PLoS ONE: DeltaNp63alpha-medieret Induktion af epidermal vækstfaktor receptor Fremmer kræft i bugspytkirtlen Cell Growth og kemoresistens

Abstrakt

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er meget modstandsdygtig over for nuværende kemoterapi, delvis på grund af ændringer i p53 tumor suppressor pathway. p53 homolog P63 er en transkriptionsfaktor afgørende for udviklingen og differentieringen af ​​epiteliale overflader. Men dens funktion i kræft er kontroversiel og dens rolle i PDAC er ikke kendt. Vi opdagede, at ΔNp63α var den overvejende udtrykt P63 variant i bugspytkirtelkræft cellelinjer. ΔNp63α protein og mRNA-niveauer var høje i T3M4, BxPC3 og COLO-357 bugspytkirtelkræftceller og lav i ASPC-1 og PANC-1-celler. Overekspression af ΔNp63α i PANC-1-celler og shRNA-medieret knockdown i T3M4 celler viste, at ΔNp63α fremmet forankringsafhængige og -uafhængig vækst, motilitet og invasion, og øget modstand mod cisplatin-induceret apoptose. Epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) signalveje bidrager til den biologiske aggressivitet PDAC, og vi fandt, at de motogenic virkninger af ΔNp63α blev forøget i nærvær af EGF. Ektopisk ekspression af ΔNp63α resulterede i opregulering af EGFR og β1-integrin i PANC-1-celler. Omvendt ΔNp63α knockdown havde en modsat effekt i T3M4 celler. ΔNp63α potenseret EGF-medieret aktivering af ERK, Akt og JNK signalering. Chromatin immunoprecipitation og funktionelle reporter assays viste, at ΔNp63α aktiveret EGFR transkription. 14-3-3σ transskription blev også positivt reguleret af ΔNp63α, og vi har tidligere vist, at 14-3-3σ bidrager til kemoresistens i bugspytkirtelkræft cellelinjer. Omvendt shRNA-medieret knockdown af 14-3-3σ førte til ophævelse af de ΔNp63α virkninger på celledeling og invasion. Således p53 homolog ΔNp63α øger onkogene potentiale bugspytkirtelkræftceller gennem trans-aktivering af EGFR og 14-3-3σ

Henvisning:. Danilov AV, Neupane D, Nagaraja AS, Feofanova EV, Humphries LA, DiRenzo J et al. (2011)

DeltaNp63alpha-

Mediated Induktion af epidermal vækstfaktor receptor Fremmer kræft i bugspytkirtlen Cell Growth og kemoresistens. PLoS ONE 6 (10): e26815. doi: 10,1371 /journal.pone.0026815

Redaktør: Toru Ouchi, University of Chicago, USA

Modtaget: Juli 7, 2011; Accepteret: 3 oktober 2011; Udgivet: 28 Oktober 2011

Copyright: © 2011 Danilov et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en Department of Medicine Junior Faculty Award (Dr. Danilov), en Norris Cotton Cancer center Prouty Pilotprojekt Award (Dr. Danilov), en Hitchcock Foundation Award (Dr. Danilov), og af National Cancer Institute Grant CA- R37-075059 (Dr. Korc). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Studier i human sygdom viser, at de fleste etablerede tumorer bære mere end én genetisk defekt. Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) resultater fra den successive akkumulering af genmutationer [1]. Aktiverende mutationer i K-Ras onkogenet og inaktivering af tumorsuppressorer CDKN2A, p53 og Smad4 er impliceret i PDAC udvikling og progression [2]. Gensplejsede musemodeller har støttet “dobbelt-hittet” hypotese, hvor indførelsen af ​​enten mutant p53 allel eller biallele sletning af INK4a /Arf i mus resulterer i progression af pancreas intraepithelial neoplastiske læsioner med lokal invasion og metastaser [3], [4]. p53-mutationer findes på 60 til 70% af PDAC. Derimod P63, en nedarvet medlem af p53 familien, er sjældent muteret i kræft.

Seks varianter af P63 genereres gennem transskription fra to forskellige promotorer og alternativ splejsning. Isoformer transkriberet fra P1 indeholder en fuld-længde trans-aktiveringsdomænet (TAp63α, β og γ). Transkription fra P2 genererer aminoterminalt trunkerede varianter (ΔNp63α, p og y), hvis nøjagtige rolle i cancer er ikke klart. Den ΔNp63 variant overudtrykkes i en række humane cancere, herunder tumorer af planocellulært oprindelse (hoved og hals, lunge), bryst og blære [5]. I hoved og hals pladecellekræft og “triple-negative” brystkræftceller, ΔNp63 undertrykker p73-afhængig apoptose og fremmer dermed tumor overlevelse [6], [7]. Derimod nedregulering af ΔNp63α i urothelial carcinoma cellelinier fremmer kræft invasionsevne [8], hvilket tyder på, at AN-varianten kan fungere i en celletype-specifik måde.

rolle P63 i PDAC er dårligt forstået. Her demonstrerer vi, at ΔNp63α varianten udtrykkes på forskelligt niveau i PDAC cellelinjer, og bevise, at ΔNp63α fremmer kræft i bugspytkirtlen cellevækst, migration, invasion og kemoresistens. Via direkte transkriptionel aktivering, ΔNp63α fører til opregulering af epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) og 14-3-3σ, sensibiliserende kræftceller til EGF og øge deres onkogent potentiale.

Metoder

cellelinjer

Humane bugspytkirtelkræft cellelinjer ASPC-1, BxPC3 og PANC-1; HEK293 humane embryonale nyreceller og H1299 humane lunge carcinomceller blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). COLO-357 og T3M4 menneskelige bugspytkirtelkræft cellelinjer var en gave fra Dr.R.Metzgar (Duke University, Durham, NC). Cellelinier blev dyrket i RPMI eller DMEM (HEK293) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (komplet medium).

plasmidkonstruktioner

den humane og murine ΔNp63α ekspressionsplasmider og (p53RE)

5-tk-luciferase plasmid blev rapporteret tidligere [9]. TAp63α ekspressionsplasmid blev købt fra Open Biosystems (Huntsville, AL). PBV-14-3-3σ promotor BDS 2 3 × (p53 bindingssted) -Luc plasmid blev opnået fra Addgene (Cambridge, MA). pGL3-EGFR-promotor (p53 bindingssteder) -Luc plasmid var en gave fra Dr. L. Pirisi [10]. Sekvensmodifikationer inden for en kodning af et DNA-bindende domæne af den humane ΔNp63α ekspressionsplasmid og inden EGFR promotor p53 bindingssted 1 blev indført under anvendelse af Quick-Change mutagenese kit (Stratagene, La Jolla, CA).

Immunoblotting

Celler blev lyseret i RIPA-buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM NaF, 1 mM natriumphosphat, 1 mM NaVO3, 1 nM EDTA, 1 nM EGTA, suppleret med protease inhibitor cocktail (Roche, Indianapolis, IN) og 1 mM PMSF). Proteiner blev analyseret ved immunblotning som beskrevet tidligere [11]. Følgende antistoffer blev anvendt: P63 (4A4, Millipore, Billerica, MA, 1:500); TAp63γ (Li et al, 2006;. 1:1,000), 14-3-3σ (Abcam, Cambridge, MA, 1:500), ERK-2 (C-14; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californien; 1: 10.000), p53 (DO-1, Santa Cruz Biotechnology; 0,4 ug /ml), EGFR (Calbiochem, 1:2,000), spaltes poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), spaltet caspase-3, ERK-1/2 , phospho-ERK1 /2 [T202 /Y204], Akt, phospho-Akt [S473] (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, 1:1,000), aktiv JNK (Promega, Madison, WI), peberrodsperoxidasekonjugeret anti mus og anti-kanin-antistoffer (BioRad; 1:5,000).

Revers transkription polymerasekædereaktion (RT-PCR)

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA ). cDNA blev syntetiseret ud fra 1 ug RNA ved tilfældig hexamer priming under anvendelse af Superscript III RT Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Semikvantitative RT-PCR blev udført under anvendelse forward og reverse primere specifikke for p63-isoformer som tidligere offentliggjort [12]. De følgende PCR cyklusbetingelser blev anvendt: 94 ° C i 3 minutter, 35 cykler på 94 ° C i 40 sek, 55 ° C i 40 sek og 72 ° C i 1,5 min; og 72 ° C i 4 min.

Til analysen af ​​ΔNp63 og TAp63 transcript ekspression kvantitativ realtids-PCR (Q-PCR) blev udført i en 7300 Sequence Detector bruger Universal PCR Master Mix ifølge producentens instruktioner (Applied Biosystems, Foster City, CA), skabelon cDNA og genspecifikke prober (Hs00978339_m1 [ΔNp63] Hs00978349_m1 [TAp63] Applied Biosystems). Alle prøver blev analyseret i duplikater.

Forbigående transfektioner, adenovirale infektion og luciferaseassays

Panc-1 og T3M4 celler blev forbigående transficeret med ExGen 500

in vitro

transfektion Reagent ( Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, MD), ved hjælp af lige store mængder af eksperimentel eller kontrol plasmid. Cellerne blev inkuberet i 48 timer og proteinekspression blev bekræftet ved immunoblotting. Kontrolsekvenserne og ΔNp63α-udtrykkende adenovirus blev anvendt som beskrevet [13]. AspC-1 og Panc-1-celler blev inficeret med adenovirus på MOI på ~ 5 i komplet medium i 24 timer.

I luciferaseassays PANC-1-celler blev co-transficeret med eksperimentel plasmid eller kontrol og luciferase reporter konstruktion (PBV-14-3-3σ promotor BDS 2 3 × (p53 bindingssted) -Luc eller pGL3-EGFR promotor-luc) sammen med pCMVp vektor (Clontech Laboratories, Mountain View, CA). Mængden af ​​DNA pr transfektion blev holdt konstant ved hjælp af tomme pcDNA3.1-vektor. Celler blev høstet 48 timer efter transfektion og luciferaseassays blev udført ved anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Relative lys enheder blev bestemt ved anvendelse af et luminometer (LMaxII

384, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) for ildflueluciferase. β-galactosidase-aktivitet blev bestemt under anvendelse af en kolorimetrisk metode til at normalisere transfektionseffektiviteten [14].

Lentiviral shRNA medieret gen silencing

lentivirus indeholdende shRNA målretning α-specifik, TAp63 specifik, alle P63 isoformer og sh kontrol blev beskrevet tidligere [15]. Lentivirus-baserede 14-3-3σ-targeting og kontrol shRNA blev også beskrevet af os tidligere [11]. Lentivirale partikler blev produceret af fire plasmid transfektion [11]. Knockdown af P63 isoformer og 14-3-3σ i T3M4 og Panc-1-celler blev bekræftet ved Western blotting og Q-PCR.

3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5 -diphenyltetrazolium (MTT) assay Salg

Celler blev udpladet i plader med 96 brønde (3000 celler per brønd, 6 brønde pr prøve) og dyrket i fravær eller nærvær af 10 pg /ml cisplatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 48 timer. MTT (Sigma-Aldrich) blev tilsat ved en slutkoncentration 0,55 ug /mL. Efter yderligere 4 timers inkubation blev absorbansen ved 570 nm bestemmes ved anvendelse af en Emax præcision mikropladelæser (Molecular Devices). Vi har tidligere observeret, at MTT-analysen i bugspytkirtelkræft cellelinjer korrelerer med cellevækst som bestemt i en fordobling og [

3H] thymidin inkorporering assays [16].

blød agar assays

blød agar-assays blev etableret i tolv brønde, hver brønd indeholdende et bundlag på 0,5% Difco agar ædel (BD Biosciences), et midterste lag af 0,3% agar herunder 1500 celler, og et øverste lag af 0,3% agar. Pladerne blev inkuberet i 14 dage. Dernæst 150 pi af 5 mg /ml MTT-opløsning blev tilsat til hver brønd. Efter inkubation ved 37 ° C i 4 timer plader blev fotograferet og kolonier blev talt.

Cell migration og invasion analyser

Cell motilitet blev vurderet i

in vitro

sårheling og Transwell migration assays. Til sårheling assays blev celler dyrket til sammenflydning i 6-brønds vævsdyrkningsplader, og sultes for serum i 12 timer. Den resulterende cellemonolaget blev ridset med en 10 pi pipettespids genererer to parallelle sår og inkuberet i 18 timer i serum-frit medium (SF; 0,1% bovint serumalbumin) i fravær eller nærvær 1 nM EGF (Millipore). Fotografier blev taget af hver brønd ved fire markerede steder under 40 × forstørrelse på nul og 18 timer efter sårede. Såret område matchede billeder blev målt ved hjælp af ImageJ software (National Institutes of Health). For Transwell migration assays blev celle suspenderet i 100 pi SF-medium og anbragt på det øvre rum af Transwell kamre (8 um porestørrelse, Corning Incorporated, Corning, NY). For invasion assays blev celler suspenderet i 500 pi SF-medium og anbragt på øvre kammer af Matrigelcoatede Transwell kamre (8 um porestørrelse, BioCoat Matrigel Invasion Chambers; BD Biosciences; Franklin Lakes, NJ). I begge Transwell assays, blev det nedre rum fyldt med 750 pi SF-medium i fravær eller nærvær af 1 nM EGF. Efter 18-20 timer blev membraner fikseret i methanol, farvet med toluidinblåt (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) og talt under anvendelse af et lysmikroskop.

Formaldehyd tværbinding chromatin immunoprecipitation (chip) og PCR-amplifikation

DNA-histon tværbinding, 2 × 10

6 celler blev inkuberet med 1% formaldehyd i komplet medium i 10 minutter. Celler blev vasket to gange i iskold PBS og lyseret i SDS Lysis Buffer (Millipore) komplet med proteasehæmmer cocktail (Roche). Proteinlysater blev sonikeret for at give kromatin-fragmenter af ~500 bp som vurderet ved agarosegelelektroforese. Efter præ-klaring blev proteinlysater inkuberet ved 4 ° C natten over med 2 ug p63α antistoffer (H-129, Santa Cruz) eller med kanin IgG som isotype-specifik kontrol antistoffer (Santa Cruz). Immunkomplekser blev vasket og DNA blev oprenset ved anvendelse chippen Assay Kit (Millipore) og QiaQuick PCR Purification Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. PCR-betingelser og primere til 14-3-3σ konsensus bindingssteder 1 og 2 blev tidligere rapporteret [17]. Følgende PCR-primere og betingelser blev anvendt til EGFR promotor p53 bindingssted: forward primer 5 ‘GGCCGCTGGCCTTGGGTC 3’; reverse primer 5’GCCGTGCGCGGTGGTTG 3 ‘; 1 cyklus på 94 ° C i 5 minutter, 43 cykler ved 95 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek, 72 ° C i 50 sek, efterfulgt af 1 cyklus af 72 ° C i 10 min. PCR blev udført ved anvendelse HotStarTaq polymerase Kit (Qiagen), med brug af Q-løsning i EGFR PCR-assay.

Cisplatin-induceret apoptose

bugspytkirtelkræftceller blev inkuberet i 24 timer i komplet medium i fravær eller nærvær af 5 eller 10 ug /ml cisplatin, som 2 timer, 6 timer eller hele 24 timer. Både flydende og adhærerende celler blev opsamlet og udsat for immunblotting.

Resultater

ΔNp63α udtryk i bugspytkirtelkræft cellelinjer

Vi fandt, at P63 var udtrykkes forskelligt i bugspytkirtelkræft cellelinjer . P63 protein niveauer var højest i T3M4 og BxPC3 celler, mellemprodukt i COLO-357 og under detektionsgrænsen i ASPC-1 og PANC-1-celler (fig. 1A). Eftersom P63 antistof (klon 4A4) erkendte alle seks kendte isoformer af P63, sammenlignede vi P63 mRNA transcript niveauer i de ovennævnte cellelinier. Alle cellelinjer udtrykte lave niveauer af TAp63 mRNA (fig. 1B). Derimod blev ΔNp63 mRNA-transkripter relativt forhøjet i BxPC3, COLO-357, og T3M4 celler (Fig. 1B).

En

, protein niveauer af P63, 14-3-3σ, TAp63γ og p53 i bugspytkirtelkræft cellelinjer.

B

, mRNA ekspressionen af ​​TAp63 og ΔNp63 isoformer af P63 i bugspytkirtelkræft cellelinjer. Totalt RNA isoleret fra PDAC cellelinjer blev revers-transkriberet og underkastet realtids-PCR med prober specifikke for AN og TA isoformerne af P63. Resultater blev normaliseret til 18S-niveauer, og udtrykt som gennemsnit af to uafhængige forsøg udført in duplo, hvor lignende resultater blev opnået.

C

, mRNA ekspressionen af ​​P63 splejsning varianter i bugspytkirtelkræft cellelinjer. Niveauer blev normaliseret til glyceraldehyd-3-fosfat (GAPDH) værdier.

For yderligere at belyse, om en bestemt splejsning variant af P63 er udtrykt i bugspytkirtelkræft cellelinjer, vi ansat semi-kvantitativ RT-PCR med P63 splejsningsvariant-specifikke primere (tabel S1). Vi bekræftede, at TAp63α mRNA-transkripter blev udtrykt ved relativt lave og lignende niveauer i alle fem cellelinjer. Derimod blev ΔNp63α mRNA-transkripter kun udtrykt i BxPC3, COLO-357, og T3M4 celler, mens ΔNp63γ mRNA var knap påvises i BxPC3 og T3M4 celler (Fig. 1C). Selv om der kan påvises p63α i et specifikt PCR-assay, isoleret påvisning af p63β mRNA-transkripter er upålidelig, da dets C-terminale ende er ikke enestående (fig. S1). I vores eksperimenter, ekspression af ΔNp63β mRNA-transkript korreleret med ΔNp63α ekspression, sandsynligvis på grund af ikke-specifik amplifikation af ΔNp63α. Da vi opdaget P63 protein migration på ~68 kDa, og ΔNp63β protein vandrer på ~52 kDa [18] – [20], konkluderede vi, at ΔNp63α var den overvejende udtrykt P63 variant i bugspytkirtelkræftceller

onkogene virkninger. af ΔNp63α i bugspytkirtelkræftceller

for at studere de biologiske effekter af ΔNp63α i PDAC, vi manipulerede sit udtryk i Panc-1 og T3M4 celler, som havde lave og høje endogene niveauer af ΔNp63α henholdsvis (fig. 1) . PANC-1-celler blev transient transficeret med en ΔNp63α-udtrykkende vektor (PANC-1ΔN), en TAp63α-udtrykkende vektor (PANC-1TA), eller kontrol plasmid. Lentiviral-medieret shRNA blev anvendt til nedregulere P63 gen isoformer i T3M4 celler. To forskellige shRNA sekvenser, én komplementær til en sekvens i en P63 DNA-bindende domæne (sh DBD) og således rettet mod alle isoformer af P63, og en anden komplementær til en sekvens inden for steril alpha motiv domæne (SAM) og således målretter TAp63α og ΔNp63α ( sh p63α) blev bestemt til at reducere ΔNp63α protein og transcript niveauer i T3M4 celler (fig. 2A). Mens shRNA rettet mod trans-aktivering domæne (sh TAp63) resulterede i reducerede TAp63 transkriptniveauer, dette ikke udslag i en mærkbar ændring i det samlede P63 protein niveauer (Fig. 2A), bekræfter vores observation, at ΔNp63α variant dominerer i bugspytkirtelkræft cellelinjer .

En

, T3M4 celler blev inficeret med GFP-udtrykkende virus eller P63-specifikke shRNA komplementære til DBD, TA og a-specifikke domæner af P63. Helcelle-proteinlysater blev underkastet immunoblotting (øverste panel). Totalt RNA blev isoleret, revers-transskriberet og udsat for real-time PCR med sonder specifikke for An og TA isoformer af P63. Resultater blev normaliseret til 18S niveauer (nedre panel). Knockdown af P63 isoformer blev rutinemæssigt overvåget i løbet af de efterfølgende eksperimenter.

B

, ΔNp63α stimulerer forankringsuafhængig vækst af PANC-1-celler i blød agar-assay (venstre og bundpanelerne) og celleproliferation i MTT-assayet (højre panel). PANC-1-celler blev transient transficeret med ΔNp63α-udtrykkende vektor, TAp63α eller kontrol vektor. Celle blev udpladet i blød agar med en tæthed på 1500 /brønd af en 12-brønds plade, fire brønde pr prøve. Kolonier blev talt efter 14 dages inkubation. For MTT blev assay-celler udpladet i plader med 96 brønde, seks brønde pr prøve. MTT blev tilsat efter inkubation i 48 timer. Data er middelværdier ± SE for fire uafhængige forsøg. *, P 0,001 sammenlignet med kontrol.

C

, nedregulering af ΔNp63α bremser spredning af T3M4 celler i en klonogene assay. Rekonstituering af ΔNp63α delvist genskaber den proliferative evne. Celler blev udpladet på plader med 6 brønde ved en densitet på 500 celler /brønd. 14 dage senere blev plader fikseret i 03:01 methanol: iseddikesyre og farvet med 2% krystalviolet. Data er middelværdier ± SE af tre uafhængige forsøg gennemført in triplo. *, P 0,01 sammenlignet med kontrol (sh ctrl).

D-F

, Effekt af P63 på celle motilitet målt i sårhelende analyser i PANC-1 (

D

) og T3M4 celler (

E, F

). Celler blev inkuberet i serumfrit (SF) betingelser i fravær eller nærvær af 1 nM EGF i 18 timer efter at en ridse. Kvantitativ analyse af billederne blev udført. Ektopisk udtryk for mus ΔNp63α i sh p63α T3M4 celler resulterede i en delvis restaurering af celle motilitet (

F

); tilsvarende ΔNp63α proteinniveauer vist nedenfor. Dataene er m ± SE af mindst tre uafhængige forsøg. Repræsentative billeder vist (forstørrelse × 40). *, P 0,001 sammenlignet med kontrol (sh ctrl).

G og H

, Effekt af ΔNp63α om invasionen i Matrigel kamre. PANC-1 (

G

) eller T3M4 (

H

) celler blev udpladet i Matrigel kamre (5 × 10

4 /ml) og inkuberet i fravær (SF) eller tilstedeværelse af 1 nM EGF i 18 timer. Effekt blev normaliseret til invasion af kontrol i SF betingelser. *, P. 0,001 sammenlignet med kontrol (sh ctrl)

Siden forankringsuafhængig vækst er kendetegnende for maligne celler, vi studerede, om ΔNp63α har en virkning på forankringsuafhængig vækst og celledeling i PDAC. PANC-1ΔN, men ikke PANC-1TA celler udviste forøget kolonidannelse i blød agar-assays og forøget celleproliferation i MTT-assays (fig. 2B). Da T3M4 celler er ude af stand til at danne kolonier i blød agar, blev proliferation undersøgt i et klonogent assay. I forhold til kontrolceller blev proliferation af T3M4 celler nedsættes til gengæld for shRNAs der er målrettet mod DBD eller α-specifikke C-terminus og uændret som reaktion på sh TAp63 (fig. 2C). Forbigående overekspression af muse ΔNp63α cDNA, der bærer en tavs mutation i regionen målrettet efter α-specifikke shRNA, resulterede i en delvis redning af den proliferative evne sh p63α T3M4 celler, i sammenligning med celler transficeret med kontrolvektor (fig. 2C ).

ΔNp63α vides at regulere adhæsion program i mammae epitelceller og keratinocytter [15]. I betragtning af betydningen af ​​celleadhæsion i tumorinvasion og progression, studerede vi effekterne af ΔNp63α på motilitet og invasive kapaciteten i de pankreatiske cancerceller. I sårhelende assays, PANC-1ΔN celler vist bedre motilitet i SF betingelser, mens overekspression af TAp63α havde nogen virkning (fig. 2D). Da aktivering af EGFR-vejen er forbundet med øget tumor aggressivitet og nedsat overlevelse i PDAC [21], forsøgte vi at bestemme virkningen af ​​EGF på motilitet. EGF-stimulering forbedret migration i PANC-1ΔN og kontrolceller (fig. 2D). Tilsvarende T3M4 celler, der udtrykker sh p63α, men ikke sh TAp63, udviste reduceret motilitet både ved basislinje og i nærværelse af EGF (fig. 2E). Forbigående overekspression af muse ΔNp63α i T3M4 celler, der udtrykker sh p63α resulterede i en delvis redning af motiliteten fænotype (Fig. 2F). Manipulation af ΔNp63α ekspressionsniveauer havde ingen effekt på invasionen af ​​bugspytkirtelkræftceller i Matrigel kamre i SF betingelser (fig. 2G, H). Imidlertid stimulering med EGF førte til en dramatisk stigning i den invasive evne PANC1-AN-celler (fig. 2G). I overensstemmelse med ovenstående konklusioner, shRNA-medieret undertrykkelse af ΔNp63α, men ikke TAp63, væsentligt reduceret evne T3M4 celler til at invadere gennem Matrigel i respons på EGF-stimulering (Fig. 2H).

Kollektivt, vores resultater tyder at ΔNp63α øger kolonidannende, proliferative og invasive kapacitet i bugspytkirtelkræftceller.

ΔNp63α opregulerer EGFR og sensibiliserer bugspytkirtelkræftceller over for virkningerne af EGF

i forhold til de normale bugspytkirtel, EGFR protein og mRNA udtrykkes i høje niveauer i pancreascancer [22]. EGFR-mRNA-ekspression forudsiger nedsat overlevelse og dårlig respons på kemoterapi i patienter med PDAC [23]. I vores arbejde, ΔNp63α dramatisk potenserede bugspytkirtelkræft cellemotilitet og invasive evner i nærvær af EGF. For at forklare dette fænomen, undersøgte vi virkningen af ​​ΔNp63α på EGFR niveauer. Vi bestemt, at manipuleret udtryk for ΔNp63α i PANC-1 celler forbedrede EGFR, mens ektopisk TAp63α havde nogen virkning (fig. 3A). I overensstemmelse med denne observation, fandt vi, at EGFR niveauer blev nedsat i T3M4 celler som reaktion på shRNA-medieret undertrykkelse af ΔNp63α (fig. 3B), hvilket dokumenterer en direkte sammenhæng mellem ΔNp63α og EGFR i bugspytkirtelkræft cellelinjer. For at undersøge virkningerne af ΔNp63α overekspression på EGFR-signalering, vurderede vi aktivering af downstream kinaser upon EGF stimulering. Behandling af PANC1-AN celler med EGF resulterede i øget phosphorylering af ERK, Akt og JNK (fig. 3C). I disse celler, udviste alle tre kinaser øget aktivering ved så tidligt som 10 minutter efter celle stimulation, og ERK aktivitet varede i 60 minutter.

En

, ektopisk udtryk for ΔNp63α resulterer i forøget ekspression af EGFR og β1-integrin i PANC-1-celler. Efter cellerne blev inkuberet i 48 timer, blev de samlede proteinlysater underkastet immunblotting. Et repræsentativt billede af tre uafhængige forsøg er vist.

B

, nedregulering af ΔNp63α i T3M4 celler resulterer i reduceret ekspression af EGFR og β1-integrin. Et repræsentativt billede af tre uafhængige forsøg er vist.

C

, PANC-1ΔN og PANC-1 kontrol celler blev stimuleret med EGF i angivne tidsperioder. Proteinlysater blev underkastet immunblotting. Et repræsentativt billede af tre uafhængige forsøg er vist.

Næste, vi ansat en tyrosinkinasehæmmer at hævde, at virkningerne af ΔNp63α blev formidlet gennem EGFR-vejen. Erlotinib er en reversibel inhibitor af signalsystemet EGF, som associerer med ATP-bindingsstedet af receptoren. Inkubation af PANC-1-celler med 1 pM erlotinib svækkede ΔNp63α-medieret forøgelse af kolonidannelse, motilitet og invasion (fig. S2), dvs. ikke mulighed for en ikke-specifik virkning. Derimod blev P63 protein niveauer påvirkes ikke, når cellerne blev inkuberet med enten EGF eller erlotinib (data ikke vist).

Tidligere rapporter foreslået, at ΔNp63α kan regulere celleadhæsionsproteiner i mammaepitelceller [15]. Da integrinpositive medierede tumor celle-interaktioner med den ekstracellulære matrix spiller en kritisk rolle i fastlæggelsen af ​​den invasive fænotype i PDAC, vi undersøgt, om ΔNp63α havde en effekt på integrin udtryk i bugspytkirtelkræftceller. Ektopisk udtryk for ΔNp63α i PANC-1 celler forøget ekspression af β1-integrin, mens udtryk for α3- og a5-integriner var uændret (fig. 3A). Omvendt shRNA-medieret suppression af ΔNp63α førte til et fald i β1-integrin i T3M4 celler (Fig. 3B).

Således ΔNp63α bidrager til den onkogene potentiale bugspytkirtelkræftceller, i det mindste delvis, gennem opregulering af EGFR og β1-integrin.

ΔNp63α bidrager til kemoterapi modstand i bugspytkirtelkræftceller

Da PDAC er notorisk resistent over for kemoterapeutiske stoffer, vi studerede rolle ΔNp63α i kemoterapi modstand. Det er tidligere blevet vist, at cisplatin inducerer nedbrydning af ΔNp63α via stimulering af IKB kinase [24]. I overensstemmelse med disse data, inkubation af bugspytkirtelkræft cellelinjer med 10 ug /ml cisplatin resulterede i nedbrydning af endogene ΔNp63α. Denne virkning af cisplatin var tydelig efter 6 timers inkubation og blev ledsaget af forøget apoptose i alle testede cellelinier (fig. 4A). Vi derefter undersøgt, om ektopisk udtryk for ΔNp63α vil bidrage til resistens over for cisplatin-induceret apoptose i PDAC. PANC-1-celler blev inkuberet i 24 timer i komplet medium suppleret med 5 pg /ml cisplatin i 2, 6 eller 24 timer. PANC-1ΔN celler udviste en mild dæmpning af apoptose sammenlignet med kontrolceller, som manifesteret ved nedsat PARP og caspase-spaltning (fig. 4B). Dette fald i cisplatin-induceret apoptose korreleret med en stigning i levedygtighed PANC-1ΔN celler som bestemt i et MTT-assay, mens PANC-1TA celler udviste en let nedsat overlevelse (fig. 4C). Derimod blev T3M4 celler, der udtrykker sh p63α sensibiliseret for cisplatin-induceret apoptose, hvilket fremgår af en øget spaltning af PARP og caspase (fig. 4D). Således ΔNp63α dæmper følsomheden af ​​bugspytkirtelkræftceller til cisplatin.

En

, Effekt af cisplatin på ΔNp63α i PDAC. Celler blev inkuberet med 10 pg /ml cisplatin i de første 6 eller fuld 24 timer. Apoptose blev vurderet ved at overvåge PARP-spaltning.

B-D

, Effekt af ΔNp63α på cisplatin-induceret apoptose i PANC-1 (

B, C

) og T3M4 celler (

D

). Celler blev inkuberet med 5 ug /ml cisplatin i angivne tidsperioder. Cellerne blev pelleteret efter 24 timer inkubation proteiner isoleret og kørt på SDS-PAGE-gel. Apoptose blev vurderet ved at overvåge PARP og caspase-3-spaltning. Et repræsentativt billede af mindst tre uafhængige forsøg er vist. PANC-1-celler blev inkuberet med 10 pg /ml cisplatin i de første 12 timer eller fuld 48 timer. MTT-assayet blev udført som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Dataene er gennemsnit ± SE for tre uafhængige forsøg.

ΔNp63α opregulerer 14-3-3σ i bugspytkirtelkræft cellelinjer

Næste vi studerede mekanismerne i ΔNp63α-medieret kemoresistens i PDAC . Vi har tidligere vist, at 14-3-3σ dramatisk øger modstanden mod cisplatin-induceret apoptose i bugspytkirtelkræft cellelinjer [11]. Westfall et al. påvist, at ΔNp63α virker som en transkriptionel repressor af 14-3-3σ promotor i humane epidermale keratinocytter [25]. Derimod observerede vi, at ekspression af ΔNp63α korreleret med 14-3-3σ proteinekspression i bugspytkirtelkræftceller (fig. 1A). Desuden blev silencing ΔNp63α ledsaget af reduktion i 14-3-3σ proteinniveau i T3M4 celler (Fig. 2A). 14-3-3σ er en p53 transkriptionel mål, men BxPC3, er Panc-1 og T3M4 celler vides at bære mutant p53, hvis transkriptionel aktivitet er defekt [26], mens COLO-357-celler udtrykker lave p53 proteinniveauer (fig. 1A) . Derfor 14-3-3σ udtryk er usandsynligt, at være afhængig af p53 i PDAC.

For at afgøre, om ΔNp63α modulerer 14-3-3σ udtryk i bugspytkirtelkræftceller introducerede vi ΔNp63α cDNA via adenoviral infektion i ASPC- 1 og PANC-1-celler, som udtrykker lave niveauer af 14-3-3σ og ΔNp63α. Vi observerede en stigning i 14-3-3σ protein niveauer i ΔNp63α overekspression celler sammenlignet med kontrol-inficerede celler (Fig. 5A). Dette ΔNp63α-medieret stigning i 14-3-3σ var ikke forbundet med ændringer i proteinniveauer i de øvrige 14-3-3 isoformer (Fig. 5A). Derimod manipulation af 14-3-3σ niveauer i PANC-1 og T3M4 celler ikke havde en indvirkning på ΔNp63α (fig. 5B og 5C).

A, ASPC-1 og PANC-1-celler var inficeret med adenovirus indeholdende enten tom vektor eller fuld længde ΔNp63α, og hele celleprotein lysat blev fremstillet 48 timer efter infektion og undersøgt med anti-ΔNp63α og 14-3-3σ og andre 14-3-3 isoformer.

B

, Overekspression af 14-3-3σ havde ingen effekt på ΔNp63α niveauer. PANC-1-celler blev transficeret med en tom vektor (Sham) eller med den fuld-længde humant 14-3-3σ cDNA, som blev mærket med HA.

C

, Silencing 14-3-3σ påvirker ikke ΔNp63α. T3M4 celler blev inficeret med lentivirus indeholdende kontrol eller 14-3-3σ specifik shRNAs (sh 14-3-3σ 1 og 2), blev hele cellelysater fremstillet 72 timer efter infektion og probet for ΔNp63α og 14-3-3σ.