller GLI3 mRNA-niveauer (figur 1C), blev celledeling og cellelevedygtigheden faldt i A549 adenocarcinomceller (Figur 1D-F). Af meddelelsen, undertrykkelse af Gli1 fremkaldte en reduktion i Ptch1 mRNA-niveauer (figur 1C). Fordi transkriptionen af ​​Ptch1 afhænger Gli1, reduktion af Ptch1 mRNA-niveauer tjener som yderligere kontrol indikerer, at nedregulering af Gli1 var biologisk effektiv. Den specifikke silencing af Gli2, der reducerede Gli2 mRNA-niveauer og ikke falde enten Gli1 eller GLI3 mRNA-niveauer (figur 1C), aftog en anelse A549 celleantal og cellelevedygtigheden, men ikke i en statistisk signifikant måde (figur 1 D og E). Endelig siRNA af GLI3 der fremkaldte en vigtig formindskelse i GLI3 mRNA-niveauer, men ikke et fald i Gli1 eller Gli2 mRNA-niveauer (figur 1C), reducerede ikke A549 adenocarcinom celleproliferation eller cellelevedygtighed (figur 1 D og E) og i stedet forårsagede en svag stigning i celleantal af A549 adenocarcinomceller (figur 1 D) samt en stigning i Gli1 mRNA-niveauer (figur 1C). I H520 squamous lungecarcinomceller (fig S3) og i store celle carcinomceller (data ikke vist), den specifikke nedregulering af Gli1, Gli2 eller GLI3 havde en lignende effekt i celleproliferation og cyclin ekspression. Vigtigt er det, at ekspression af Shh-relaterede gener og cycliner upon Gli1, Gli2 og GLI3 lyddæmpning skyldtes ikke Hprt1 ekspression fordi et lignende ekspressionsmønster blev fundet, når 3 uafhængige reference- gener blev anvendt i A549 (figur S2) og i H520 celler ( Figur S4).

for at undersøge, hvordan undertrykkelse af Shh pathway påvirkninger lunge adenocarcinom spredning, har vi vurderet ændringer i ekspressionen af ​​cyclinerne D og E involverede i G1 /S cellecyklus overgang efter Gli nedregulering. Af interesse, siRNA af Gli1 og Gli2 provokerede et betydeligt fald i cyclin D2 og en mindre reduktion i cyclin D1 mRNA-niveauer (figur 1G). Faldet i cyclin D2 ekspression upon Gli1 og Gli2 knockdown blev observeret ved den mRNA, men også på proteinniveauet (figur 1H). I betragtning af at Gli2 kunne påvirke cyclin D-ekspression, vi den hypotese, at i kombination med Gli1 kunne denne transskriptionsfaktor regulerer celleproliferation på en signifikant måde. For at bekræfte denne hypotese har vi indset det dobbelte lyddæmpning af Gli transkriptionsfaktorer. Mens den enkelte lyddæmpning af Gli2 ikke signifikant nedsætte cellernes levedygtighed, den dobbelte lyddæmpning af Gli1 og Gli2 gjorde (figur S1c). I H520 lung squamous carcinomceller, blev den specifikke knockdown af Gli1 og Gli2 af siRNA fundet at falde på en tilsvarende måde cyclin D1 og cyclin D2 ekspression (fig S3A). Tilsammen indikerer disse resultater, at blokaden af ​​Shh signalvejen, enten med cyclopamin eller forstyrre transskription faktor Gli1 nedsætter NSCLC spredning.

NSCLC Celler aktiverer ikke Shh Pathway Upon exogent Shh Behandling

Eftersom blokaden af ​​Shh pathway nedsætter NSCLC proliferation, undersøgte vi, om exogen Shh frembringer en stigning i celleproliferation i disse celler. Lung adenocarcinom A549-celler og H520 skællede carcinomceller behandlet med rekombinant humant Shh viste ikke en ændring enten i celleantal (figur 2A og D) eller i celleoverlevelse (fig 2B og E). Desuden har cellerne ikke udgør nogen morfologisk ændring efter behandling (fig 2C og F). Disse resultater antydede, at NSCLC celler ikke reagerer på Shh. For at validere Shh behandling, vi brugte primære embryo museceller fra lemmer knopper, væv, der har vist sig at være lydhør over for Shh. Efter Shh behandling, disse celler udviste en betydelig stigning i Gli1 og Ptch1 mRNA-niveauer (60 gange og 9-fold stigning sammenlignet med ikke-behandlede celler, figur S5). Når A549-celler blev behandlet med Shh, en meget beskeden stigning (1,65 gange) i Gli1 mRNA niveauer efter 8 timer og Gli1 proteinniveauer ved 24 timer blev detekteret. Men på længere tidspunkter var der var ingen signifikante ændringer i enten Gli1 eller Ptch1 udtryk (figur 3A og B). For H520 celler, en væsentlig ændring i enten Gli1 eller Ptch1 på mRNA og protein niveau blev observeret (figur 3C og D). Disse resultater viser, at

in vitro

, begge typer af NSCLC celler, sammenlignet med kendte Shh-responsive celler, ikke især reagerer på eksogen Shh.

lungeadenokarcinom A549 celler (A-C ) og lung squamous H520 carcinomceller (D-F) blev behandlet eller ikke med rekombinant Shh (500 ng /ml). Celleproliferation blev vurderet ved celletælling (A, D) og celleoverlevelse ved MTT-assay (B, E) på de angivne tidspunkter. Repræsentant fase-kontrast mikroskopiske billeder af A549 celler (C) og H520 celler (F) er vist.

NSCLC celler blev behandlet eller ikke med rekombinant Shh (500 ng /ml) på de angivne tidspunkter . RT-qPCR blev udført for at vurdere Gli1 og Ptch1 mRNA-niveauer efter behandling i A549-celler (A) og H520-celler (C). Resultaterne præsenteres som fold forskelle i mRNA-niveauer (2

∧∧Ct) sammenlignet med ikke-behandlede celler for hvert tidspunkt. Western blot blev udført for at vurdere Gli1 og Ptch1 proteinniveauer i A549-celler (B) og i H520-celler (d) behandlet eller ej med Shh. ß-actin blev anvendt som en loading kontrol. Sekretion af human Shh blev evalueret i supernatanterne af A549 og H520 celler ved ELISA (E) og bekræftet ved western blot med et antistof, der genkender den secernerede aktive form af Shh (indsat E). Western blot blev udført med H520 supernatant (H520 sup.) Og med rekombinant Shh (Rec. Shh) anvendt som en positiv kontrol. (F) knockdown af Shh-gen ved siRNA blev realiseret i H520 celler. Shh sekretion blev bedømt ved ELISA og udtrykt i procent som relativ sekretion sammenlignet med celler transficeret med en negativ kontrol siRNA (NC) har ingen homologi i hvirveldyr transkriptom. ** P 0,05 (G) Efter silencing af Shh blev NSCLC-celler behandlet eller ikke med rekombinant Shh (500 ng /ml). RT-qPCR blev udført for at vurdere Gli og Ptch1 mRNA-niveauer. Resultaterne er præsenteret som fold af mRNA forskelle (2

∧∧Ct) i behandlede celler sammenlignet med ikke-behandlede celler.

NSCLC celler udskiller Shh ligand

Ved hjælp af en specifik ELISA-test for human Shh, fandt vi, at A549 adenokarcinomceller og stærkere H520 pladecarcinom producere Shh (170 og 2800 henholdsvis pg /ml, figur 3E). Denne sekretion kan være forbundet med endogent Shh produktion af disse NSCLC celler, fordi koncentrationen af ​​Shh i mediet af hver celletype var meget lav, kan sammenlignes med baggrunden (vand).

For at bekræfte disse resultater og at undersøge, om disse NSCLC celler også producere de andre former for Hedgehog ligand, har vi vurderet udtryk for Sonic, Desert (Dhh) og indiske Hedgehog (Ihh) i A549 og H520 celler. Selvom vi ikke kunne opdage ved RT-qPCR Dhh og Ihh, fandt vi, at Sonic Hedgehog blev udtrykt i A549 og H520 celler, bliver mere udtrykt i disse sidste (data ikke vist). Baseret på disse resultater, har vi derfor koncentreret om Shh hele vores studie. Hertil kommer, fordi H520 celler producere og udskille betydelige mængder Shh ligand, besluttede vi at fokusere på disse NSCLC celler til yderligere undersøgelser relateret med Shh sekretion. For nøjere tilstedeværelsen af ​​den aktive form af Shh i H520 supernatanten blev western blot udført med et antistof, der genkender den forarbejdede aktive form af Shh (N-Shh). Tilstedeværelsen af ​​den N-terminale secerneret peptid Shh i supernatanten af ​​H520-celler blev derved bekræftet (indsat figur 3E).

Fordi H520 celler udskiller en betydelig mængde Shh, men ikke reagerer på eksogen Shh, vi lige at undersøge, om denne mangel på respons var forbundet med mætning af endogen Hedgehog-aktivitet i disse celler. Til dette har vi udført undertrykkelse af Shh-gen i H520 celler. Ved knockdown af Shh, der reduceres med 70% sekretionen af ​​Shh i H520 celler (figur 3F), exogent Shh steg Gli1 mRNA-niveauer i disse celler (Figur 3G). Denne stigning, samt en mindre stigning i Ptch1 mRNA-niveauer (figur 3G) viser, at H520-celler kan reagere på Shh, når deres endogene niveauer af Shh nedsættes.

lungefibroblaster reagerer stærkt på eksogen Shh

Siden NSCLC celler kan udskille Shh ligand, men de ikke reagerer stærkt på eksogen Shh, undersøgte vi, om Shh snarere kunne aktivere de hosliggende stromaceller. Faktisk lungefibroblaster behandlet med muse Shh udviste en stærk pindsvineoverføringsvejen aktivering efter behandling: Gli1 mRNA niveauer øges op til 800 gange og Ptch1 mRNA niveauer havde en fold stigning op til 250, især 48 og 72 timer (figur 4A). Lignende resultater opnåedes med humant Shh (figur 4A). Shh behandling steg også Gli1 og Ptch1 på proteinniveauet (figur 4B). For at vide, om lunge humane fibroblaster fra NSCLC miljø også kunne reagere på eksogen Shh blev primære humane lungefibroblaster isoleret fra en resekteret lunge pladecarcinom. Interessant nok blev Gli1 og Ptch1 mRNA-niveauer også forøget ved Shh behandling i disse celler (figur 4C). Disse resultater indikerer, at,

in vitro

, lungefibroblaster er meget Shh-responsive celler, i modsætning til NSCLC epitelceller.

Mus lungefibroblaster CCL206 blev behandlet eller ej med 500 ng /ml rekombinant muse Shh eller 500 ng /ml humant Shh i 24, 48 og 72 timer. (A) mRNA-niveauer af Gli1, Gli2, GLI3 og Ptch1 upon behandling blev vurderet ved RT-qPCR. Resultaterne præsenteres som fold forskelle i mRNA-niveauer (2

∧∧Ct) af behandlede celler sammenlignet med ikke-behandlede celler for hvert tidspunkt. * P 0,1; *** P 0,01. (B) Western blot blev udført for at vurdere ændringer i Gli1 og Ptch1 proteinniveauer i CCL206 fibroblaster behandlet eller ikke med muse Shh (500 ng /ml). ß-actin blev anvendt som en loading kontrol. (C) Primære humane fibroblaster blev behandlet eller ikke med rekombinant humant Shh (500 ng /ml) i 24, 48 og 72 timer. RT-qPCR blev udført for at vurdere mRNA niveauerne af Gli1, Gli2, GLI3 og Ptch1. Resultaterne præsenteres som fold af mRNA forskelle (2

∧∧Ct) i behandlede celler sammenlignet med ikke-behandlede celler for hvert tidspunkt. * P 0,1; ** P 0,05; *** P. 0,01

For at undersøge, om den manglende respons på eksogen Shh i NSCLC celler skyldtes en forkert modtagelse af Shh ligand i disse celler, har vi vurderet udtryk for receptorerne Ptch1, Ptch2 og Hhip, der betragtes som en lokkedue receptor, i A549, H520 celler og CLL206 fibroblaster. Ptch1 ekspression viste sig at være højere end Hhip i begge NSCLC celletyper (figur S6). Desuden den relative ekspression af Ptch1 var højere i A549 og i H520 celler end i CCL206 fibroblaster, mens den relative ekspression af attrap-receptor Hhip var vigtigere i lungefibroblaster end i NSCLC-celler (Figur S6). Således ikke balance mellem ptch og Hhip ekspression ikke at være relateret (på mRNA-niveau) med den ikke-reaktionsevne NSCLC på eksogen Shh. Som intracellulære proteiner, såsom Sufu og Spop regulere på en positiv og en negativ form, Gli stabilitet henholdsvis har vi derefter evalueres, hvis en ubalance mellem disse Gli regulatorer kunne forklare den ikke-responsive af NSCLC på eksogen Shh. Vi kunne ikke finde forskelle i den relative ekspression af Sufu sammenlignet med ekspression af Spop for en samme celletype (figur S6). Endelig har vi vurderet, hvis den relative ekspression af Hh-receptorer og Gli regulatorer var forskellig mellem NSCLC og lungefibroblaster upon Shh behandling. Der blev ikke fundet i ekspressionen af ​​Ptch1, Ptch2, Hhip, Sufu og Spop på Shh behandling, med kort (1, 3, 8 timer) eller længere tidspunkter (24, 48 h) (data ikke vist).

lungefibroblaster Reager på Shh udskilles af NSCLC H520 celler

for at teste, om Shh udskilles af H520 planocellulære celler var bioaktive blev lungefibroblaster behandlet med H520 supernatant. Dette resulterede i stigningen i Gli1 og Ptch1 mRNA-niveauer i muse nyfødte (figur 5A) og i voksne humane lungefibroblaster (figur 5B). For at vurdere, om denne respons blev medieret af Shh secerneret af H520-celler og er til stede i supernatanten, blev siRNA af Shh udført i H520 celler. Dette vigtigere faldt Shh mRNA beløb og tilstedeværelsen af ​​N-Shh i supernatanten (figur 5C) og endvidere nedsat med 90% af niveauerne af Gli1 og med 50% af niveauerne af Ptch1 i fibroblasterne behandlet med H520 supernatant (figur 5D) .

. Lungefibroblaster blev serum-udsultet i 24 timer og derefter behandlet med eller uden supernatanten af ​​H520-celler i 24, 48 eller 72 timer. (A) RT-qPCR blev udført for at analysere Gli1, Gli2, GLI3 og Ptch1 mRNA-niveauer i CCL206 behandlet med H520 supernatant. Resultaterne præsenteres som fold af RNA-niveauer i behandlede celler sammenlignet med ikke-behandlede celler for hvert tidspunkt. ** P 0,05; *** P 0,01. (B) Primære humane fibroblaster fra lunge pladecarcinom var serum-udsultet i 24 timer og behandlet eller ej med H520 supernatant i de angivne tidsrum. RT-qPCR blev udført for at vurdere Gli1, Gli2, GLI3 og Ptch1 mRNA-niveauer. Resultaterne præsenteres som fold mRNA-niveauer i behandlede celler sammenlignet med ikke-behandlede celler for hvert tidspunkt. * P 0,1, ** p 0,05. (C) The knockdown af Shh blev udført i H520 celler med siRNA. Effektiviteten af ​​Shh knockdown i H520-celler blev bekræftet ved Western blot realiseres med supernatanten af ​​H520-celler transficeret med negativ kontrol siRNA (NC) eller med den siRNA af Shh. (D) CCL206 fibroblaster blev behandlet i 24, 48 og 72 timer med supernatanten af ​​enten H520-celler transficeret med en negativ kontrol siRNA eller med supernatanten af ​​H520-celler transficeret med siRNA af Shh. RT-qPCR blev udført for at evaluere ændringer i Gli1, Gli2, GLI3 og Ptch1 mRNA-niveauer. Resultaterne præsenteres som fold af mRNA-niveauer (2

∧∧Ct) i CCL206 celler behandlet med supernatanten af ​​H520 transficeret med siRNA af Shh i forhold til fibroblaster behandlet med supernatanten af ​​H520 transficeret med den negative kontrol siRNA. * P 0,1; ** P 0,05; *** P. 0,01

Shh Pathway Forbedrer Lung fibroblast spredning, Invasion og Collagen Deposition

Vi har her vist, at NSCLC celler ikke markant reagerer på eksogen Shh men kan udskille bioaktive Shh der inducerer aktiveringen af ​​hedgehog signalering i lungefibroblaster. Disse resultater viser, at Shh spiller en vigtig rolle i formidling af kræft epitel-stromale krydstale i NSCLC. I denne indstilling, har vi undersøgt de mulige biologiske virkninger af Shh-aktivering i lungefibroblaster. Vi har fokuseret på forskellige aspekter af relevans i en cancer kontekst såsom spredning, migration, invasion og ekstracellulære matrix remodeling. Mens rekombinant Shh forøget celleoverlevelse og celleproliferation af lungefibroblaster (figur 6A-C), cyclopamin faldt det (fig 6D-F). Denne virkning synes at være på grund af specifik inhibering af pindsvineoverføringsvejen som cyclopaminbehandling korreleret med et fald i Gli1 og Ptch1 ekspression i CCL206 fibroblaster (figur S7A). Interessant, H520 supernatant også forbedret lunge fibroblast-celleproliferation (figur S7B-D). Som fibroblaster har vist sig at være vigtigt for at lette cancer migration og invasion, gik vi på at undersøge virkningen af ​​Shh i disse processer. Fibroblaster blev behandlet med enten Shh eller med cyclopamin, og migrationen blev registreret op til 72 timer efter behandlingen. Ud fra følgende betragtninger Shh øgede afstand af migration af fibroblaster, cyclopamin faldt betydeligt det (figur 7A). For at udforske, om Shh kunne påvirke fibroblast migration efter en skade stimulus, der bedre kan repræsentere de ændringer, der finder sted i tumorale væv, vi udførte sårheling analyser. I ikke-behandlede celler, fibroblast migreret ind i sårområdet på en progressiv måde, hvilket resulterer i sårlukning efter 30 timer. I Shh-behandlede celler, denne proces var hurtigere og førte til sårlukning efter 26 timer (figur 7B og C). Tværtimod cyclopamin faldt fibroblast migrering mod sårområdet og resulterede ikke i sårlukning (figurerne 7B og C). Vi derefter forsøgt at undersøge om Shh kunne påvirke fibroblast invasion. Til dette brugte vi transbrøndene overtrukket med kollagen, der efterligner bedre den ekstracellulære matrix og dermed vævet sammenhæng. Celler blev fyldt på toppen af ​​transwell og medium med Shh eller cyclopamin blev anbragt i bunden, hvorved der kan dannes en gradient. Antallet af celler transmigrating forøget i nærvær af Shh mens cyclopamin faldt fibroblastinvasion gennem collagen coatede membran (figur 7D). Mens Shh signalering regulerer lungefibroblast migration og invasion, blev nogen effekt fundet til enten Shh eller cyclopamin i fibroblast adhæsionsassays (data ikke vist). Fordi desorganisering og ændringer i arkitekturen i tumormikromiljøet er kritiske kendetegnende for cancer, har vi undersøgt, om aktivering af Shh pathway i lungefibroblaster kan være forbundet med ekstracellulær matrix remodellering. Exogent Shh øgede ekspression af matricen metallopeptidase MMP9 (figur 7E), et proteolytisk enzym, der spiller en central rolle i udviklingen af ​​kræft. Interessant Shh behandling også øget syntese af collagen i den ekstracellulære matrix dannet af fibroblast (fig 7F). Tilsammen indikerer disse resultater, at Shh fremkalder en reaktion i lunge fibroblast, der kan korreleres med migration, invasion og ekstracellulær matrix remodellering.

Proliferation af CCL206 lungefibroblaster blev vurderet ved celletælling (A, D) og celleoverlevelse