PLoS ONE: Nedsat Peritoneal kræft i æggestokkene vækst i mus Mangler Ekspression af Lipid Fosfat phosphohydrolase 1

Abstrakt

lysophosphatidsyre (LPA) er en bioaktiv lipid, der forbedrer æggestokkræft proliferation, migration og invasion

i vitro

og stimulerer peritoneal metastaser

in vivo

. LPA genereres gennem virkningen af ​​autotaxin eller phospholipaser, og nedbrydning begynder med lipid fosfat phosphohydrolase (LPP) -afhængig fjernelse af fosfat. Mens virkningerne af LPA på ovariecancer progression er klare, ikke er blevet rapporteret virkningerne af LPA metabolisme i tumormikromiljøet på peritoneal metastase. Vi undersøgte bidrag lipid phosphataseaktivitet til ovariecancer peritoneal metastase anvendelse af mus deficiente i LPP1 ekspression. Homozygot sletning af LPP1 (LPP1 KO) resulterer i forhøjede niveauer og nedsat omsætning på LPA

in vivo

. Inden for 2 uger intraperitoneal injektion af syngene mus ovariecancer celler observerede vi forbedret tumor såning i LPP1 KO-mus sammenlignet med vildtype. Imidlertid tumorvækst et plateau i LPP1 KO-mus med 3 uger, mens tumorer fortsatte med at vokse i vildtypemus. Den faldt tumorbyrde blev ledsaget af øget apoptose og ingen ændring i proliferation eller angiogenese. Tumorvækst blev restaureret og apoptose vendes med eksogen administration af LPA. Samlet set viser disse observationer viser, at de forhøjede niveauer af LPA per se i LPP1 KO-mus ikke hæmmer tumorvækst. Snarere, støtter dataene den tanke, at enten forhøjet LPA koncentration eller ændret LPA stofskifte påvirker andre vækstfremmende bidrag tumor mikromiljø

Henvisning:. Nakayama J, Raines TA, Lynch KR, Slack-Davis JK (2015 ) Nedsat Peritoneal kræft i æggestokkene vækst i mus Mangler Ekspression af Lipid Fosfat phosphohydrolase 1. PLoS ONE 10 (3): e0120071. doi: 10,1371 /journal.pone.0120071

Academic Redaktør: Tanya V. Kalin, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: September 8, 2014 Accepteret: 3 februar 2015; Udgivet: 13 Mar 2015

Copyright: © 2015 Nakayama et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health /National Cancer Institute tilskud CA142783 støttede JKS-D og KRL, som også blev støttet af National Institutes of Health Generelle Medical Sciences giver GM067958-09. TAR blev understøttet af en mangfoldighed supplement til CA142783. JN blev støttet af University of Virginia Gynækologisk onkologi Fellowship Program. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Lysophsphatidic syre (LPA) er en bioaktiv lipid, der regulerer flere cellulære funktioner kritiske for tumorgenese og metastase, herunder spredning, overlevelse, cytoskeletal reorganisering, migration, invasion og cytokinproduktion [1-5]. Betydningen af ​​LPA til ovariecancer progression blev etableret, da det blev identificeret som en vækstfaktor i maligne ascites [6]. LPA stimulerer cellulære aktiviteter via mindst tre (LPA1, LPA2, og LpA3) og måske så mange som seks (LPA4-6) G-protein koblede receptorer. LPA1 udtrykkes på normal æggestokkene overflade epitel; udtryk for LPA2 og LpA3 induceres i kræftcellerne [2]. Ved binding dets receptor, LPA stimulerer ovariecancer celleproliferation gennem aktivering af Gα12 [4]. Alle tre receptorer regulerer ovariecancer celle migration og invasion direkte ved at aktivere pro-vandrende Rac og Rho-afhængige signalveje [1,7]. Desuden LPA fremmer æggestokkene cancervækst og metastase indirekte ved at stimulere produktionen af ​​proteaser (MMP og urokinaseplasminogenaktivator) [8,9] og cytokiner (IL-6 og IL-8), som spiller en rolle i æggestokkene invasion cancer og metastase [10]. LPA-binding til LPA2 eller LpA3 øger produktionen af ​​IL-6, IL-8, og VEGF. Faktisk knockdown af LPA2 eller LpA3 falder IL-6 produktion, og deres overekspression fører til øgede serumniveauer af IL-6 og VEGF, øget tumor byrde og kortere overlevelsestid i en musemodel for kræft i æggestokkene peritoneal metastase; modulering af LPA1 havde ingen signifikant virkning i denne undersøgelse [11].

LPA produceres af en række celler i tumormikromiljøet herunder blodplader, mesotelceller, adipocytter, endotelceller og ovariecancerceller [12,13 ], og i fravær af kræft, koncentrationer stramt holdt under 1 uM. Niveauer af LPA er signifikant forhøjet i plasma og ascites (op til 50 uM) af kvinder med ovariecancer [14], og øget plasma LPA er blevet foreslået som en biomarkør for ovariecancer [15]. Medlemmer af phospholipase

1 (PLA

1) og PLA

2 familier fjerne en fedtsyrekæde fra phosphatidsyre til dannelse LPA. Autotaxin (ATX), et ekstracellulært lysophospholipase D genererer også LPA efter fjernelsen af ​​cholin fra lysophosphatidylcholin. PLA

2 og autotaxin er forhøjet i æggestokkene kræftpatienter [16,17], og der findes en positiv spiral mellem vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) og ATX produktion af æggestokkene cancerceller [18].

LPA katabolisme initieres af lipid phosphat phosphohydrolases (LPPS), type 1, 2 og 3, som fjerner phosphatgruppen at generere monoacylglycerol (MAG). MAG yderligere spaltes af monoacylglycerol lipase til at frigive fedtsyrekæden fra glycerol. LPP1 og LPP3 ekspression reduceres i humane ovariecancer forhold til normale ovarievæv [19], mens tvunget over-ekspression af enten LPP1 eller LPP3 formindsker tumorigenese af ovariecancerceller i musemodeller formentlig fra nedsat niveau af LPA [19,20].

Udover at regulere ovariecancer celleproliferation, overlevelse, migration og invasion

in vitro

, evne LPA til at fremme ovariecancer invasion og vækst er blevet demonstreret i musemodeller for peritoneal metastase; daglig injektion eller implantation af pumper producerer høje koncentrationer af LPA øget tumor byrde i immun kompromitteret og syngene musemodeller [21,22]. Imidlertid er ikke blevet rapporteret virkningerne af LPA metabolisme i tumormikromiljøet på peritoneal metastase. Vi har forsøgt at bestemme, om nedsat LPA phosphatase (specifikt LPP1) aktivitet påvirkede ovariecancer peritoneal metastase. Stedet for at målrette LPP1 aktivitet i tumorcellerne, undersøgte vi virkningen af ​​LPP1 tab i tumormikromiljøet anvendelse af mus som mangler LPP1 ekspression efter indsættelsen af ​​en exon-trap (LPP1 KO) [23] og syngeniske muse ovariecancerceller [24] . Lipid phosphataseaktivitet i LPP1 KO mus er markant nedsat (35-95%) i flere væv, herunder dem, der findes inden i bughulen. Derudover er plasma LPA metaboliseres 4 gange langsommere end vildtypemus, og plasmakoncentrationer af LPA er signifikant forhøjet i LPP1 KO-mus [23]. Her rapporterer vi, at peritoneal ovariecancer vækst i LPP1 KO mus blev ophøjet så tidligt som 2 uger efter initiering i forhold til kontrol vildtype; Men mens tumorbyrde fortsatte med at stige i vildtypemus, det plateaued efter 3 uger i mus, som mangler LPP1 ekspression. Den faldt tumorbyrde blev ledsaget af øget apoptose og ingen ændring i proliferation eller angiogenese. Data fra en matrigel plug angiogenese assay ikke afsløre defekter i LPP1 KO mus. Desuden eksogen administration af LPA stimuleret æggestokkene vækst kræft til lige så høj grad i vildtype og LPP1 KO mus. Tilsammen udgør disse observationer støtter den opfattelse, at LPP1 KO-mus enten mangler en kritisk vækstfremmende faktor eller producere en inhibitor af æggestokkene cancervækst, som kan overvindes ved at forøge LPA efter exogen administration.

Materialer og metoder

Celledyrkning og transfektion

ID8 celler blev generøst leveret af Dr. K. Roby (University of Kansas) [24] og dyrket i DMEM suppleret med 4% føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin , 100 ug /ml streptomycin, 5 ug /ml insulin, 5 ug /ml transferrin og 5 ng /ml natriumselenit. De blev passeret to gange gennem C57BL /6-mus for at øge tumor tage og mindske vækstkinetik. Den resulterende cellelinie, ID8ip2, blev transduceret med lentivirus udtrykker luciferase (GeneCopoeia, Rockville, MD), og stabilt udtrykker populationer (ID8ip2Luc) blev opnået efter puromycin (2 ug /ml) selektion for 2 uger.

Mus blev udført ovariecancer peritoneale metastaser

Alle eksperimenter dyr efter godkendelse fra Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Virginia. Seks til 8 uger gamle vildtype (C57BL /6) eller LPP1 hypomorphic (LPP1 KO) mus blev injiceret intraperitonealt (IP) med 10

6 ID8ip2Luc celler i 200 pi PBS. Eksperimenter blev udført med grupper af 3-5 mus pr genotype og /eller behandling; det samlede antal mus analyseres (n) er angivet i figuren legende. Mus blev observeret 2-3 gange ugentligt laboratoriepersonale og overvåges for tegn på lidelse (dvs. ændringer i udseende, respiration, aktivitet, etc.) og vejes; mus viser tegn på angst eller miste mere end 15% kropsvægt blev aflivet og undersøgt for tumor. LPA (18: 1, Sigma-Aldrich) blev suspenderet i 0,5% fedtsyre-frit bovint serumalbumin i phosphatbufret saltvand (PBS) ved en koncentration på 100 pmol /l, og 200 pi blev leveret IP gang dagligt fra 1 døgn efter tumorinitiering og fortsættes i 6 uger. Daglig administration af vehikel tjente som negativ kontrol. Tumorbyrde blev monitoreret ugentligt ved måling lysemissionen følgende IP luciferin administration som en indikation af luciferaseaktivitet under anvendelse af et IVIS afbildningssystem (Molecular Imaging Core, University of Virginia). Samlede flux (fotoner /sek) blev bestemt for hele bughulen. Ved eksperimentel afslutning blev musene aflivet og tumorbelastning evalueret ved obduktion ved at tælle antallet af tumorknuder, og vejning omentum (primære sted for tumorimplantation) og eventuelle yderligere tumornoduler. Formalin-fikseret, paraffinindlejrede væv blev sektioneret og H . E farves (University of Virginia Research Histologi Core) for at evaluere mikroskopisk tumor byrde, omfanget af peritoneal invasion, og mitoseindeks

Immunhistokemi

Et afsnit af tumor indeholdende omentum pr mus blev underkastet immunhistokemisk for Ki67 (1:. 500, kanin monoklonale, Epitomics, Cat # 4203-1), spaltet caspase 3 (1: 500, kanin polyklonale, Cell Signaling, Cat. # 9661), CD31 (endotelcelle; 1:.. 4, kanin-polyklonalt, Abcam, Cat # ab28365), eller VCAM-1 (1: 800, kanin polyklonale, Abcam, Cat # ab134047) (University of Virginia Biorepository Tissue Research Facility). Kort beskrevet blev snit kogt i lav pH (Ki67, CD31) eller høj pH (spaltet caspase 3, VCAM-1) EnVision FLEX Target Retrieval Solution (Dako) og farvet med de angivne koncentrationer af hvert antistof. Antigen-antistof-kompleks blev påvist under anvendelse Envision Dual Link (Dako) efterfulgt af inkubering med 3,3′-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB +) kromogen (Dako) og modfarvet med hematoxylin. Ki67, og spaltes caspase 3-farvning blev kvantificeret som summen af ​​antallet af positivt og negativt farvet tumorceller i 5 kraftige (400X forstørrelse) felter per sektion (én sektion pr mus) til beregning af procent positive celler. Omfanget af dannelse beholderen blev bestemt ved at tælle antallet af CD31 farvede fartøjer og normalisere den til den samlede tumorområde (skitseret og beregnet ved hjælp ImageJ) pr 200X felt (5 felter per sektion, 1 sektion per mus). Procentdelen af ​​mesotelceller udtrykker membranøs VCAM-1 blev scoret positiv på . 50%

Matrigel stik angiogenese assay

Vækstfaktor-reduceret matrigel (BD Biosciences) blev blandet med ID8ip2Luc celle konditioneret medier (1: 1) eller med 1 ug /ml FGF, 20 ug /ml VEGF [25] og injiceret subkutant i 10 vildtype eller 8 LPP1 KO-mus. Hver mus modtog 1 matrigel stik med konditionerede medier og et med FGF /VEGF. Efter 10 dage blev musene aflivet, og Matrigel stikpropper blev udvundet, fikseret i 10% formalin, indlejret, snittet og farvet for CD31 at markere fartøjer. Det samlede antal CD31 positive fartøjer i fem 200X forstørrelse felter pr stik blev talt. Stik ikke inddrives fra alle mus; antallet af stikpropper for hver genotype og angiogene stimulus er indikeret i figuren legende.

Statistical Analysis

Alle data blev analyseret under anvendelse af GraphPad Prism 6 software. Luminescens blev analyseret ved anvendelse af 2-vejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Tukey multiple sammenligninger test. Envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys multiple sammenligninger test blev anvendt til at analysere omentum vægte og vævsfarvning fra mus behandlet med LPA eller vehikel. Forekomsten af ​​invasive tumorer eller VCAM-1-farvning blev analyseret under anvendelse af Fishers Exact test. De resterende data blev analyseret med en uparret t-test eller Wilcoxan-Mann-Whitney test afhængigt af, om de data, der var parametrisk.

Resultater

Øget tumor såning af bughinden i LPP1 KO mus

Mens bidrag LPA til æggestokkene vækst kræft og progression er blevet omfattende undersøgt [1,2,4,7-11], virkningerne af LPA stofskifte om kræft progression er dårligt forstået. Vi undersøgte effekten af ​​reduceret LPA omsætning på metastatiske peritoneale ovariecancer vækst og progression hjælp mus mangler lipid fosfatase, LPP1 (LPP1 KO) og en syngen mus kræft i æggestokkene cellelinie, ID8ip2Luc.

In vivo

billeddannelse af mus efter intraperitoneal (IP) injektion af ID8ip2Luc celler afslørede forøget luminescens i LPP1 KO-mus sammenlignet med vildtype i løbet af 2 uger (Fig. 1A). Fysisk undersøgelse af bughulen ved nekropsi 2 uger efter tumorinitiering viste ingen indikation af tumorknuder (data ikke vist) og ingen forskel i vægten af ​​den omentum (primære sted for tumormetastase) mellem genotyper (S1 Fig.) Eller fra ikke- tumorbærende mus (data ikke vist). Imidlertid evaluering af H LPP1 KO n = 12) blev afbildet ugentligt efter tumorinitiering at overvåge tumorvækst. Data repræsenterer middelværdier samlede flux (fotoner /sekund) ± std err og blev analyseret ved to-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey multiple sammenligninger test. (B) Det samlede antal mikroskopiske tumorknuder blev talt i et individ, tilfældigt udvalgt, H LPP1 KO n = 8). Dataene repræsenterer gennemsnit ± std err; p = 0,0069 bestemt ved t-test. (C) Procentdelen af ​​vildtype eller LPP1 KO (fra (B)) mus med invasive (udfyldte søjler) eller ikke-invasiv (omfatter ikke tumor; stiplede blokke) tumorer 2 uger efter tumorinitiering. Antal mus pr resultatet er indikeret. Signifikans bestemmes ved Fishers eksakte test. (D) Procentdelen vildtype eller LPP1 KO (fra (B)) mus med (positive, massive søjler) eller uden (negative, stiplede søjler) mesothelial VCAM-1 farvning af IHC 2 uger efter tumor initiering. Antal mus pr resultatet er indikeret. Signifikans bestemmes ved Fishers eksakte test.

Formindsket tumorvækst og forøget apoptose i LPP1 KO-mus Salg

Mens mikromiljø LPP1 KO mus begunstiger tumorimplantation i bughulen, vildtypemus viste tilsvarende tumor byrde angivet med luminesence inden for 3 uger efter (fig. 1A). Mere påfaldende, robust tumorvækst fulgte i vildtypemus som vist ved øget luminescens over tid mens tumorer nåede et plateau i LPP1 KO-mus ved 3 uger (fig. 2a og 2b). Derudover havde vildtypemus øget antal af makroskopiske tumorknuder studding peritonealhulen og øget tumorvolumen bestemt ved vejning omentum og associerede tumorer (fig. 2C og 2D). At afgøre, om manglen af ​​tumorvækst i LPP1 KO-mus skyldtes mindre proliferation eller øget apoptose blev tumorer farvet for den proliferative Ki67 eller spaltet caspase 3, som en markør af apoptose. Tumorer, der stammer fra vildtype og LPP1 KO mus havde tilsvarende niveauer af proliferation (fig. 3A). Men tumorer fra LPP1 KO mus havde 3 gange flere celler farves positivt for spaltet caspase 3 sammenlignet med vildtype (fig. 3B), hvilket indikerer en betydelig stigning i apoptose. Derfor, mens tab af LPP1 i tumormikromiljøet letter tumor podning, er det utilstrækkeligt til at opretholde tumorvækst over tid på grund i det mindste delvis til en stigning i apoptose.

Efter IP injektion af ID8ip2Luc celler blev mus afbildet ugentligt for at overvåge tumorvækst kinetisk. (A) Repræsentative luminescens billeder af vildtype og LPP1 KO mus med tumor taget ved 2-ugers intervaller. (B) Kvantificering af total flux (fotoner /sekund) blev bestemt ugentligt i vildtype (n = 10) og LPP1 KO (n = 12) mus. Dataene repræsenterer gennemsnit ± std err; p 0,001 bestemt ved 2-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey multiple sammenligninger test. (C) Dataene repræsenterer antallet af makroskopiske tumorknuder per mus bestemmes 8 uger efter tumorinitiering. Mus med for mange knuder til at tælle blev tildelt en værdi på 200. data repræsenterer medianen med 25

th og 75

th percentiler; p = 0,02 bestemt ved anvendelse af Wilcoxan-Mann-Whitney-test. (D) Tumor volumen blev bestemt ved at veje omentum (primære sted for tumor dannelse) og alle tilhørende tumor knuder 8 uger efter tumor initiering; hvert punkt angiver en individuel mus. Dataene repræsenterer medianen med 25

th og 75

th percentiler; p = 0,0031 bestemt ved t-test.

Tumorer samlet 8 uger efter påbegyndelse blev snittet og farvet for Ki67 (A) eller spaltes caspase 3 (B). Farvning blev kvantificeret ved at tælle antallet af positive og negative celler fra 5 højtydende felter (400x forstørrelse) af tumor per mus, 5 mus pr gruppe. Dataene er præsenteret som procent positive. Box og whiskers plots viser minimum, 25

percentil, median, 75

percentil og maksimale værdier. * P 0,001, t-test.

Angiogenese ændres ikke i LPP1 KO mus

Øget apoptose i LPP1 KO mus kunne opstå som følge af en mangel på næringsstoffer tilføres tumoren på grund af mangelfuld angiogenese, fraværet af en pro-overlevelsesfaktor eller tilstedeværelsen af ​​en inducer af celledød. Faktisk mus, som mangler LPP3 ekspression er embryonale letale skyldes en defekt i angiogenese [27]. For at bestemme om angiogenese var defekt i LPP1 KO-mus blev tumorer farvet for endotel markør CD31. Som vist i fig. 4A, tumorer fra vildtype og LPP1 KO mus havde tilsvarende niveauer af CD31 farvning. Til mere objektivt vurdere, om der var en iboende ændring i angiogenese, vi udførte en matrigel stik assay. Kort beskrevet matrigel indlejret med tumorcellelinier konditionerede medier eller FGF og VEGF blev implanteret i flankerne af vildtype eller LPP1 KO-mus til at stimulere angiogenese (S2 Fig.). Tumor celle aircondition medier stimulerede et tilsvarende antal skibe i vildtype og LPP1 KO mus (fig. 3B). FGF /VEGF-stimuleret dannelse fartøj i højere grad i LPP1 KO-mus sammenlignet med vildtype (fig. 3C). Sammen indikerer disse observationer, at den øgede apoptose og ledsagende fald i tumorbelastning i LPP1 KO mus ikke skyldtes en defekt i angiogenese.

(A) Tumorer fra mus 8 uger efter påbegyndelse blev snittet og farvet for CD31, og det samlede antal CD31 positive kar pr tumor område fra 5 høj powered felter (HPF; 200X forstørrelse) per mus for vildtype (WT, n = 5) og LPP1 KO (n = 5) mus er afbildet. Det samlede antal CD31 positive kar observeret i 5 HPF Matrigel plugs indeholdende konditionerede medier fra ID8ip2Luc celler (B) eller FGF /VEGF (C) er afbildet (se Materialer og fremgangsmåder). Data er præsenteret med Box og whiskers plots som beskrevet for fig. 3. * p = 0,0083, t-test.

Eksogen vækstfaktor administration overvinder tumor undertrykkelse i LPP1 KO mus

Reduceret tumorvækst i fraværet af defekter i angiogenese er vejledende af manglen på en vækstfremmende miljø i LPP1 KO-mus. Et sådant miljø kan involvere en lang række komponenter herunder manglen på en vækstfremmende (pro-overlevelse) faktor er tilstedeværelsen af ​​en inhibitor af vækst (inducer af celledød), manglende evne til at rekruttere hjælpestoffer celler nødvendige for at fremme vækst, upassende celle-celle interaktioner inden tumoren eller enhver kombination af disse eller supplerende virkninger. Vi antager, at eksogen administration af høje koncentrationer af en vækstfaktor ville tilsidesætte de negative konsekvenser af den væksthæmmende miljø. LPA er en veletableret stimulator af ovariecancer cellevækst [2,4]. Daglig administration af LPA er blevet rapporteret at stimulere vækst af humane ovariecancerceller i immunkompromitterede mus [21] og tumorer i ID8 muse ovariecancer model [22]. Derfor testede vi evnen hos LPA til at stimulere ID8ip2Luc tumorvækst i LPP1 KO sammenlignet med vildtypemus. Daglig administration af LPA steget markant tumorvækst i vildtypemus startende 4 uger efter initiering og kulminerede i 3 gange mere luminescens i forhold til vildtype-mus uden eksogen LPA (fig. 5A), i overensstemmelse med tidligere observationer [22]. LPA stimulerede også tumorvækst i LPP1 KO-mus i samme grad observeret hos vilde mus typen behandlet med LPA (fig. 5A). I begge tilfælde LPA øget tumorcelleproliferation (fig. 5B). Påfaldende, LPA faldt antallet af celler, der farves positive for spaltet caspase 3 til niveauet fundet i tumorer fra vildtypemus med eller uden LPA (fig. 5C). Dataene indikerer, at levering af forøgede koncentrationer af LPA vender negativ vækstmiljø fundet i LPP1 KO-mus.

ID8ip2Luc ovariecancerceller blev injiceret IP i vildtype (WT, n = 19) eller LPP1 KO (n = 20) mus. Mus modtog daglige injektioner af LPA (n = 6 WT, n = 7 LPP1 KO) eller vehikel (n = 13 for begge genotyper) begyndende dagen efter tumorinjektion. (A) Mus blev afbildet ugentligt efter tumorinitiering at overvåge tumorvækst. Dataene repræsenterer gennemsnitlige totale flux (fotoner /sekund) ± std err; * P 0,001, 2-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey multiple sammenligninger test. Tumorer blev samlet 6 uger efter initiering, snittet og farvet for Ki67 (B) eller spaltes caspase 3 (C). Kvantificering af Ki67 og kløvet caspase 3 blev opnået ved at bestemme den procentdel af positivt farvede celler i 5 kraftige felter (400x forstørrelse) pr mus, 5 mus per gruppe. Data er præsenteret med Box og whiskers plots som beskrevet for fig. 3. ** p 0,0001, 2-vejs ANOVA efterfulgt af Tukeys multiple sammenligninger test.

Diskussion

LPA er en vigtig regulator af æggestokkene vækst cancer og metastaser. Ud over de øgede niveauer, der findes i ascites, som er ledsaget af øget ATX aktivitet, tumorer selv har de novo ekspressionen af ​​LPA-receptorer (LPA2 og LpA3) [2] og nedsat udtryk for LPP1 og LPP3 [19,20]. Her undersøgte vi bidraget fra LPA stofskiftet i ikke-kræftceller i tumor mikromiljø på dannelse og udvikling af kræft i æggestokkene i bughulen. Tab af LPP1 udtryk i tumor mikromiljø ført til øget tumor såning følgende IP injektion af æggestokkene cancerceller; imidlertid efterfølgende vækst blev hæmmet, som blev ledsaget af øget apoptose og ingen fejl i tumorcelleproliferation, angiogenese eller makrofag og lymfocyt rekruttering (data ikke vist). Disse observationer indikerer, at tab af LPP1 skaber et miljø utilstrækkelig til at understøtte tumorvækst måske på grund af mangel på pro-overlevelsesfaktorer eller tilstedeværelsen af ​​vækstinhibitorer. Salg

LPP1 KO-mus er karakteriseret som havende forøget plasma LPA niveauer og reduceret LPA omsætning [23]. LPA stimulerer mange aspekter af kræft i æggestokkene cellebiologi, herunder spredning, overlevelse, migration og invasion [2,4]. Faktisk observerede vi en stigning i mesothelial invasion og tumor såning tidligt efter tumor initiering i LPP1 KO mus. LPA er blevet rapporteret til at stimulere mesothelial invasion i cellekultur modeller [13] og

in vivo

[22], selv om der ikke er defineret en mekanisme. Tidligere viste vi en rolle for VCAM-1 udtrykt på mesothelium i reguleringen af ​​æggestokkene invasion kræft in vitro og in vivo [26]. Interessant LPP1 KO-mus havde en højere forekomst af mesotelial VCAM-1-ekspression giver muligheden for, at LPA kunne regulere VCAM-1 ekspression til at fremme mesotelial invasion. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at afgøre, om dette er tilfældet.

Mens LPP1 KO mus har øget tumor såning i tilstedeværelsen af ​​forhøjede niveauer og reduceret omsætning på LPA, blev efterfølgende tumorvækst forkrøblet og ledsaget af øget apoptose, en resultat, der modsiger veletablerede pro-vækst, pro-overlevelse virkninger af LPA. De mekanismer, hvorved tab af LPP1 i tumorens mikromiljø Stopper tumorvækst er uklare. En mulighed er, at forhøjet LPA som følge af LPP1 manglerne vedrører andre cellulære bestanddele af tumormikromiljøet til negativ indflydelse tumorvækst. Tumormikromiljøet indeholder en kompleks blanding af cytokiner, vækstfaktorer og flere celletyper, herunder endotel- og immunceller, der fungerer sammen for at fremme tumorvækst [28]. Mens den øgede apoptose i tumorer fra LPP1 KO-mus kan skyldes mangel på næringsstoffer levering til tumoren, observerede vi ingen defekt i angiogenese. LPA er blevet rapporteret at stimulere migrering og overlevelse af makrofager [29-31], lette transmigration af lymfocytter [29,32], og inhiberer den cytotoksiske aktivitet af T-celler og NK-celler [33,34], som alle ville forventes at fremme tumorvækst. Vi fandt ingen forskel i antallet af makrofager eller lymfocytter (B, T og NK) i tumorer fra vildtype og LPP1 KO-mus (data ikke vist). Det er imidlertid muligt, at tumorer fra LPP1 KO-mus har forskellige undergrupper af immune celler (dvs. mangel på pro-tumor eller overrepræsentation af anti-tumor) og /eller ændret regulering af deres aktivitet.

Virkningerne af tab af LPP1 på tumorvækst kan skyldes ændringer i metabolismen af ​​andre phosphoglycerider. Foruden LPA, LPP1 virker på andre phosphoglycerider herunder phosphatidsyre og sphingosin 1-phosphat (S1P) [35], som i høje koncentrationer inducerer ovariecancer celledød [36]. Men vi ikke observeret nogen forskelle i S1P plasmakoncentrationer mellem vildtype og LPP1 KO-mus (data ikke vist). Koncentrationen af ​​andre phosphoglycerider er ikke målt. Det er vigtigt at overveje, at omsætningen af ​​LPA og /eller andre phosphoglycerider kan være lige så vigtigt som deres absolutte koncentration.

Sammen data præsenteret her, viser, at tabet af LPP1 skaber et miljø utilstrækkelige til at understøtte tumorvækst . Exogen udbud af højere koncentrationer af LPA var i stand til at overvinde den hæmmende miljø at stimulere tumorvækst og mindske apoptose demonstrerer, at LPA stimulerer tumorcellevækst uanset eventuelle negative virkninger skabt af tabet af LPP1 udtryk. Yderligere undersøgelse af de mekanismer (herunder potentielle cellulære mål) er ansvarlige for reduceret tumorvækst i fravær af LPP1 ville give yderligere vigtige oplysninger om virkningerne af phosphoglyceriderne og deres stofskifte på tumor mikromiljø samt komponenter i mikromiljø, som kan være vigtige i fremme kræft i æggestokkene progression.

Støtte Information

S1 fig. Karakterisering af tumorer og VCAM-1-ekspression i LPP1 KO og vildtypemus 2 uger efter tumorinitiering.

(A) Omentums blev fjernet og vejet 2 uger efter tumorinitiering fra vild type og LPP1 KO-mus. Hvert punkt angiver et enkelt individ, og dataene repræsenterer middelværdien ± std err. (B) H pilespidser angiver tumor. Ikke-invasive tumorer blev karakteriseret som havende en glat grænseflade mellem tumoren og det underliggende væv. Invasive tumorer blev scoret som dem spider gennem og overtage det underliggende væv, i dette tilfælde, oment fedt. (C) Omentums fra vildtype (øverste felt) og LPP1 KO (nederste panel) blev opnået mus 2 uger efter tumorinitiering og farvet for VCAM-1-ekspression under anvendelse IHC (se Materialer og fremgangsmåder). Repræsentative billeder skildrer mesothelium (pile) og positive VCAM-1-farvning (pilespidser) i LPP1 KO mus med manglende VCAM-1 reaktivitet på mesothelium af vilde type mus

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120071 .s001

(TIF)

S2 fig. . Repræsentative billeder af matrigel stikket assayet

Repræsentative billeder af CD31 positive kar (angivet med pile) i Matrigel propper indeholdende konditionerede medier fra ID8ip2Luc celler (A) eller FGF /VEGF (B) er vist

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120071.s002

(TIF)