Abstrakt
multilægemiddelresistens drevet af ABC membrantransportører er en af de vigtigste årsager til behandlingssvigt i human malignitet. Nogle begrænset dokumentation er tidligere blevet rapporteret på cellecyklus afhængighed af ABC transporter udtryk. Det har imidlertid aldrig blevet påvist, at den funktionelle aktivitet af disse transportører korrelerer med cellecyklus position. Her har vi undersøgt hastigheden af iboende ABC transport i forskellige faser af cellecyklus i dyrkede MCF-7 brystcancerceller. Satsen blev karakteriseret i form af efflux kinetik fra celler fyldt med en ABC transportør substrat. Som gennemsnit kinetik over en celle population kunne føre til fejl, vi studerede kinetik ABC transport på enkelt-celle niveau. Vi fandt, at antallet af ABC transport i MCF-7 celler kunne beskrives ved Michaelis-konstanten med to klassiske parametre,
V
max og
K
M. Hver af disse parametre viste lignende unimodale fordelinger med forskellige positioner af maksima for cellesubpopulationer i 2c og 4c stater. Sammenlignet med de 2c celler, 4c celler udviste større
V
max værdier, hvilket indikerer en højere
aktivitet
transport. De udstillede også en større
V
max /
K
M-forhold, hvilket indikerer en højere
effektivitet
transport. Vores resultater tyder på, at cellecyklus-relaterede modulation af MDR kan være nødvendigt at blive taget i betragtning ved udformningen kemoterapi, som omfatter cytostatika
Henvisning:. Koshkin V, Krylov SN (2012) Sammenhæng mellem multi-medikament Resistance- Associated Membrane Transport i Klonale Cancer Cells og Cell Cycle fase. PLoS ONE 7 (7): e41368. doi: 10,1371 /journal.pone.0041368
Redaktør: Henning Ulrich, University of São Paulo, Brasilien
Modtaget: April 12, 2012; Accepteret: 20 Juni 2012; Udgivet: 25 juli, 2012 |
Copyright: © 2012 Koshkin, Krylov. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Kilde finansiering: naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada (https://www.nserc-crsng.gc.ca/), Grant nummer: 238.990-1011. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
et af de store problemer i cancerbehandling er nedsat eller afskaffet tumor respons på kemoterapi, som er forbundet med såkaldt multilægemiddelresistens (MDR)
1, drevet af en superfamilie af ATP-bindende kassette (ABC) plasma membrantransportører [1]. Disse ABC transportører udføre energi-afhængig passiv transport af en lang række fremmedfjendske og endo-biotics fra celler; navnlig lægemidler mod cancer fra kræftceller. Forsøg på at kontrollere MDR i kræftcellerne har hidtil ikke gav klinisk-mærkbare resultater.
Det er tidligere foreslået, at multiresistens er korreleret med en celles position i cellecyklus [2]. Denne korrelation kan være nyttige for nuværende kemoterapi behandlinger der kombinerer både cytotoksiske og cytostatiske midler [3], for at tillade den præferentielle ophobning af tumorceller i en eller anden fase af cellecyklussen. Forståelse af forholdet mellem MDR og cellecyklus er vigtigt at sikre, at cellerne ikke bliver bedt om i en cytotoksin-resistent fase af cellecyklus.
Den nuværende beviser, der forbinder cellecyklusprogression med MDR er fragmentarisk eller ufuldstændige, og præsenteret hovedsagelig af korrelationsdata mellem cellecyklus faser og ekspressionsniveauerne af visse ABC transportører [2], [4], [5]. Udtrykket data kan ikke være afgørende, da MDR kapacitet i kræftceller ikke kun bestemmes ved ekspression af plasma membran transportører af ABC familien, men af en lang række andre faktorer, herunder sammensætningen og fluidik tilstand af plasmamembranen, den tilstedeværelse af relevante cofaktorer, modulatorer, osv således blev fundet almindeligt anvendte vurdering af MDR kapacitet gennem analyse af transporteren udtryk for at være upålidelige i en række tilfælde [6] – [8]. Vores arbejde var motiveret af den indsigt, at de direkte kinetiske målinger af MDR transport kunne tjene som en ultimative indikator for celle kemoresistens. Vores hypotese, at cellerne progression gennem cellecyklussen kan være ledsaget med en graduering i drug efflux kinetik – et nettoresultat på cellecyklus-relateret proteomiske, membran og metaboliske ændringer i cellen. I et forsøg på at afsløre subtile intercellulære sondringer i MDR-aktivitet, vi for nylig udviklet en encellede-kinetik tilgang og vist sin høje følsomhed til påvisning intercellulære variation af transport membran [9]. Her præsenteres en detaljeret undersøgelse af cellecyklus modulation af MDR transport ved hjælp af encellede-kinetik tilgang (fig. 1). Det giver funktionel bevis for celle-cyklus-relaterede modulation af MDR-aktivitet og foreslår, at denne effekt potentielt bør overvejes i udformningen af kombinationen kemoterapi.
Bestemmelse af
V
max og
K
M for celle populationen ved gennemsnitsberegning: (i) encellede
V
max og
K
M (enkelt- celle tilgang) og (ii) encellede rå signaler (befolkning tilgang).
Materialer og metoder
Kemikalier og materialer
MCF-7 celler (human brystcancercellelinje [10], [11]) blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA; ATCC # HTB-22), dyrkes i de anbefalede medier og supplementer ved 37 ° C i en befugtet 5% CO
2 miljø og anvendes inden for en 6-måneders periode. Fluorescerende MDR sonder rhodamin 123, fluorescein, mithoxantrone, samt propidiumiodid (PI), blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Alle andre reagenser blev opnået fra Sigma-Aldrich, Fluka AG Buchs (Schweiz), og BDH Chemicals Ltd. (Poole, England).
Måling af Ophobning og udstrømning af fluorescerende MDR Probes i Cell populationer ved flowcytometri
cellulære indhold af fluorescerende MDR prober blev bestemt ved flowcytometri (BD FACSCanto II flowcytometer, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) i et medium bestående af 140 mM NaCl, 3 mM KCI, 10 mM Na
2HPO
4, 2 mM KH
2PO
4 2 mM CaCl
2, 1 mM MgCl
2, og 10 mM glucose. Efter at være blevet fyldt med proben (1-5 uM, 30-45 min, 37 ° C), celler (ca. 10
6 celler /ml) blev sedimenteret, vasket, resuspenderet i frisk medium (indeholdende 5 pM PI), og undersøgt for intracellulær probe indhold under anvendelse af en standard argon-ion-laser, der udsender ved 488 nm til fluorescens excitation og et 530/30 nm band-pass emission filter til fluorescens detektion af rhodamin 123, calcein, og fluorescein og et 585/42 band pass emission filter til påvisning af PI. Til bedømmelse ophobning af mitoxantron blev prøverne ophidset med en 635-nm rød diodelaser, og et 680/32 nm band pass emission filter blev anvendt til at detektere fluorescens. For den kvantitative kinetiske MDR undersøgelse blev udviklingen af farvestoffet efflux overvåges af flowcytometrisk gentagne prøvetagning af cellesuspensioner på passende tidspunkter.
Måling af MDR Transport i enkelte celler ved Fluorescens Kinetic Microscopy
celler dyrket til 50-60% konfluens blev suppleret med 10 pM glyburid (MDR inhibitor) og fyldt med 5 pM fluorescein i 30 minutter ved 37 ° C. Celler blev derefter vasket fri for ekstracellulær fluorescein og glyburid og anbringes i KRB-buffer. Kinetikken af fluorescein efflux blev overvåget med 5 minutters intervaller under anvendelse af en laser konfokalt fluorescensmikroskop (FluoView FV300, Olympus, Japan), med en argon-ion-laser excitation ved 488 nm, og XF75 Omega filtersæt (Omega Optical, Inc. Brattleboro , VT) efter en fremgangsmåde beskrevet andetsteds [12].
Bestemmelse af Cell levedygtighed og Cell Cycle Position
Efter afslutningen af fluorescein efflux, celler blev lastet med PI (10 uM, 10 min ) for at identificere apoptotiske celler. Cellerne blev derefter behandlet med plasmamembranen-specifikke detergent, saponin (80 pg /ml) og RNAase A (0,02 mg /ml) for at give mulighed for PI interkalering med kerne-DNA. Fluorescens fra PI-behandlede celler var ophidset med en grøn Kr laser og registreres med XF35 Omega filter sæt (Omega Optical, Inc. Brattleboro, VT). Fluorescensintensitet PI blev anvendt til bestemmelse celle position i cellecyklussen [12] – [14]
Kinetic Montering og simuleringsmetoder
Kinetik af MDR transport blev beskrevet af statusrapporter kurver af fluorescein. udstrømning, som blev monteret på integrerede Michaelis-Menten ligningen for en enkelt substrat irreversibel reaktion: hvor [S]
0 og [S] er de første og nuværende substratkoncentrationer henholdsvis [15], [16]. Denne ligning blev også brugt til at bygge befolkningen kinetiske modeller. Montering og modelsimuleringer blev udført med KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) og Origin (Microcal Software, Northampton, MA) software.
Resultater
Generelt Karakterisering af Intrinsic multiresistens i MCF -7 celler
Indledende undersøgelse af den iboende kemoresistens af MCF-7-celler blev udført under anvendelse af flow-cytometriske målinger af MDR substrat akkumulering i celler og dets afhængighed af MDR-inhibitorer. Cellerne blev fyldt med kombinationer af klassisk anvendte fluorescerende substrater (rhodamin- 123, mitoxantron, og fluorescein) og hæmmere (cyclosporin A, verapamil og glyburid) specifikke for forskellige familier af MDR transportører [17], [18]. Disse målinger viste, at kun fluorescein /glyburid pair udviste inhibitor (glyburid) -dependence i den cellulære optagelse af fluorescerende probe (fluorescein) i MCF-7-celler (fig. 2A). Cellernes evne til at udelukke fluorescein (men ikke rhodamin 123 og mitoxanthron) er karakteristisk for transport MRP-typen [17], [19]. Dette er enig med tidlige rapporter om iboende lægemiddel-efflux aktivitet i MCF-7 celler [20] – [22] og i bryst kræft [23]. Således blev kun MRP type transport og regulering yderligere undersøgt i dybden
En
, tilstedeværelse af iboende MDR aktiviteter i MCF-7 celler blev estimeret ved ophobning af:. Rhodamin 123 uden eller med cyclosporin A (- /+ inh) – for MDR familie af transportører; fluorescein uden eller med glyburid – for MRP familie; mithoxantrone uden eller med cyclosporin A – for BCRP familie.
B
, repræsentativ sekvens af flowcytometrisk histogrammer, i løbet af fluorescein efflux, erhvervede 0, 30, 60 og 90 min efter læsningen.
C
, kinetik fluorescein efflux, effekt af glyburid ansøgning (hæmmer af MRP-typen transportører), glucose tilbagetrækning, og anvendelse af ethylester af GSH.
D
, Michaelis passer til forløbet af fluorescein efflux i celle population.
For kinetisk karakterisering af MDR i MCF-7 celle populationer blev cellerne først fyldt med fluorescein i tilstedeværelse af glyburid og fik derefter lov til at ekstrudere det efter fjernelse af ekstracellulært fluorescein og glyburid ved gentagen centrifugering og vaskning. Kinetik af fluorescein efflux blev afledt af middelværdierne for fluorescensintensiteten opnået fra flowcytometri målinger med passende tidsintervaller (fig. 2B, 2C). Alle flowcytometri histogrammer erhvervet i denne undersøgelse, der viste en gradvis udvisning af fluorescein fra MCF-7-celler producerede en unimodal mønster (fig. 2B). Dette antyder, at de observerede fluorescens kinetik hovedsagelig afspejler fluorescein transport i bulk population af celler, der har en ensartet fordeling af MDR aktivitet. På denne måde nogle vigtige aspekter af iboende MDR transport i MCF-7 celler blev etableret som beskrevet nedenfor.
Først, vi bestemt forholdet mellem den observerede totale transmembrane flux af fluorescein og MDR transport. Den stærke glyburid-induceret hæmning af transport, der er vist i fig. 2C viser, at næsten hele fluorescein flux af MCF-7-celler var drevet af MDR pumper (glyburid-inhiberbare transportører), som er blevet fundet i nogle andre celletyper [24], [25] Kinetic spor af fluorescein efflux kunne monteres ved hjælp af den integrerede Michaelis-Menten ligningen (fig. 2D), som er i overensstemmelse med tidligere rapporterede Michaelis adfærd ABC transportører [26], [27]. Således Michaelis kinetiske parametre for fluorescein efflux,
V
max og
V
max /
K
M, kan tjene som en indikator af MDR-aktivitet og effektivitet, hhv.
for det andet, vi betragtede faktorer (andre end transporter og substratkoncentrationer), der var potentielt kan påvirke tidsforløbet af fluorescein efflux. Disse faktorer er: levering af energi (ATP) for aktiv transport og levering af en sandsynlig co-substrat (reduceret glutathion, GSH) for MRP transportører. For at udelukke disse muligheder, vi varierede medium indhold af ATP-producerende glucose og membranen-permeable ethylester af GSH (fig. 2C). Resultaterne indikerede, at disse faktorer ikke begrænsede transporten af fluorescein fra MCF-7-celler under betingelser, der anvendes. Disse kendsgerninger bekræftede yderligere gyldigheden af at bruge de kinetiske parametre for fluorescein efflux i disse celler til at karakterisere MDR aktivitet.
Befolkning vs Single-celle Approach i Kinetic Undersøgelser af unimodal Cell populationer
Kinetik af MDR transport er typisk studerer bruger hele cellepopulationer [25], [28], [29], en tilgang, der anses for at være præcise i fastlæggelse af de vigtigste tendenser i unimodale celle ensembler [30]. Imidlertid havde en nylig arbejde Wong og medforfattere vist, at gennemsnit cellekinetik over cellepopulation kan markant forstyrre reaktion ordre beslutsomhed, når celle-til-celle variation inden for en population er høj (25-160 gange i enzymet aktivitet og /eller substrat-indhold) [31]. For vores system, vi var interesserede i, hvorvidt befolkningen gennemsnitsberegning kunne indføre betydelige fejl i målinger af Michaelis-Menten-parametre ved moderat (2-10 gange) celle-til-celle variation i transporter aktivitet. For at besvare dette spørgsmål, vi indledningsvis udføres kinetiske simulering på cellen befolkning model. Vi overvejede en gruppe af celler med ens
K
M værdier og oprindelige underlag niveauer, men med varierende
V
max (fordelt på en gaussisk måde over en 9-ganges område ) (fig. 3A, tabel 1). Kinetiske spor af substrat ekstrudering for hver celle blev simuleret ved hjælp af integrerede Michaelis-Menten ligningen (fig. 3B). Kinetik af individuelle celler kan behandles på to måder, der er beskrevet nedenfor (se fig. 1).
Simulering af encellede og befolkningsgrupper kinetik en Michaelis-Menten-typen reaktion.
En
, variation af
V
max i en befolkning på 10 individuelle celle celler.
B
, simuleret encellede og gennemsnit population kinetik, simulering udført ved hjælp af den integrerede Michaelis-Menten ligningen:
V
max
t
= ([S]
0 – [S]) +
K
M ln ([S]
0 /([S]
0 – [S]).)
første kan de kinetiske parametre for hver celle udledes af encellede kinetiske spor ved at montere den integrerede Michaelis-Menten ligningen og gennemsnitligt for befolkningen. Disse gennemsnit vil være lig med gennemsnittet af de inputparametre, der anvendes til simuleringerne (tabel 1, række 6). Især gennemsnit
V
max er lig med
V
max værdi af modal celletype (fig. 3A, central bin). Således de midlede kinetiske parametre af befolkningen falder sammen med parametrene for modal celletype, som forventes for gaussiske fordelinger.
andet i stedet for gennemsnit Michaelis-Menten-parametre, kan man i gennemsnit kinetiske spor (fig. 3B). Bemærk, at i et eksperiment, dette sker, når det totale signal fra cellepopulationen er registreret ved fremgangsmåder såsom kinetisk flowcytometri, spektrofluorometri, og hel-field mikroskopi. Fra fig. 3B, kan man se, at midlede population kinetik genereret på denne måde afviger væsentligt fra kinetikken for modal celletype (fig. 3B, jo tykkere spor svarer til cellerne i type 3). Den gennemsnitlige befolkning spor afviger fra den modale befolkning spor, fordi de hurtigste celler har tendens til at sætte farten ned og færdiggøre reaktionen tidligere end de langsomste dem, og jo længere forløber reaktionen mod færdiggørelse, de større bidrag langsomme celler har på de gennemsnitlige befolkningstal kinetik. Derfor gennemsnit population spor genereret på denne måde har en højere krumning end den modale population spor, og føre til en fejlagtig opfattelse af cellulære kinetik. Som et resultat, selv om hvert enkelt celle nøje overholder Michaelis-konstanten, for en 9-fold variation i
V
max, befolkningen-midlet spor passer denne kinetik meget dårligt. For en 3-fold variation, synes Michaelis fitting at være tilfredsstillende visuelt, men producerer en flere gange overvurdering af
V
max og
K
M (tabel 1, række 7).
To andre kinetiske parametre,
K
M og [S]
0, blev udsat for analog variation på encellede niveau, og forårsagede kvalitativt lignende, men kvantitativt mindre overvurdering i deres gennemsnit population niveau værdier (20-50% af det gennemsnitlige parameterværdi ved 3-fold variation, data ikke vist). En sådan forskel kunne være af begrænset betydning i analysen af fast spredte forsøgsdata. Samtidig, en flere gange overvurdering af befolkningen
V
max og
K
M, forårsaget af celle-til-celle
V
max variation, ville skabe en helt forkert billede af processen under studiet.
det skal ne bemærkes, at både befolkningen og single-celle tilgang ville give identiske resultater, hvis cellepopulationen analyseret var helt homogene , hvilket er naturligvis aldrig tilfældet. Befolkningen tilgang altid resulterer i systematiske fejl, når de anvendes til en heterogen celle befolkning og de fejl stiger med stigende heterogenitet. Den encellede tilgang er korrekt ud fra et matematisk statistik og således altid returnerer kinetiske data korrekt beskriver cellepopulationen analyseret uanset hvor heterogen er befolkningen. Således til belysning af mulige kinetiske forskelle mellem celler i forskellige stadier af cellens cyklus, vi anvendt den generelle-celle tilgang.
Modulation af MDR Kinetics i Kursus Celler ‘Progression gennem Cell Cycle
kinetik fluorescein efflux fra enkelte celler blev målt ved hjælp af kvantitativ time-lapse fluorescens konfokal mikroskopi. Kalibrering af cellulær fluorescens blev udført i to trin. Først fluorescens fra intracellulære fluorescein og fluorescein i opløsning, blev sammenlignet. Til dette formål, vi testede emissionen fra suspensionen af fluorescein-loaded celler før og efter cellelysis med 0,1% Triton X-100. Frigivelsen af farvestoffet fra cellerne havde ingen signifikant virkning på dets fluorescens, hvilket viser, at det fluorescerende signal fra intracellulære fluorescein kunne kvantificeres ved anvendelse fluorescein løsninger til kalibrering. For det andet efter hver celle målinger, standardopløsninger af fluorescein blev anbragt i cellen kammeret, og deres signaler blev registreret med de samme optiske indstillinger. Lineær emission-koncentration afhængighed genereret på denne måde (data ikke vist) tilladt os at bestemme absolutte koncentrationer af intracellulær fluorescein (den fokale volumen var mindre end cellens volumen).
Fluorescein efflux blev initieret ved fjernelse af glyburid, som inhiberer membranpumpe, og overvåges indtil tilsyneladende afslutning (fig. 4aa og 4ba). Derefter blev cellerne behandlet med PI at identificere apoptotiske celler for at udelukke dem fra den kvantitative analyse. Endelig ved tilsætning af saponin (som gennemtrænger plasmamembranen) og RNAase (som fjerner interfererende RNA) blev PI lov til at komme alle celler og plette DNA’et (fig. 4AB). Fluorescensintensitet PI blev anvendt til at tildele celler til enten 2c (G1 /G0) fase eller 4c (G2 /M) fase (fig. 4BB), således at kinetikken af farvestof efflux fra enkelte celler, der tilhører den første og anden halvdel af cellecyklussen (før og efter DNA overlapning) kan anslås
Repræsentative fluorescens billeder (Scannestørrelse 100 × 100 um) af fluorescein efflux efterfulgt af PI-farvning (b) i MCF-7 celler, der anvendes til måling af transport kinetik og celle-cyklus progression hhv.
B
, (a) typisk kinetisk spor viser transporten af fluorescein fra en enkelt celle og dens Michaelis-Menten pasform, og (b) celle-cyklus histogram opnået efter afslutningen af fluorescein transport.
C
, frekvens polygoner, der viser karakteristiske fordelinger af
V
max (a), og
V
max /
K
M (b) værdier blandt celler i 2c og 4c tilstande (typiske fordelinger, der repræsenterer 4 uafhængige cellepopulationer er vist). Pile viser middelværdier og modal positioner i distributioner af MDR-parametre (tykke og tynde pile svarer til 2c og 4c celler, henholdsvis).
D
, 4c /2c forhold mellem middelværdier af
V
max, og
V
max /
K
M opnået ved parallel anvendelse af enkelt celle- (tomme søjler) og befolkningsbaserede (fyldte søjler) -orienteret analyse til MDR kinetik i 2c og 4c subpopulationer, der repræsenterer 4 uafhængige cellepræparater.
fluorescein efflux fra størstedelen af de enlige MCF-7-celler var i overensstemmelse med Michaelis-konstanten, med undtagelse af ca.. 5% af celler, der havde udvist PI farvning før gennemtrængning og /eller unormale efflux kinetik; disse celler blev udelukket fra analysen. Figur 4C viser, at celle-cyklus overgang fra den 2c fase til den 4c fase blev ledsaget med et skift i MDR-aktivitet (karakteriseret ved
V
max) og effektivitet (karakteriseret ved
V
max /
K
M) fordelinger mod de højere klasser. Følgelig er de 4N celler viste forhøjede middelværdier af
V
max og
V
max /
K
M (øverste pile i fig . 4C frekvens polygoner, og statistisk oversigt i fig. 4D). Denne forskel var endnu større i form af modale niveauer af MDR i 4c og 2c subpopulationer (lavere pile i fig. 4C frekvens polygoner). De modale værdier af MDR aktivitet præger den mest rigelige celletype i befolkningen og ofte bestemmer tumor adfærd [32]. Her har vi ikke betragte den sandsynlige tilstedeværelse af en side befolkning med forhøjet MDR-aktivitet (
V
max), som kunne udøve kun en mindre bidrag til den samlede fordeling af MDR aktivitet i hele befolkningen.
for at sammenligne opløsningsevne af befolkningen og encellede kinetik tilgange, vi foretaget en parallel analyse af de samme rådata ved anvendelse af begge metoder. Figur 4D viser MDR kinetiske parametre i 4c og 2c stater, bestemt med de to tilgange. Den encellede afledt 4c /2c forhold for
V
max og
V
max /
K
M var højere end dem, der opnås fra befolkningen gennemsnitsperioder beregninger, og kun enkelt-celle værdier var signifikant forskellige fra enhed, hvilket tyder på en højere opløsningsevne for enkelt-celle tilgang.
diskussion
de mange narkotikarelaterede udvalgte resistente celletyper meget udbredt i MDR undersøgelser tendens til at erhverve en større-end fysiologiske niveau af resistens, og vil sandsynligvis blive reguleret i variable mode [33], hvilket gør deres relevans for MDR fungerer in vivo bredt debatteret [34], [35]. Derfor, i dette arbejde, undersøgte vi den fysiologisk forekommende indre multilægemiddelresistens, som bestemmer lægemiddelselektion og resultat for den første runde af kemoterapi.
De fleste cellulære processer moduleres af cellens progression gennem cellecyklussen [ ,,,0],36], og man kan forvente, at den iboende aktivitet af MDR transport i cancerceller er ikke en undtagelse. Kun få studier, hvor dette spørgsmål blev behandlet, fandt udtryk for specifikke ABC transportører i forskellige faser af cellecyklus [2], [4], [5]. Samtidig blev det bemærket, at udbredte målinger af MDR-genekspression i tumorprøver var ikke altid klinisk effektiv, fordi de ikke nødvendigvis give oplysninger om den funktionelle aktivitet af lægemiddel efflukspumper [6], [37]. Kontroversielle kliniske resultater på sammenhængen mellem kemoresistens og ekspression af ABC transportører [38], [39] sandsynligvis vil afspejle bidrag andre faktorer end transportør udtryk ved fastsættelsen MDR-aktivitet. Især er progressionen af celler gennem cellecyklussen ledsaget af ændringer i mange parametre (cellulær energitilstand, fysiske tilstand af plasmamembranen, og niveauer af cofaktorer), kan der potentielt påvirke de kinetiske parametre af MDR transportører. Vi antog, at intensiteten af narkotika efflux er den mest relevante indikator for en celler kemoresistens kapacitet og afspejler både MDR pumpe udtryk og molekylær katalytisk aktivitet i deres helhed. Den detekterede her MDR transport af MRP-typen kun i MCF-7 celler er enig med iboende udtryk for MRP1 proteiner og en mangel på MDR1 proteiner tidligere rapporteret (24).
Et par funktionelt orienterede undersøgelser blev tidligere udført, at havde ansat en indirekte, semikvantitativ vurdering af MDR effektivitet og foreslog aktiveringen af MDR transport i S og G2 /M faser i leukæmiceller [40]. Her anvendte vi en streng kvantitativ metode til at studere cellecyklus-relaterede MDR modulation.
I det sidste årti, en neoadjuverende terapeutisk tilgang, der sigter mod en reduktion i tumor masse for at lette yderligere behandling, er at finde stigende anvendelse. I lyset af denne tilgang, at kemoresistens af de vigtigste population af tumorceller sammen med, at de tumor-initierende celler, er af afgørende betydning. , I dette arbejde, vi studerede således hele befolkningen i MCF-7 celler.
Anvendelsen af enkelt-celle tilgang til 2c og 4c subpopulationer af klonal bryst kræftceller afslørede en stigning i de gennemsnitlige værdier for både MDR-aktivitet og effektivitet i 4N celler; dette giver den første kvantitative kinetiske beviser for ændringer i MDR transport under cellecyklusfremadskriden. MDR-aktivering i 4N celler var endnu mere udtalt, når kendetegnet ved modal (i stedet for middelværdien) værdier af MDR parametre inden subpopulationer (fig. 4C). Karakteriseringen af MDR i den mest rigelige celletype i en tumor ville være vigtige i prognosen af tumoren umiddelbare respons på kemoterapi, som spiller basal rolle i neoadjuverende terapeutisk fremgangsmåde. Undersøgelse af stammen-lignende subpopulation af kræftceller vil være forpligtet til at forstå, hvis det kan forventes stigningen i langvarig effektivitet celle-cyklus selektiv kemoterapi.
Fordelene ved den encellede kinetik tilgang til undersøgelser de unimodale cellepopulationer, der anvendes i vore forsøg, blev testet ved at sammenligne resultaterne fra encellede og population (fig. 1) analyser af de samme datasæt (fig. 4D). Befolkningen kinetiske parametre (
V
max og
V
max /
K
M) opnået ved de encellede tilgang voksede betydeligt på cellernes overgang fra 2c til 4c tilstand. Samtidig, disse parametre opnået fra befolkningen tilgang forblev næsten uændret på en sådan overgang.
De fleste tumorer menes at stamme fra en enkelt celle, men flere kloner typisk vælges under tumorigenese og opfattes på fremskredne stadier . Derfor er reelle tumorvæv forventes at være mere heterogen end en enkelt dyrket klon. Som følge heraf befolkningen tilgang, som giver fejl for et enkelt dyrket klon, vil føre til endnu større fejl for rigtige tumorer. Følgelig vil fordelen ved at bruge enkelt-celle tilgang være endnu større, hvis virkelige tumorvæv analyseres.
Når encellede fremgangsmåde anvendes til reelle tumorvæv, den analyserede cellepopulation kan omfatte celler fra forskellige kloner. Mens den encellede tilgang vil korrekt bestemme kinetiske parametre, der beskriver den analyserede population, bør fortolkningen af resultaterne altid gøres omhyggeligt. For eksempel, hvis den encellede tilgang afslører, at MDR efflux korrelerer med cellecyklussen for en blanding af kloner, kan vi konkludere med stor sikkerhed, at alle kloner opfører sig på samme måde i forhold til MDR efflux. Men hvis ingen korrelation er fundet, to fortolkninger er mulige: (i) MDR ikke korreleret med cellecyklussen eller (ii) MDR korrelerer forskelligt for forskellige kloner og de forskellige korrelationer udligner hinanden, når en blanding af kloner trækkes sammen. For at finde det rigtige svar, ville man nødt til at foretage omfattende supplerende undersøgelser på MDR kinetik i de enkelte kloner. Vi mener, at sammenligne forskellige dyrkede kloner bør være det næste skridt i et forsøg på at finde ud af, om forskellige kloner i samme tumor varierer med hensyn til MDR-cellecyklus korrelation. Mens være meget besværlig med en almindelig mikroskop, kunne en sådan undersøgelse være absolut muligt, hvis der anvendes en automatiseret billede cytometri.
eksperimentelt fundet bred variation af Michaelis-Menten parametre i enkelte celler er i overensstemmelse med et par rapporter hvori encellede Michaelis parametre blev behandlet [41]. En af årsagerne til denne variation kunne være, at der findes to former af transportøren, med hver har unikke egenskaber [42], [43].
Det blev vist, at mange celletyper arresteret i cellecyklus [ ,,,0],44], herunder de anholdte i G2 fase [3], [45], kan påvise en forhøjet resistens mod kræftbehandling som normalt forklares ved modulering af apoptotiske og mitotiske mekanismer. Begrebet cellecyklus-medieret lægemiddelresistens afledt af disse undersøgelser har til formål at forstå og optimere cellecyklus-baserede lægemiddelinteraktioner [3]. Vores data tyder på, at variationen i multidrug transport aktivitet kraftigt kan bidrage til den celle-cyklus-relaterede modulering af kemoresistens.
Potentiel oversættelse af vores eksperimentelle tilgang til klinisk praksis vil kræve yderligere omfattende arbejde, navnlig studerer relationer mellem bestemte ABC transportvirksomheder og cytostatika. Da man kan forvente, at heterogenitet tumorvæv er højere end for cellelinjer, ville den encellede tilgang være særligt gavnligt i dette tilfælde.
tilstedeværelse og aktivitet af MDR transportører i kliniske prøver anses for at være en værdifuld prognostisk indikator for mange former for cancer [8], [46].
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.