Abstrakt
En passende arginin i vævet mikromiljø er essentielt for T-celle aktivitet og overlevelse . Arginin niveauer er reguleret af arginin-catabolizing enzym, arginase (ARG). Det er blevet rapporteret, at arginase II (ARG2), en af to arqS, udtrykkes afvigende i prostatacancerceller, som konverterer arginin til ornithin, hvilket resulterer i en mangel på arginin, der svækker tumorinfiltrerende lymfocytter og gør dem dysfunktionel. Imidlertid har immunsuppression medieret af arg2-udtrykkende cancerceller i lungekræft ikke observeret. Her studerede vi udtryk for ARG2 i bugspytkirtlen duktalt carcinom (PDC) væv clinicopathologically ved at undersøge over 200 tilfælde af PDC. I modsætning til prostatacancer, blev ARG2 ekspression sjældent demonstreret i PDC celler ved immunhistokemi, og i stedet ARG2 blev karakteristisk udtryk i a-glat muskel-actin-positive cancerassocierede fibroblaster (cafeer), især dem, der findes i og omkring nekrotiske områder i PDC. Tilstedeværelsen af arg2-udtrykkende CAF var tæt korreleret med kortere samlet overlevelse (OS;
P
= 0,003) og sygdomsfri overlevelse (DFS;
P
= 0,0006). Multivariat Cox regressionsanalyse viste, at tilstedeværelsen af ARG2-udtrykkende CAF i PDC væv var en uafhængig prædiktor for ringere OS (hazard ratio [HR] = 1,582,
P
= 0,007) og DFS (HR = 1,715,
P
= 0,001) i PDC patienter. Ud over den karakteristiske fordeling af arg2-udtrykkende CAF, sådanne CAF co-udtrykkes carbonanhydrase IX, SLC2A1, eller HIF-1a, markører af hypoxi, i PDC væv. Desuden
in vitro
eksperimenter afslørede, at dyrkede fibroblaster udvundet fra PDC væv udtrykte ARG2 udskrift efter eksponering for hypoxi, som havde arginase aktivitet. Disse resultater viser, at kræft cellemedieret immunundertrykkelse gennem ARG2 ekspression er ikke en generel begivenhed og at tilstedeværelsen af ARG2-udtrykkende CAF er en indikator for dårlig prognose, samt hypoksi, i PDC væv.
Henvisning : Ino Y, Yamazaki-Itoh R, Oguro S, Shimada K, Kosuge T, Zavada J, et al. (2013) Arginase II Udtrykt i Cancer-associerede fibroblaster Indikerer vævshypoksi og forudser dårligt resultat i patienter med kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 8 (2): e55146. doi: 10,1371 /journal.pone.0055146
Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland
Modtaget 11. april 2012; Accepteret: December 19, 2012; Publiceret: 12 feb 2013
Copyright: © 2013 Ino et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en Grant-in-Aid for tredje periode Omfattende 10-årig strategi for Cancer Kontrol fra Sundhedsministeriet, Labor og dyrevelfærd Japan (NH), en Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning fra Undervisningsministeriet, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan (NH), Prinsesse Takamatsu Foundation (10-24.216) (NH), og Cancer Research and Development Fund (NH). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
tumormikromiljøet spiller vigtige roller i den biologiske opførsel af enhver tumor, som omfatter værtens immunrespons, væv oxygenspænding, og cancerassocierede fibroblaster (CAF) [1].
tilstrækkelig niveauer af arginin i det ekstracellulære miljø er afgørende for T-celleproliferation og aktivitet. [2], [3] Arginin er en af de semi-essentielle aminosyrer og arginin niveauer reguleres af arginase (ARG), [4], som hydrolyserer arginin til ornithin og urinstof. Der er to isozymer af ARG, ARG1 og ARG2. ARG1, et cytoplasmatisk enzym, der primært udtrykkes i leveren og detoxifies ammoniak. ARG2 udtrykkes som et mitokondrie-protein i forskellige væv, såsom nyre, prostata, og tyndtarmen. Arginin fungerer også som et substrat for nitrogenoxidsyntase (NOS), hvilket gav nitrogenoxid (NO) og andre reaktive kvælstof mellemprodukter.
Det er blevet rapporteret, at ARG2 aberrant udtrykkes i prostatacancerceller, være involveret i tumor immune escape medieret af arginin forbrug, hvilket resulterer i en mangel på arginin, der svækker tumorinfiltrerende lymfocytter og gør dem dysfunktionel. [5] Prostatacancer samtidigt udtrykker NOS2, hvilket reducerer arginin gradvis og danner peroxynitrit, der udløser T-celle apoptose ved at inhibere signal transduktion nødvendig for cellulær aktivering. [5] Men disse immunosuppressive virkninger gennem ARG2 ekspression i cancerceller var ikke tydelig i den næste lungecancer undersøgelse. Mere end 80% (99/120 tilfælde) af lungekræft udtrykt ARG2 til variable grader, selv om ekspressionen af ARG2 havde ingen virkning på klinisk-patologiske karakteristika, herunder værtens tumor immunrespons. [6] Nu er det kontroversielt, virkningen af ARG2 på de kliniske funktioner i menneskelige kræftformer.
Bugspytkirtelkræft [bugspytkirtlen duktalt carcinom (PDC)] er den fjerde og femte hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA og Japan, hhv. [7], [8] Den samlede 5-års overlevelse for patienter med kræft i bugspytkirtlen er 3-5%, [7], [9], [10], [11] med henblik på sin aggressive vækst og tidlig metastatisk spredning . Den dødelighed grundet denne kræftform har vist nogen indlysende forbedring i årtier. Udviklingen af prædiktive biomarkører til at hjælpe udvælgelse af patient delmængder er nyttig for undersøgelser med henblik på at reducere dødeligheden af PDC patienter, især i fase kliniske studier designet til at evaluere forskellige terapeutiske tilgange [12].
I den foreliggende undersøgelse, vi undersøgte udtryk og klinisk-patologisk betydning ARG2 i PDC. Vi fandt, at kun få PDC celler udtrykte ARG2, men bemærket, at ARG2 blev udtrykt i visse stromale celler til stede i PDC væv. Vi fandt også, at tilstedeværelsen af ARG2-udtrykkende stromaceller i PDC væv var en clinicopathologically signifikant variabel, er forbundet med et dårligere resultat, samt en indikator for hypoxi.
Resultater Salg
ARG2 ekspression er sjældne i PDC Celler, men karakteristisk udtrykt i tenformede stromacellers i og omkring nekrotiske områder i PDC Tissue
Immunohistokemisk analyse afslørede, at ARG2 ekspression var til stede i et lille antal PDC tilfælde, hvor det blev udtrykt fokalt i PDC celler. I modsætning hertil blev ARG2 udtrykt i tenformede stromaceller i og omkring nekrotiske områder (figur 1A). ARG2 blev farvet med en prik-lignende eller grovkornet mønster i cytoplasmaet af spindlen celler, som er forenelige med det faktum, at ARG2 er lokaliseret i mitokondrier (figur 1B). ARG2 blev også udtrykt i Langerhans islet celler og ganglion celler i bugspytkirtlen væv under ikke-patologiske tilstande. Ekspression af ARG1 blev opdaget kun i cytoplasmaet af neutrofiler ved immunhistokemi, og ikke i cancerceller (Figur 1C).
(A) Histologi af PDC væv i lav (øverste søjler) og high-power visning ( lavere søjler). HE farvning (venstre søjler) og immunhistokemi for ARG2 (center kolonner) og cytokeratiner (højre søjler) i vævssnit serielle. Nekrotiske områder er omgivet af stjerne-mærkerne (stort område af nekrose er placeret nederst til højre) i den øvre HE billedet og rektanglet (lyseblå) svarer til det område af den nedre søjle. (B) Immunhistokemi for ARG2 (øverste venstre kolonne) og for mitochondrier (venstre nederste kolonne) i high-power synspunkter. Positiv farvning af ARG2 visualiseres som en prik-lignende eller grovkornet mønster i cytoplasmaet i spindel celler. Denne positive farvningsmønster var forenelig med mitokondrie antigen. Dobbelt immunfluorescens (højre kolonne) viser ARG2 (grøn), mitochondrier (rød), og kerner (hvid). Næsten alle ARG2-positiv farvning er co-lokaliseret med mitokondrier (gul). (C) immunhistokemisk udtryk for ARG1 blev kun observeret i neutrofiler. Øvre og nedre kolonner er mellem- og high-power synspunkter henholdsvis.
Prognostisk Betydningen af ARG2 Expression i stromacellers
Survival analyse viste en sammenhæng mellem tilstedeværelsen af ARG2 udtrykker stromale celler og kortere operativsystem (
P
= 0,003) og DFS (
P
= 0,0006) (Figur 2), selv om fandtes ingen sammenhæng mellem tilstedeværelsen af ARG2-udtrykkende cancerceller og enhver patientoverlevelse parameter. Når det gennemsnitlige antal positive celler var nul, 1 til 80, og mere end 80, farvningsresultaterne kvaliteter tildelt var nul (fravær), en (lavere ekspression), og 2 (højere ekspression), hhv. Som ARG2 ekspression øges, overlevelse blev væsentligt kortere med hensyn til både OS og DFS (figur 2). Salg
(A, C) Kaplan-Meier overlevelse kurve der viser en sammenligning af den samlede overlevelse mellem tilstedeværelse (grad 1 og 2) og fravær (grad 0) af ARG2 udtryk i stromale celler (
P
= 0,003) i A og at blandt udtryk kvaliteter (kvaliteter 0 til 2) af ARG2 i stromale celler (grad 0 vs. klasse 1 , log-rank test,
P
= 2,08; grad 0 vs. klasse 2,
P
0,0001; grad 1 vs. klasse 2,
P
= 0,0009 ) i C. (B, D) Kaplan-Meier overlevelse kurve, der viser en sammenligning af sygdomsfri overlevelse mellem tilstedeværelse (grad 1 og 2) og fravær (grad 0) af ARG2 ekspression i stromaceller (
P
= 0,0006) i B og at blandt udtryk kvaliteter (kvaliteter 0 til 2) af ARG2 i stromale celler (grad 0 vs. lønklasse 1,
P
= 0,069; grad 0 vs. klasse 2,
P
0,0001; grad 1 vs. klasse 2,
P
= 0,013) i D. Sort cirkel og hvid cirkel repræsenterer censurere og fiasko, henholdsvis
. gennemsnitlige overlevelse af patienter med PDC med eller uden arg2-udtrykkende stromaceller var 22.71 ± 1,77 måneder og 37.13 ± 2,41 måneder hhv. Et års overlevelsesrater for patienter med PDC med eller uden arg2 udtrykker stromaceller var 66,9 ± 5,2% og 78,7 ± 3,7%, henholdsvis; de 2-årige overlevelsesrater var 36,1 ± 5,4% og 51,6 ± 4,6%, og 5-årige overlevelsesrater 17,1 ± 4,4% og 34,5 ± 4,5%, henholdsvis.
Multivariat Cox regressionsanalyse herunder tumorstørrelse, node status, metastaser status, tumor histologisk klasse, status margin, nerve plexus invasion, lymfe invasion, venøs invasion, intrapankreatiske neural invasion, og udtryk for ARG2 i stromale celler viste, at ekspressionen af ARG2 i stromale celler, metastatisk status, lymfe invasion, og venøs invasion var uafhængige prædiktorer for OS (tabel 1), og at ekspression af ARG2 i stromaceller, metastatisk status, nerve plexus invasion, og venøs invasion var uafhængige prædiktorer for DFS (tabel 2). Når ekspressionen af ARG2 i stromale celler kategoriseret i nej og lavere udtryk versus højere udtryk (se Materialer og metoder), univariat analyse af OS og DFS viste (
P
0,0001; hazard ratio [HR] = 2,505; 95% konfidensinterval [CI], 1,649-3,804) og (
P
0,0001; HR = 2,519; 95% CI, 1,658-3,827), hhv. Multivariat analyse af OS og DFS viste (
P
0,0001; HR = 2,687; 95% CI, 1,759-4,103) og (
P
0,0001; HR = 2,451; 95% CI, 1,608-3,736), hhv.
sammenhæng mellem tilstedeværelse af ARG2 udtrykker stromacellers og andre klinisk-patologisk variabler
tabel 3 viser de klinisk-patologiske træk af patienter med PDC. Når disse funktioner blev analyseret for korrelationer blev tilstedeværelsen af arg2-udtrykkende stromaceller sig at være mere sandsynlig i tilfælde med dårligere tumor differentiering af histologisk kvalitet, tilstedeværelse af nekrose, og tilstedeværelsen af stromale celler, der udtrykker Caïx og SLC2A1 (alternativt kendt som glucose transporter type 1, GLUT1), som er markører for hypoxi. Desuden blev tilstedeværelsen af arg2-udtrykkende stromaceller tæt korreleret med højere tumorinfiltrerende CD68
+ makrofager og CD66b
+ neutrofiler og lavere tumor-infiltrerende CD4
+ T-celler og CD8
+ T-celler. Ingen signifikant korrelation blev fundet mellem forekomsten af ARG2-udtrykkende cancerceller og et af disse klinisk-patologiske parametre.
Størstedelen af ARG2-udtrykkende Stromaceller cancerassocierede fibroblaster (CAF) i en Hypoxic State
for at afgøre, hvilken slags stromale celler udtrykte ARG2, vi udførte dobbelt immunhistokemi og tredobbelt immunofluorescens. Arg2-udtrykkende spindel celler var ofte positive for α-SMA, vimentin, og kollagen type I, sjældent positive for CD31 og CD68 (data ikke vist), og negativt for desmin, cytokeratiner, og D2-40 (figur 3), hvilket indikerer, at størstedelen af arg2-udtrykkende stromaceller var CAF og et mindretal var endotelceller eller makrofager. Men de fleste af CAF i PDC væv ikke udtrykke ARG2, med undtagelse af dem til stede i og omkring nekrotisk og myxoid degenerative områder. Overraskende ARG2 blev tilsyneladende ikke til udtryk i det stromale eller epitelceller omgivende nekrotisk væv eller myxoid degenerative områder i intraduktal papillære-mucinøs neoplasmer i bugspytkirtlen og nekrotisk væv i mavesår (data ikke vist).
(A) Triple immunfluorescens viser at det meste af dot-lignende farvning af ARG2 (rød) til stede i a-SMA-positive fibroblaster (grøn). Kræftceller er positive for cytokeratiner (blå). Kerner farves ved DAPI (hvid). (B) Histologi og immunhistokemi af PDC væv i lav- (øverste foto af hvert par af billeder) og high-power visning (nederste foto af hvert par af billeder). HE farvning og immunhistokemi i flere antigener i vævssnit serielle. Nekrotiske områder er omgivet af Star-symbolerne i den energibesparende HE foto og rektangel (lyseblå) svarer til det område af high-power visning.
Siden arg2-udtrykkende CAF var til stede inden for og omkring nekrotiske områder, vi næste undersøgt sammenhængen mellem ARG2 udtryk og hypoxi i kræftvæv ved hjælp dobbelt immunfarvning. Ekspression af Caïx, SLC2A1, eller HIF-1α blev observeret i CAF omkring områder med nekrose. ARG2 ekspression blev fundet i disse CAIX-, SLC2A1- eller HIF-1a-udtrykkende CAF selv, eller i CAF placeret ved siden CAIX-, SLC2A1- eller HIF-1a-udtrykkende celler (figur 4). ARG2 ekspression i cancerceller blev ikke begrænset til områder omkring nekrose eller i nærheden CAIX-, SLC2A1- eller HIF-1α-udtrykkende celler (data ikke vist). Disse resultater antydede, at ekspressionen af ARG2 blev induceret i CAF under hypoxiske betingelser, og at der ikke var nogen tydelig sammenhæng mellem hypoxi og ekspression af ARG2 i kræftceller.
Histologi af PDC væv i lav- (øvre kolonner) og high-power visning (lavere søjler). HE farvning og immunhistokemi for ARG2, Caïx, og SLC2A1 i vævssnit serielle. Nekrotiske områder er omgivet af Star-symbolerne i den øvre HE billedet og rektanglet (lyseblå) svarer til det område af den nedre søjle. Dobbelt immunfarvning (yderst til højre kolonner) afslører, at de fleste af den granulære ARG2 farvning (brun) er til stede i spindelformede celler farvet for Caïx (lilla). Indsat er en meget høj effekt visning.
Hypoxi inducerer ekspression af ARG2 i CAF udvundet fra PDC Væv
For at bekræfte, hvis udtryk for
ARG2
gen er induceret af hypoxi i CAF, vi udført
in vitro
eksperimenter under anvendelse af CAF udvundet fra PDC væv. Induktion af
ARG2
genekspression ved hypoxisk stress blev fundet i CAF på både transkriptions- og proteinniveauer, og den inducerede ARG2 havde arginase aktivitet (figur 5A-C). Ekspression af ARG2 fortsatte under hypoxiske betingelser, og induktion af ARG2 ved hypoxisk stress var reversibel. Re-iltning faldt opreguleret udtryk for
ARG2
gen til et niveau, der kan sammenlignes med i CAF dyrket under normoxiske betingelser (figur 5A). Hypoxisk stress induceret akkumulering af HIF-1α i CAF (figur 5D). Ifølge genet databasen, den 5′-flankerende region af det første exon af ARG2 genet har potentielle bindingssteder for HIF-1 (5′-RCGTG-3 ‘) [13]: ACGTG på -425 til -421 og GCGTG på -234 til -230. Disse resultater tyder på, at ekspressionen af ARG2 induceres via HIF-1 signalvejen.
(A) Relativ genekspression måles ved real-time RT-PCR i fibroblaster udvundet fra PDC væv efter 48 timers eksponering for hypoxi (hypoxi) eller kultur under normoxiske kontrol betingelser (normoksi). Ekspression af generne i fibroblasterne efter 48 timers kultur under hypoxiske betingelser efterfulgt af 48 timers kultur under normoxiske betingelser (Re-oxygenering) blev også analyseret. Hver søjle data repræsenterer middelværdien relative udtryk standardiseret med 18SrRNA ± SE for tredobbelte bestemmelser.
SLC2A1
(alternativt kendt som glucose transportør type 1 eller GLUT1) gen er hypoxi-inducerbare. Betydning værdi (Students
t
test) af
P
0,01 (*). Nogle gener udtrykkes i CAF på et ekstremt lavere niveau end i et normalt væv, der er den største væv udtrykke genet. I sådanne tilfælde er sammenligning af genekspression er vist i indsatsene med 1/50 til 1/10000 skalaer. (B) Western blot-analyse (øvre kolonne) afslører, at ARG2 proteinekspression induceres i CAF anvendt i (A) ved udsættelse for hypoxi. N og H angiver cellerne dyrket under normoxiske og hypoxiske betingelser, henholdsvis. ARG2 protein induceret i CAF har arginase aktivitet (lavere kolonne). En enhed af arginase omdanner 1 pmol af L-arginin til ornithin og urinstof per minut ved pH 9,5 og 37 ° C. Hver søjle data repræsenterer den gennemsnitlige aktivitet ± SE for tredobbelte bestemmelser. Betydning værdi (Students
t
test) af
P
0,05 (*) og
P
0,01 (**). (C) ekspression af gener i CAF fra PDC væv under dyrkning under hypoxiske betingelser detekteret af real-time RT-PCR. Data repræsenterer en af tre uafhængige forsøg. Betydning værdi (Students
t
test) af
P
0,01 (*) og
P
0,001 (**). (D) Western blot-analyse af HIF-1α protein. Ophobning af HIF-1α protein er observeret i CAF efter 6 timers eksponering for hypoxiske betingelser. N og H angiver celler dyrket under normoxiske og hypoxiske betingelser, henholdsvis.
Angivelse af
ARG1
,
NOS1, NOS2
, og
NOS3
gener blev ikke signifikant induceret af hypoxia (figur 5A). Angivelse af
ARG1
NOS3
gener syntes at være fremkaldt af hypoxi, selv om deres niveauer af ekspression var meget lave, næsten 1/1000 til 1/10000 af dem i et normalt væv, som er en af de største væv, der udtrykker genet. Da alle disse gener koder enzymmolekyler, er det usandsynligt, at sådanne små mængder af inducerede transkripter ville være biologisk vigtige. Det er snarere overvejet, at små mængder af kontaminerende celler, såsom endotelceller kunne have reageret på de hypoxiske betingelser. Peroxynitrit er en reaktiv nitrogen mellemprodukt produceret, når både NOS og ARG er til stede. Da disse celler ikke udtrykte nitrotyrosin undersøgt ved immunhistokemi (data ikke vist), som genereres af nitrering af tyrosinrester af peroxynitrit,
NOS2
ekspression blev ikke induceret i CAF i og omkring nekrotiske områder i PDC væv. Disse resultater tyder på, at
NOS2
ikke induceret i
ARG2
udtrykkende CAF.
arg2-udtrykkende CAF potentielt påvirke den immunreaktion
Den normale fysiologiske koncentrationen af L-arginin i serum er omkring 100 um (50-150 uM). Vi bestemt, at 12-15 uM L-arginin ville være påkrævet for T-celle proliferation induceret af T-celle receptor stimulation under de eksperimentelle betingelser, vi beskæftigede (figur 6A og 6B). Dernæst forsøgte vi at undersøge, om ARG2 induceret af eksponering for hypoxi påvirker proliferation af T-celler
in vitro
. I modsætning til forventningen, det konditionerede medium, der var blevet anvendt til dyrkning af CAF under hypoxiske betingelser ikke undertrykke T-celleproliferation betydeligt i forhold til medium, der var blevet anvendt til dyrkning af CAF under normoxiske betingelser (Figur 6A og B). Forskellen af resultaterne til vores resultater af induktion af ARG2 protein med en vis enzymatisk aktivitet i CAF ved hypoxisk eksponering kan skyldes udskillelsen af ubestemte molekyler, der kan understøtte T-celle proliferation fra CAF.
( A) T-celle-proliferationsassay. CFSE-mærket CD3
+ T-celler blev stimuleret med anti-CD3 /CD28 antistof-konjugerede perler i frisk medium suppleret med indikator- L-arginin (kontrol) eller i konditioneret medium efter dyrkning af CAF under normoxiske betingelser (normoxi) eller hypoxiske betingelser (hypoxi) i mediet med indikator- L-arginin (herunder 2,0 uM arginin af serum indhold) i fire dage, og deres spredning profiler blev analyseret ved flowcytometri. Ikke-prolifererede celler viste den højeste fluorescensintensitet og intensiteten af de mærkede T-celler blev halveret med hver celledeling. Tallene repræsenterer forholdet mellem antal celler, der har gennemgået flere afdelinger i forhold til det oprindelige antal celler. Data repræsenterer en af seks uafhængige forsøg. (B) Procent af celler, der har undergået celledelinger. Data repræsenterer en af seks uafhængige forsøg. (C, D) Sammenligning af absolutte antal tumor-infiltrerende CD3
+ T-celler (C) med deres prolifererende indeks (andelen af Ki-67-positive prolifererende celler blandt CD3
+ T-celler) (D ) mellem området omkring ARG2-udtrykkende CAF (hvid) og området i tumoren bortset nekrotisk væv (plettet). Vi tælles tumor-infiltrerende CD3
+ T-celler og deres Ki-67 positivitet i hver tyve forskellige high-power felter pr områdets kategorier ved to PDC sager. Hver søjle data repræsenterer middelværdien ± SE for tredobbelte bestemmelser. Betydning værdi (Students
t
test) af
P
0,05 (*) og
P
. 0,001 (**)
for at afgøre, om CD3
+ T-celler breder omkring arg2-udtrykkende CAF i PDC væv, vi udførte dobbelt immunhistokemi for CD3 og Ki-67 og sammenlignet tumorinfiltrerende CD3
+ T-celler med deres prolifererende indeks i området omkring arg2-udtrykkende CAF til området i tumoren bortset nekrotisk væv. Det var overrasket over, at der var få CD3
+ T-celler rundt arg2 udtrykker CAF. Både den absolutte antal tumor-infiltrerende CD3
+ T-celler (figur 6C), og andelen af Ki-67-positive prolifererende celler blandt CD3
+ T-celler (figur 6D) observeret i området omkring ARG2- udtrykker CAF var betydeligt lavere end dem, der observeres i det andet område. Disse resultater tyder på, at adaptive immunrespons undertrykkes i områder omkring arg2 udtrykker CAF.
Den direkte virkning af ARG2 induceret af eksponering for hypoxi i CAF mod kræftceller blev undersøgt ved hjælp af en
in vitro
system, hvor CAF udvundet fra PDC væv blev co-dyrket med kræft i bugspytkirtlen MiaPaCa-2 celler. Spredningen af kræftceller blev ikke signifikant påvirket af ARG2 induceret af hypoxi (figur 7A), og oxidativ stress-induceret apoptose af cancerceller, men CAF selv var ikke forhindret af polyamin produceret af ARG2 som respons på hypoxi (Figur 7C).
(A) ARG2-udtrykkende CAF understøtter ikke proliferation af bugspytkirtelkræftceller. CAF udvundet fra PDC væv og MiaPaCa-2 celler blev co-dyrket i medium med eller uden 2 mM DFMO under normoxisk eller hypoxiske betingelser for 48 timer, og antallet af levende celler blev beregnet ud fra data opnået ved flowcytometri. Det absolutte antal MiaPaCa-2-celler dyrket under hypoxiske betingelser faldt betydeligt i sammenligning med normoxiske betingelser, selv om denne effekt ikke blev signifikant påvirket af tilstedeværelsen af DFMO i dyrkningsmediet. Data repræsenterer en af tre uafhængige forsøg. Betydning værdi (Students
t
test) af
P
0,05 (*) og
P
0,01 (**). (B) Oxidativ stress-induceret apoptose blev induceret i MiaPaCa-2-celler ved udsættelse for forskellige koncentrationer (0-500 uM) i H
2O
2 i 7 timer. De døde celler og levende celler blev detekteret ved flowcytometri efter farvning med Annexin V og PI. (C) arg2-udtrykkende CAF ikke beskyttede bugspytkirtelkræftceller fra oxidativ-induceret apoptose. Efter 48 timers samdyrkning af CAF ekstraheret fra PDC væv og MiaPaCa-2-celler i medium med eller uden 2 mM DFMO under normoxiske eller hypoxiske betingelser, alle cellerne blev dyrket i yderligere 4 timer under oxidativt stress (50 uM H
2O
2) ved hjælp af de samme betingelser som før. Procentdelene af levende celler blev målt ved flowcytometri (venstre kolonne). For at vurdere effekten af oxidativt stress blev de procentdele af levende celler efter udsættelse for oxidativ stress divideret med de procentdele af levende celler dyrket under de samme betingelser før oxidativt stress (højre kolonne). Forholdet mellem levende celler før og efter oxidativ stress faldt betydeligt i både MiaPaCa-2 celler og CAF dyrket under hypoxiske betingelser. Blokering syntesen af polyaminer med DFMO signifikant øget graden af oxidativ stress-induceret apoptose i CAF. Data repræsenterer en af tre uafhængige forsøg. Betydning værdi (Students
t
test) af
P
0,05 (*) og
P
. 0,01 (**)
diskussion
ARG spiller vigtige roller i reguleringen fleste aspekter af arginin stofskifte i sundhed og sygdom, som arginin er en forløber for flere molekyler med grundlæggende vigtige biologiske funktioner, såsom urinstof, nitrogenoxid, polyaminer, prolin, kreatin, glutamat, og agmatin. [2], [4] Selvom ARG2 er efter sigende involveret i tumor immune escape mekanismer, [5] sine roller i human cancer endnu ikke fuldt belyst. Her viste vi, at størstedelen af PDCs ikke udtrykte ARG2 og at tilstedeværelsen af arg2-udtrykkende PDCs ikke var signifikant forbundet med patientens udfald. I stedet blev tilstedeværelsen af arg2 udtrykkende CAF fundet at være en uafhængig prædiktor for ringere OS (HR = 1,582,
P
= 0,007) og DFS (HR = 1,715,
P
= 0,001 ) i PDC patienter. Tilstedeværelsen af arg2 CAF i PDC Vævet blev tæt forbundet med højere tumorklassificering, tilstedeværelsen af histologiske nekrose, tilstedeværelsen af Caïx-udtrykkende stromaceller, og tilstedeværelsen af SLC2A1-udtrykkende stromaceller i PDC væv. Arg2 udtrykker CAF blev lokaliseret i og omkring nekrotiske områder i PDC væv og co-udtrykte Caïx, SLC2A1, og HIF-1α. Desuden
in vitro
eksperimenter afslørede, at dyrkede fibroblaster udvundet fra PDC væv udtrykte ARG2 efter udsættelse for hypoxi. Disse resultater viser, at kræft cellemedieret immunundertrykkelse gennem ARG2 ekspression er ikke en generel begivenhed og at tilstedeværelsen af arg2-udtrykkende CAF er en uafhængig prognostisk faktor for PDC patienter, og afspejler også vævshypoksi.
Reduceret ilt spænding er blevet rapporteret at påvirke ARG aktivitet i flere væv og celletyper, herunder lunge, hjerne, endotelceller og makrofager, [14], [15], [16], selv om virkningerne på args variere blandt væv, celler og arter. Hos mennesker er det blevet påvist, at hypoksi inducerer ekspressionen af ARG2 i lungepulsåren glatte muskelceller (PASMC) [17] og lunge mikrovaskulære endotelceller. [18], [19] Så vidt vi ved, er virkningerne af hypoxi på ARG udtryk i kræft væv eller fibroblaster ikke blevet påvist tidligere. Vores undersøgelse sammen med den undersøgelse, hypoxi induceret ekspression af ARG2 men ikke ARG1 i PASMCs tyder på, at ARG2 er hypoxi-inducerbare isoform. [17] Det er i overensstemmelse med vores resultater, at akkumulering af HIF-1α blev fundet i CAF under hypoxiske betingelser og også, at den 5′-flankerende region af det første exon af ARG2 genet har potentielle bindingssteder for HIF-1.
Ornithin genereret af ARG kan metaboliseres yderligere til polyaminer og prolin, som er afgørende for celleproliferation, differentiering og vævsheling, hvilket potentielt forhindre celledød. [20], [21], [22] Derfor induktion af ARG2 kunne være en defensiv reaktion af CAF i PDC væv under hårdt hypoxisk stress kan føre til celledød. Faktisk viste vores resultater, at arg2-udtrykkende CAF lindres oxidativ stress-induceret apoptose af CAF selv (figur 7C). Dette stemmer overens med det faktum, at disse CAF viste en høj grad af ARG og et lavt niveau af NOS, indikerer omfattende generering af polyaminer og prolin i dem. Disse CAF kan også fremkalde fibrose, da prolin er en vigtig bestanddel af kollagen. Som det er blevet observeret, at nekrotisk væv ofte er ombygget til fibrøst væv som en form for healing respons, [23] foreslås det ARG2 induktion er involveret i fibrose hos hypoxiske områder for at lette post-nekrotisk fibrose. Selvom det stadig er uklart, om ARG2-udtrykkende CAF fremmer tumor progression, blev der ikke væsentlig indvirkning på spredningen af kræftceller og beskyttelse af oxidativ stress-induceret apoptose af cancerceller findes i vores
in vitro
eksperimenter (figur 7A og 7C).
de fleste af de PDC cellerne ikke udtrykker ARG2. Lungekræft udtrykker ARG2, selv om der ikke er observeret immunsuppression medieret af arg2-udtrykkende cancerceller. [6] foreslås det således, at kræft cellemedieret immun suppression af ARG2 (og NOS2) i prostatacancer [5] er nok væv-afhængig, og ikke en generel hændelse i cancer mikromiljø. Vores undersøgelse af tumor-infiltrerende immunceller i PDCs viste, at tilstedeværelsen af arg2-udtrykkende CAF var signifikant korreleret med højere infiltration af CD68
+ makrofager (
P
= 0,05) og CD66b
+ neutrofiler (
P
0,0001), og lavere infiltration af CD4
+ T-celler (
P
= 0,003) og CD8
+ T-celler (
P
= 0,036). Desuden tumor-infiltrerende CD3
+ T-celler i nærheden af arg2-udtrykkende CAF var få og viste mindre proliferation (figur 6). Disse resultater tyder på, at tilstedeværelsen af arg2-udtrykkende CAF er tæt forbundet med den immunosuppressive mikromiljø. Denne situation kan forklares i form af væv hypoxi, [24] selv om, i hvilket omfang lokale udtryk for ARG2 i CAF bidrager til denne immunosuppression er stadig uklart.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.