PLoS ONE: Immunologisk karakterisering af Whole Tumor Lysat-Loaded dendritiske celler for Cancer Immunotherapy

Abstrakt

Introduktion

Dendritiske celler spiller en central rolle som initiativtagere til T-celle responser, og selv om tumor antigen-loaded dendritiske celler kan fremkalde anti-tumor responser, er deres effektivitet sat spørgsmålstegn, hvilket tyder på et behov for at forbedre immuniseringsstrategier

Matherials Fremgangsmåder

Vi fokuserede på karakteriseringen af ​​knoglemarvafledte dendritiske celler pulset med hele tumor lysat (TAA-DC), som en kilde til kendte og ukendte antigener, i en musemodel af brystcancer (MMTV-

Ras

). Dendritiske celler blev bedømt for antigenoptagelse og til ekspression af MHC-klasse I /II og costimulerende molekyler og markører associeret med modning.

Resultater Salg

Resultaterne viste, at antigen-loaded dendritiske celler er karakteriseret ved en fænotypisk semi-moden /modne profil og ved opregulering af gener involveret i antigenpræsentation og T-celle priming. Aktiverede dendritiske celler stimulerede T-celleproliferation og induceret produktion af høje koncentrationer af IL-12p70 og IFN-γ men kun lave niveauer af IL-10, hvilket indikerer deres evne til at fremkalde en T

H1-immunrespons. Desuden administration af antigen indlæst-dendritiske celler i MMTV-

Ras

mus fremkaldte en stærk anti-tumor-respons

in vivo

som det fremgår af en generel aktivering af immunkompetente celler og frigivelse af T

H1 cytokiner.

Konklusion

data heri kan være nyttig i udformningen af ​​antitumorale DC-baserede terapier, der viser en specifik aktivering af immunsystemet mod brystkræft.

citation: Rainone V, Martelli C, Ottobrini L, Biasin M, Borelli M, Lucignani G, et al. (2016) Immunologisk karakterisering af Whole Tumor Lysat-Loaded dendritiske celler for Cancer Immunterapi. PLoS ONE 11 (1): e0146622. doi: 10,1371 /journal.pone.0146622

Redaktør: Natalia Lapteva, Baylor College of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: September 24, 2015; Accepteret: 18. december 2015; Udgivet: 21 januar 2016

Copyright: © 2016 Rainone et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af PRIN 2008 (. Progetti di Rilevante Interesse Nazionale, Sundhedsministeriet, projekt nr 20082NHWH9_001) modtaget af MC og AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro; finansieret projekt nr IG-9311) modtaget af MC. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser : DC, dendritiske celler; IDC, umodne dendritiske celler; TAA, tumor-associeret antigen; MMTV, murin brysttumorvirus; Ras, human-rotte sarcom; GM-CSF, granulocyt-makrofag-kolonistimulerende faktor; HSP, varmechokproteiner; MRI, magnetisk resonans imaging; SPECT, single photon emission computertomografi; BFA, brefeldin A; PMA, phorbolmyristatacetat; MFI, gennemsnitlig fluorescensintensitet; ICAM-1, intercellulært adhæsionsmolekyle 1; Rac1, Ras-relateret C3 botulinumtoksin substratet 1; ERAP1, endoplasmatisk reticulum aminopeptidase 1; TAP2, Antigen peptidtransportøren 2; TAPBP, TAP-associeret glycoprotein eller tapasin; LRP1 lav densitet receptor-relateret protein 1; CFS1R, kolonistimulerende faktor 1-receptor; CFS2R, kolonistimulerende faktor 2 receptor; TR1, type 1 regulatoriske T-celler; PD1, programmeret celledød protein 1 receptor; PDL1, programmeret død-ligand 1; T

reg, T regulatoriske celler

Introduktion

Kræft immunterapi sigter mod optimal fremkaldelse af tumor-specifikke immunreaktioner med det endelige mål at ødelægge tumorceller og inducerer langvarig immunitet, der vil forebygge sygdom tilbagefald [1]. Induktion af en effektiv tumor immunitet er en kompleks proces, der indbefatter hensigtsmæssig præsentation af tumorassocierede antigener (TAA), udvælgelse og aktivering af TAA-specifikke T-celler og endelig homing af TAA-specifikke T-celler til tumorstedet og fjernelse af maligne celler, der udtrykker TAA [2,3,4]. Flygte fra immun overvågning er dog en grundlæggende biologisk funktion af maligniteter, som bidrager til ukontrolleret tumorvækst, i sidste ende fører til død af værten.

Tumor-antigener, i modsætning til antigener, der er forbundet med bakterier og andre patogener, er selv-antigener, og immunsystemet er ofte tolerant over dem. Af disse grunde har megen opmærksomhed været rettet mod udviklingen af ​​immuniseringsstrategier for at maksimere det immunstimulerende kapacitet af dendritiske celler (DC’er). DC’er er en familie af professionelle antigen-præsenterende celler spiller en central rolle i moduleringen af ​​T-celle responser; disse celler er ekstremt vigtigt i beskyttelse mod patogener og tumor immunologi. Denne erkendelse har øget grundlæggende translationel forskning for at forstå og udnytte deres unikke immunmodulerende kapacitet mod kræft [2].

DC-vacciner viste sig at være sikker, gennemførlig og effektiv i nogle patienter, især hvis udviklingslandene passende blev modnet og aktiveret [5,6]. Ikke desto mindre, selv om der observeres immunologiske responser i de fleste tilfælde, kliniske respons kun fundet i et mindretal af patienterne [7]. Flere af de tidlige undersøgelser offentliggjort var utilstrækkelige i deres design og fortolkning, som umodne snarere end modne DC’er blev brugt [8]. Muligheder for at forbedre effektiviteten af ​​DC’er i immunterapi af tumorer skal overveje en række forskellige variabler. Således har de seneste rapporter vist, at sammenlignet med umodne DC’er, modne DC’er har en højere potens til at inducere specifikke immunreaktioner og at migrere både

in vitro

in vivo

[9]. Andre kendetegn ved disse celler, der skal overvejes, er deres forskellige delmængder, at modalitet af antigen belastning, ruten for administration, og dosis og frekvens af DC’er forvaltninger. Endelig immuniserende evne DCs

in vivo

er kritisk påvirket af deres modning tilstand og deres evne til at migrere mod lymfatisk væv.

Et stort antal DC’er kan genereres af

in vitro

kultur af monocytter eller CD34

+ progenitorer med granulocyt makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) plus interleukin-4 (IL-4) [10] eller IL-13. DC’er opnået på denne måde kan primes med tumorantigener for at optimere deres evne til at frembringe tumor-specifik T-celle-responser. Således kan celler indlæses enten med hele tumorceller eller tumor cellelysat, tumor antigen-berigede fraktioner, eller alternativt med tumorspecifikke antigener. Approaches udnytte hele tumorceller som en kilde af antigen til DC’er kan være særligt nyttige: på denne måde hele repertoiret af antigener associeret med en given tumor kan behandles. Dette kunne forhindre tumor immune escape via antigen-loss varianter eller mutationer i kritiske T-celleepitoper [11,12]. Tumor cellelysat repræsenterer hele proteinindholdet i lyserede tumorceller. Fordelen ved at anvende tumor lysat ligger i det faktum, at de mange antigener, der kan sensibilisere T-celler kan være uensartet udtrykt på voksende tumorer (især dem, der ikke har molekylært definerede TAA). Derudover kan det cellulære stress induceret af lytiske processer fremkalder adaptive mekanismer, herunder afgivelse af varmechokproteiner (HSP’er), som er frigjort fra døde celler efter primær eller sekundær nekrose [13,14]. HSP’erne kan forbedre anerkendelse og optagelse af døende celler ved DC’er; yderligere kan tumorafledte antigene peptider binde til HSP’er og genanvendes til antigen præsentation i en særlig effektiv måde [14]. Antigen belastning er faktisk en delikat proces, da det ikke må forstyrre ekspressionen af ​​MHC klasse I- og klasse II og co-stimulerende molekyler, så for at give udviklingslandene til effektivt tilstedeværende antigener og prime T-lymfocytter. Optimalt manipuleret DC’er skal også udtrykke en stabil samt en aktiveret fænotype og bør beriges med adhæsionsmolekyler og chemokinreceptorer til at tillade deres målsøgning til sekundære lymfoide organer.

musebrysttumorvirus (MMTV) -induceret human –

Ras

udtrykke bryst tumor dyremodel er en meget informativ model for menneskelig brystkræft. [15]. Således er aktiverende mutationer i Ras oncogen fundet hos ca. 30% af humane maligniteter og MMTV-

er blevet skabt Ras Salg mus ved at placere et aktiveret v-Ha

Ras

under kontrol af MMTV-promotoren [16]. Malignt mamma og spytkirtel tumorer opstår blandt transgene mus mellem 9 og 20 uger med en top ved 12-15 ugers alderen. Vi har tidligere defineret de optimale betingelser for mærkning hel tumor lysat-loaded DC’er til MRI og SPECT [17]. Resultaterne af disse undersøgelser viste, at disse procedurer ikke ændrer DC funktion og kan bruges til at spore

in vivo

migration af mærkede DC’er at dræne LN i tumor bærende MMTV-

Ras

transgene mus.

på baggrund af disse resultater, vi yderligere kendetegnet de immunologiske funktioner i hele tumor lysat-pulserede DC’er i form af celle fænotype, funktionalitet, og evne til at fremkalde specifikke anti-tumor T-celle responser

i vitro

bruge MMTV-

Ras

transgene mus model. Desuden en

in vivo

undersøgelse blev udført ved at injicere antigen-loaded udviklingslandene i den samme musemodel, og immunsystemet profil og tumor debut blev evalueret.

Data heri indberettes er i stand til at understøtte DC -medieret aktivering af immunsystemet mod tumor, der viser en semi-moden profil af dendritiske celler og en T

H1 fænotype af T-celler i stand til signifikant at forsinke tumorvækst. Salg

Materialer og metoder

dyr

undersøgelsen blev godkendt af det italienske sundhedsministerium (studie protokol 07/010 for dyret anlæg beliggende på Institut for biomedicin og klinisk Sciences “L. Sacco”, Milano). Dyrene blev forvaltet i overensstemmelse med principperne i “Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr”, og i overensstemmelse med den italienske nationale lovgivning (lovdekret. 116/1992) og anbefalingerne fra Det Europæiske Fællesskab (86/609 /EØF) for pasning og anvendelse af forsøgsdyr. Voksne kvindelige FVB mus, 6-8 uger gamle, og FVB kvindelige MMTV-

Ras

mus [17], 27 ± 8 uger gamle, blev opretholdt på en 12-timers lys-mørke cyklus i bure af 5 dyr med vand og mad leveres

ad libitum

. Mandlige og kvindelige MMTV-

Ras

mus med tumor læsioner var heterozygote for menneske-Ras transgen og blev opretholdt i en ren FVB baggrund. MMTV-

Ras

mus mænd i FVB mus baggrunden blev avlet til at vildtype FVB hunner (Jackson Laboratories) for at opretholde den FVB baggrund. PCR-baseret muse screeningsassay til identifikation transgene mus blev udført.

Dendritisk cellekultur

Total knoglemarvsceller blev ekstraheret fra skinneben og lårben af ​​vildtype FVB-mus, som beskrevet tidligere [17 ]. Kort beskrevet efter fjernelse af muskelvæv blev bone epifyser skåret og knoglemarv blev skyllet ud ved anvendelse af en 26G1 /2 nål. Cellesuspensionen blev dyrket i komplet Iscoves (Euroclone, Italien) medium. En specifik cytokin cocktail, der indeholdt 3000 U /ml GM-CSF og 900 U /ml IL-4 (R 90% CD3

+ ved FACS-analyse.

Induktion af proliferative T-celle responser

in vitro

3×10

7 CD3

+ naive T lymfocytter blev resuspenderet i 0,1% PBS /BSA (PBI International) ved stuetemperatur og farvet med 2,5 ug /ml celle-permeant fluorescein-baserede carboxy-fluorescein-diacetat-succimidyl-ester (CFSE-DA eller CFSE, Sigma Aldrich), som kovalent tillægger cytoplasmatiske komponenter i celler, hvilket resulterer i en ensartet lyse fluorescens. Ved celledeling, er farvestoffet fordeles ligeligt mellem datterceller, hvilket tillader opløsning af celledeling ved flowcytometri. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 10 minutter, resuspenderet i 5 ml komplet kold Iscoves suppleret med 10% BSA (I10 medium) og inkuberet på is i 5 minutter. Celler blev derefter vasket med I10 medium ved 1.200 rpm i 7 minutter, resuspenderet ved en slutkoncentration på 3×10

6 celler i komplet Iscoves medium og udsået i en 24-brønds plade (Corning Coster) i nærvær /fravær af 3×10

5 tumor-lysat pulserede DC’er i 7 dage. Celler blev derefter høstet, vasket i PBS og farvet med anti-muse CD3-PECy7 (eBioscences) og analyseret ved flowcytometri. Procentdelen af ​​prolifererende celler blev beregnet som følger:.

spredning indeks blev beregnet som følger:.

Cytokine analyse

10

5 tumor-lysat pulserede DCs blev udpladet i en 24-brønds plade med 10

6 syngene CD3

+ T-celler og inkuberet ved 37 ° C 5% CO

2 for 1, 3, 5 eller 7 dage [5 ug /ml PMA -Phorbol myristat acetat- og 1M ionomycin (Sigma-Aldrich) stimuleret T-celler eller T-celler alene, blev anvendt som positive og negative kontroller, henholdsvis]. Plader blev centrifugeret ved 1.000 rpm i 10 minutter, og supernatanterne blev opsamlet og opbevaret ved -20 ° C til bestemmelse af cytokinniveauer. IFN-γ, IL-12p70 og IL-10 koncentrationen i supernatanterne blev målt ved specifik sandwich-enzymimmunanalyse (ELISA) (R PERM Cell Permeabilisering kit; Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA) i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke. Celler blev derefter vasket i PBS og resuspenderet i reagens B (FIX PERM Cell Permeabilisering kit; Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA) med mAb’er specifikke for forskellige cytokiner (IL-12p70, IL-10, IFN-γ, eBioscience) . Efter 45 minutters inkubation ved 4 ° C i mørke, blev cellerne vasket og fikseret i 1% paraformaldehyd i PBS.

In vivo

immunisering tidsplan

MMTV-

Ras Salg mus 6 uger gamle, blev randomiseret i to grupper: en gruppe modtager immunisering med tumor lysat-loaded dendritiske celler, og én gruppe, der fik fysiologisk saltopløsning som kontrol. For begge grupper injektionsstedet på niveauet for forgrunden pude af venstre bagben var forbehandlet med 30 ng af TNFa 24 timer inden celle administration. Derefter 2×10

6 antigen loaded-DC’er blev injiceret i den behandlede gruppe af MMTV-

Ras

mus, i nærværelse af yderligere 30 ng af TNF-α [17]. Kontrolmus modtog TNF-α injektion sammen med 20 ul fysiologisk saltvand; ubehandlede mus modtog ingen behandling. Mus blev behandlet i to på hinanden følgende uger med den samme protokol for injektion. Dyrene blev fulgt ugentligt til tidligt at identificere tumor debut ved manuel palpation og blev aflivet to uger efter tumor etablering ved cervikal dislokation efter bedøvelse med 4% chloralhydrat v /v (Sigma-Aldrich). Nogle mus fra hver gruppe blev aflivet syv dage efter modtagelse af den første immunisering og milte blev aseptisk indsamlet til analyse af T-cellefænotype og måling af cytokinproduktion; Omvendt blev alle resterende mus fulgt indtil slutningen af ​​immunisering behandling og tumor indtræden blev registreret. Musene blev derefter aflivet to uger efter tumor etablering og tumormasser blev indsamlet

Starten forsinkelse blev beregnet som:.. Uge for indtræden af ​​behandlede-mus-uge for indtræden af ​​kontrol mus

I hensyn til analyse af T-cellefænotype, CD3

+ T-celler blev isoleret fra splenocytter fra immuniserede eller kontrol MMTV-

Ras Salg mus ved magnetisk separation ved anvendelse af en Pan T-celle Isolation Kit (Myltenyi Biotech, Italien) og blev farvet med fluorescerende mærket monoklonale antistoffer rettet mod et panel af celleoverflademarkører [fluoresceinisothiocyanat (FITC), phycoerythrin (PE), phycoerythrin-cyanin 5 (PCy5) eller 7 (PCy7)] (eBioscience, San Diego, CA , USA): CD4, CD8, CD25, CD69. Som en parameter af T-celle-effektorfunktion blev kombineret evaluering af cytokinsekretion udføres ved flowcytometri. 3×10

6 CD3

+ T-celler blev farvet i 1 time ved 4 ° C med et umærket antistof anti-FcyR at reducere a-specifikke signaler. Celler blev derefter farvet med anti-CD4 PECy5 og anti-CD8-PECy7 (eBioscience) i 30 minutter ved 4 ° C i mørke, vasket og fikseret i reagens A opløsning (FIX PERM Cell Permeabilisering kit; Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA) i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke. Celler blev derefter vasket i PBS og resuspenderet i reagens B (FIX PERM Cell Permeabilisering kit; Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA) med monoklonale antistoffer specifikke for IL-10, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α, Granzyme B og Perforin (eBioscience). En yderligere intracellulær farvning blev udført med et museantistof anti-Foxp3 (eBioscience, San Diego, CA) for at identificere T

regs som CD4

+ /CD25

+ /Foxp3

+ -celler. Efter 45 minutters inkubering ved 4 ° C i mørke blev cellerne vasket og fikseret i 1% paraformaldehyd i PBS.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført med SPSS 11 software (SPSS Inc., Chigaco, IL, USA). Sammenligninger af prøver for at afgøre den statistiske signifikans af forskellen blev bestemt ved den tosidede Mann-Whitney rank sum test for uafhængige prøver. Værdier af P 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

DC immunofænotype

Murin DCs blev fremstillet ud fra knoglemarv forstadier og høstet efter 6 dages dyrkning med forekomst af GM-CSF og IL -4 som beskrevet ovenfor. Kvaliteten og renheden af ​​DC’er blev vurderet ved FACS-analyse på grundlag af ekspressionen af ​​overflademarkør CD11c; 88% celler var CD11c

+. Cellernes levedygtighed var højere end 90% i alle forsøg. Før pålæsning med tumor lysat blev DC’er kendetegnet ved flowcytometri til at analysere ekspressionen af ​​MHC klasse I og II-molekyler, costimulatoriske molekyler (CD86, CD80, CD40), og markører associeret med modning (CD83, CCR7, PD-L1). DC’er viste lave niveauer af MHC klasse I og II-molekyler, CD86, CD80 og CD40, og CCR7, hvilket viser en umoden fænotype. I alle tilfælde DC’er udtrykte signifikante niveauer af PD-L1, sandsynligvis fremkaldt af GM-CSF og /eller IL-4-behandling (figur 1).

Unpulsed umodne DC’er (IDC’erne), tumor lysat-loaded DCs (TAA -DCs) og LPS stimuleret-DC’er, blev sat op parallelt og høstet på samme tid for fænotype analyse. DC’er blev identificeret ved MHC-DR, CD11 (A) (øvre dot blot og lavere dot blot, der viser gating strategi og MHC II-ekspression på CD11c

+ -celler før og efter tumor lysat-loading og LPS-stimulering, henholdsvis) og markørerne vist i figuren (B). Tallene angiver MFI (middel fluorescens intensitet) for isotypekontroller (åbne histogrammer) og DC overflademarkører (skraverede histogrammer). Repræsentative resultater fra en ud af tre eksperimenter er vist her. Fold-stigning i ekspressionsniveauerne af modning markører på tumor-lysat pulserede DC’er end IDCS blev bestemt ved at udtrykke MFIer i forhold til TAA-DCs til unpulsed IDCS (C).

DC modning i respons på antigen loading

tumor cellelysat repræsenterer hele proteinindholdet i lyserede tumorceller. For at inducere DC-aktivering og modning blev celler pulseret med hele tumor lysat af brysttumorer eksplanterede fra MMTV-

Ras Salg mus i 24 timer. Som vist i figur 1, denne procedure førte til en betydelig stigning i overfladeekspression af specifikke proteiner, herunder PD-L1, sammenlignet med ekspressionsniveauerne af losses DC’er. Lignende resultater blev observeret efter LPS stimulering (positiv kontrol) (figur 1)

DC levedygtighed blev ikke påvirket af antigen-loading procedure (ubelastet-DC:. 100%

vs

indlæst-DCs og LPS-stimuleret-DCs: 98% og 98,5%, henholdsvis), mens en betydelig parallel stigning i den funktionelle modne DC befolkning kunne observeres (losses-DCs: 11%

vs

indlæst-udviklingslandene og LPS-stimulerede -DCs:. 51% og 50%, henholdsvis)

konfokal mikroskopi evaluering af DC belastning med tumor lysat

kapaciteten af ​​udviklingslandene til at tage op tumor lysat blev bekræftet ved konfokal mikroskopi. Både murine celler og tumor cellelysat var fluorescens-mærket, og billeder blev erhvervet. Konfokal mikroskopi billeder af 24 timers co-kulturer af DC’er og tumorceller lysat viser, at fluorescerende materiale fra lyserede tumorceller blev internaliseret af DC’er. Analyser af konfokal mikroskopi fly indikerede, at DC-grøn fluorescens blev omkring tumor lysat-rød fluorescens, men derimod blev ikke observeret. Beviser for internalisering i konfokale planer er vist ved forskellige forstørrelser og sammenfattes i en rekonstruktion af flere konfokale fly i Z-aksen. Resultater demonstrerer således cytoplasmisk lokalisering af tumorantigener i DC’er, hvilket bekræfter, at dag-6 umodne DC’er havde en aktiv fagocytisk evne og var i stand til at tage hele tumor cellelysat (figur 2).

Konfokal mikroskopi blev anvendt til at verificere cytosolisk lokalisering af tumorafledte antigener efter 24 timers co-kulturer af dag-6 DC’er og tumorceller lysat. Tumor masserne blev mærket med PKH26 Red Fluorescent Cell Linker (rød) og DC’er blev farvet med det monoklonale antistof anti-CD11 c FITC (grøn). Antigen belastning verificeres ved visualisering af tumorantigen (rød) inden dendritiske celler (grøn). En repræsentant for tre uafhængige forsøg er vist; alle billeder er 20X mens zoom er 40X.

Gen-ekspression profil tumor lysat-pulserende DCs

For at teste, om svulsten lysat pulserende modulerer samlede genekspression af udviklingslandene, vi analyserede ekspressionen af ​​84 gener involveret i DC-aktivering og modning ved hjælp rtPCR arrays. Vi sammenlignede ekspressionsprofilen af ​​DC’er efter 6, 16 eller 24 timers inkubation med tumorantigener; resultater blev bekræftet i mindst tre uafhængige assays. Salg

Resultaterne viste, at 43 gener blev opreguleret (fold ændring ≥ 2 i indlæste DC’er versus aflæsset DC’er), og 7-generne blev nedreguleret. Blandt de opreguleres gener fandt vi gener, der er væsentlige involveret i celle mobilitet og klyngedannelse, og DC-T-celle-interaktioner, såsom CD44, ICAM-1, cdc42, Rac1 og ERAP1 (Fig 3A), og i antigenpræsentation herunder TAP2, TAPBP, CD1d1 og B2M (fig 3B). Opreguleres gener var også medlemmer af B7-familien, herunder B7.1 (CD80) og B7.2 (CD86), der specifikt binder til deres beslægtede ligand på T-celler og give det andet signal til T-celle aktivering og styrkelse af DC-funktion, og CD40, et co-stimulatorisk protein, der kræves for DC-aktivering ved binding til CD40L på T

TH-celler (fig 3B).