PLoS ONE: MicroRNA profiler forskelsbehandling af tyktarmskræft Metastase

Abstrakte

MikroRNA’er udnyttes til diagnose, prognose og overvågning af kræft og andre sygdomme. Deres høje vævsspecificitet og kritisk rolle i onkogenese give nye biomarkører for diagnose og klassificering af kræft samt forudsige patienternes resultater. MicroRNA signaturer er blevet identificeret for mange humane tumorer, herunder kolorektal cancer (CRC). I de fleste tilfælde metastatisk sygdom er vanskeligt at forudsige og forebygge med passende behandlinger. Formålet med vores undersøgelse var at identificere en microRNA signatur for metastaserende CRC, der kunne forudsige og differentiere metastatisk målorgan lokalisering. Normale og cancer væv fra tre forskellige grupper af CRC patienter blev analyseret. RNA microarray og TaqMan Array analyse blev udført på 66 italienske patienter med eller uden lymfeknuder og /eller lever gentagelser. Data opnået med de to assays blev analyseret separat og derefter gennemskåret til at identificere en primær CRC metastatisk signatur. Fem differentielt udtrykte mikroRNA (HSA-miR-21, -103, -93, -31 og -566) blev valideret af QRT-PCR på en anden gruppe af 16 amerikanske metastatiske patienter.

In situ

hybridisering blev udført på de 16 amerikanske patienter samt på tre forskellige kommercielle væv microarray (TMA) indeholdende normal tilstødende colon, den primære adenocarcinom, normale og metastatiske lymfeknuder og lever. HSA-miRNA-21, -93 og -103 opregulering sammen med HSA-miR-566 nedregulering defineret CRC metastatisk signatur, mens

in situ

hybridisering data identificerede en lymphonodal invasion profil. Vi gav første microRNA signatur, der kunne skelne mellem kolorektale gentagelser til lymfeknuder og lever og mellem colorectal levermetastaser og primær levertumor

Henvisning:. Drusco A, Nuovo GJ, Zanesi N, Di Leva G, Pichiorri F , Volinia S, et al. (2014) MicroRNA profiler forskelsbehandling af tyktarmskræft Metastase. PLoS ONE 9 (6): e96670. doi: 10,1371 /journal.pone.0096670

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: Januar 4, 2014 Accepteret: April 10, 2014; Udgivet: 12 Jun 2014

Copyright: © 2014 Drusco et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af NIH Grant U01 CA152785 microRNA /UCRs: biomarkører for kræftrisiko, tumor afsløring, progression og behandling. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den vigtigste dødsårsag hos cancerpatienter er metastatisk sygdom [1]. formidling cancer celler er blevet betragtet som en sen flertrins hændelse under tumorudvikling. Efter den primære tumorvækst, genetisk udvalgt, maligne celler invaderer lokale væv, indtaste til blod og /eller lymfekarrene, transporteres til fjerne steder og kolonisere nye organvæv. De seneste beviser tyder på, at tumor spredning kunne være en tidligere begivenhed, der i sidste ende vil åbenbart efter flere år fra diagnose [2] – [5]

Tyktarmskræft er den tredje mest almindelige malignitet i den udviklede verden efter lunge og bryst. cancer: omkring halvdelen af ​​patienterne dør af metastatisk sygdom inden for 5 år fra diagnosen [6]. De første steder af metastatisk sygdom af colorektal cancer er de regionale lymfeknuder og leveren. Patologisk undersøgelse af colon adenocarcinom kan ikke præcist forudsige patienter, der vil have dissemineret sygdom til lokale lymfeknuder og /eller til fjerne steder. Men i colon, såvel som i bryst- og melanom kræftpatienter, kan tilstedeværelsen eller fraværet af lymfeknuder invasion påvirke typen af ​​kirurgisk resektion eller typen af ​​kemoterapi regime [7] -. [9]

Selvom metastaser til leveren ofte kommer fra kolon kræft, er der tilfælde, hvor metastaser er den første og eneste finde hos patienter med ukendt primær tumor websted [10], og sondringen mellem primære hepatiske læsioner og levermetastaser fra forskellige brancher er af terapeutisk og prognostisk værdi [11].

der er således et stigende behov for nye diagnostiske og prognostiske biomarkører, der kan skelne mellem den primære tumor og de forskellige steder i metastase, samt forudsigelse af metastaserende tilbøjelighed den primære tumor.

MikroRNA’er eller miRNA, er små (19-25 nukleotider) ikke kodende RNA’er, der regulerer gener ekspression ved post-transkriptionelt undertrykke mRNA-translation og /eller forårsager mRNA nedbrydning. De er involveret i reguleringen af ​​de fleste af fysiologiske processer [12], og er afvigende udtrykt i tumor initiering og progression, forudsige sygdomsstatus og klinisk resultat [13], [14]. Interessant, microRNA signaturer er meget vævsspecifik og kan bruges til at klassificere kræft, og for at identificere den primære tumor af en metastatisk læsion af ukendt oprindelse [15] – [19].

Formålet med vores undersøgelse var at identificere en microRNA signatur, der kan tillade skelne mellem lymphonodal og hepatisk metastaser hos patienter med kolorektal cancer.

Materialer og metoder

Patient vævsprøver

Tre grupper af patienter var overvejes i undersøgelsen (Tabel 1).

Paraffin indlejret væv, der kommer fra 66 patienter diagnosticeret med colon carcinoma blev udvalgt fra universitetet i Rom “La Sapienza”, UOC Anatomia ed Istologia Patologica C /Cardiovascolare, vævsbank efter til TNM mellemstationer.

Ud af 66 patienter, 18 præsenteret en primær colon tumor uden metastaser (Enhver T, n0, M0), 33 havde tyktarmskræft med lymfeknuder kun metastase (Enhver T, Enhver N, M0) og 15 blev diagnosticeret med tyktarmskræft, lymfeknuder og levermetastaser (Enhver T, Enhver N, M1). Separate tumor prøver fra den primære tumor, de metastatiske lymfeknuder og levermetastaser blev indsamlet for hver patient og behandles til væv microarray og TaqMan Array MicroRNA Cards.

En anden gruppe af 16 patienter, der kommer fra filerne i OSU Patologi afdelingen blev indrulleret i studiet. For hver patient blev normal colon væv, primær colon adenocarcnoma, metastatiske lymfeknuder og metastatisk leveren analyseret, samt de tilsvarende normale lymfeknuder og lever, når de foreligger. TMA, der blev genereret fra disse patienters prøver plus tre sæt US Biomax Tissue arrays (BN05014 med 24 tilfælde, BC05118 med 50 sager, CO702 med 69 sager) blev anvendt til in situ-hybridisering (ISH). US Biomax tilfælde repræsenterer den tredje gruppe af patienter inkluderet i undersøgelsen med normale tilstødende colon væv, primær colonadenocarcinom uden lymfeknude /fjernmetastaser og primær tyktarmskræft af patienter med dokumenterede lymfeknuder og levermetastaser, og den faktiske lymfeknude og /eller levermetastaser

projektet blev godkendt af den italienske (Presidente -. Prof. Aldo ISIDORI, Prof. Lucio MIANO, Dott.ssa Amalia Allocca, Dott.ssa Enrica Arduini, Dott.ssa Maria Caporale, Prof. Luciano CAPRINO, Dott.ssa Avia Carabelli, Prof. Francesco COGNETTI, Dott.ssa Anna DALLE ORE, Prof.ssa Marzia Duse, Dott.ssa Giuseppina DI Giammarco, Dott. Domenico Antonio IENTILE, Prof. Giovanni Fabbrini, Prof.ssa Paola FRATI , Dott.ssa Maria Teresa LUPO, Prof. Franco MANDELLI, Dott. Enrico MARINELLI, Dott.ssa Boza MAURO, Prof. Paolo MENE ‘, Dott.ssa Elisabetta SIMONGINI, Prof. Pietro Serra, Prof. Giovanni Spera, Dott. Ettore Tiberi , Avv. Angelo tuzza, Prof.ssa Annarita Vestri, Prof. Vincenzo ZIPARO) og amerikanske (https://orrp.osu.edu/irb/irbforms/) Etisk Commettee (Prot.1119 /13, Prot.2007E0748 henholdsvis). Konkret både Commettees, Ohio State University Institutional Research Board og il Comitato Etico “La Sapienza”, undtaget os fra patienter informeret samtykke, da der i begge tilfælde paraffin indlejret væv blev anonymt arkiverede prøver, udvalgt efter deres TNM mellemstationer og patienter var ikke længere tilgængelig.

RNA ekstraktion

Totalt RNA blev ekstraheret behandling fem 20 um tykke sektioner fra hver paraffin indlejret væv, ved hjælp RECOVERALL Total Nucleic Acid Isolation Kit (AMBION # 1975) og efter producentens anvisninger.

RNA mærkning og hybridiseringsbetingelser på miRNA microarray chips blev udført som tidligere beskrevet [20]. Fem ug af hver prøve total RNA blev hybridiseret på vores miRNA microarray (Ohio State Comprehensive Cancer Center, version 2.0), som indeholder 460 modne miRNA sonder, spottet i fire eksemplarer (235

Homo sapiens

, 222

Mus musculus

, og tre

Arabidopsis thaliana

). Forskellige prober blev anvendt til at genkende hver modne miRNA og de fleste af miRNA forstadier. Hybridiseringssignaler blev påvist med Streptavidin Alexa Fluor 647 konjugater og scannede billeder (Axon 4000B) blev kvantificeret ved hjælp af GenePix 6.0 software (Axon Instruments). De samme prøver blev også analyseret med RT-PCR-kort (Applied Biosystems).

miRNA microarray

Mikroarrays blev i det væsentlige analyseret som beskrevet af Liu et al [21]. Fraktiler normalisering og statistisk analyse blev udført under anvendelse BRB ArrayTools udviklet af Richard Simon og Amy Peng Lam [22].

differentielt udtrykt miRNA blev identificeret under anvendelse af et vilkårligt varians t-test. Den tilfældige-varians t-test er en forbedring i forhold til standard separate t-test, da den tillader deling af oplysninger mellem gener omkring inden klasse variation uden at antage, at alle gener har samme varians. Gener blev betragtet som statistisk signifikant, hvis deres P-værdien var lavere end 0,05. [23].

Flere test blev kontrolleret ved hjælp af falske opdagelse sats. miRNA nomenklatur blev etableret i henhold til UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/) og miRBase (https://www.mirbase.org/); i tilfælde af uoverensstemmelser i miRBase blev fulgt.

findes på GEO hjemmeside Rådata (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE56350) .

TaqMan Array MicroRNA Cards og kvantitativ Real Time PCR

Real Time PCR blev udført ved hjælp af TaqMan Array menneskelige MicroRNA panel (v.1, Applied Biosystems, Foster City, CA) og 50 ng af RNA per port for i alt 400 ng. Denne matrix indeholder 365 miRNA mål samt endogene kontroller. Normalisering blev udført med små nukleare RNA (snRNA) U44 og U48. Ekspression af enkelt modne miRNA blev vurderet af TaqMan miRNAassay (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), og normaliseret til RNUB6 (Applied Biosystems). Rådata findes på GEO hjemmeside (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE56350).

In situ hybridisering

In situ hybridisering blev udført for udvalgte microRNA efter en tidligere beskrevet protokol [24], ved hjælp af Exiqon LNA-5’DIG mærkede prober. Tre USBiomax væv microarrays (TMA) slides (Colon normal Tissue array med 21 normale tilfælde og 3 adenocarcinom tilfælde Tyktarmskræft og matchede tilstødende normale væv array med 25 tilfælde, Tyktarmskræft væv array med metastaser og tilstødende normale væv med 68 tilfælde) og en objektglas med vævskerner fra 16 patienter (OSU TMA) blev anvendt. For hvert udvalgt microRNA blev TMAs scoret efter den relative microRNA ekspression af hver kerne med to patologer som defineret af procentdelen af ​​positive tumorceller og styrken af ​​signalet i disse cancerceller i positive tilfælde. Scorerne blev genereret blindet for nærvær eller fravær af metastatisk sygdom og Mann-Whitney-test blev anvendt til at sammenligne klasser

Resultater Salg

Vores undersøgelse blev udviklet i fire trin ved at udnytte.: (i) mikromatrice, (II) Taqman high density kort, (III) Taqman enkelt assay QRT-PCR og (IV) in situ hybridisering. For at opnå mere robuste resultater, vi brugte tre forskellige grupper af patienter (tabel 1). Den første gruppe omfattede 66 italienske patienter (III Clinica Chirurgica, Universita ‘di Roma “La Sapienza”, Rom, Italien) med colon adenocarcinom: 18 patienter havde ikke nogen metastase, 33 havde påvirket lymfeknuder og 15 viste metastaser i begge lymfeknuder og leveren. Total RNA fra 18 colon primære tumorer (T) uden metastaser, 33 colon primære tumorer (T

N) med lymphonodal tilbagefald og de tilsvarende 33 metastatiske lymfeknuder (N

N), 15 colon primære tumorer (T

L,) af patienter med lymphonodal og hepatisk metastatisk sygdom og de tilsvarende 15 metastatiske lymfeknuder (N

L) og leverlæsioner (L), blev testet på den brugerdefinerede microarray platform, der tidligere var blevet brugt til at etablere kræft microRNA signaturer i flere undersøgelser [13], [14], [21], og på Taqman Array microRNA Cards (Applied Biosystems). Data blev normaliseret ifølge platformen krav og de samme sammenligninger mellem klasser blev påført begge datasæt separat. Væsentligt ændret miRNA blev identificeret og resultater blev gennemskåret. Kun microRNA med en fold ændring forskel større end 2 eller lavere end 0,5 blev betragtet som de putative pro-metastatiske og anti-metastatiske miRNA hhv. Tolv microRNA var konsekvent opreguleret i metastaser (HSA-miR-103, -155, -16, -191, -200c, -21, -24, -26a, -26b, -29a, -31 og 93) og kun to blev nedreguleret (HSA-miR-328 og -566) (tabel 2).

Den dobbelte række strategi tillod os at teste de samme prøver med to forskellige tekniske tilgange.

for yderligere at bekræfte den identificerede “metastatisk” signatur, blev udvalgt microRNA testet på seksten amerikanske patienter med metastatisk tyktarmskræft (OSU Patologi afd, Columbus, OH). For hver patient, total RNA af paraffinindlejrede væv kerner af normal og malign colon, lymfeknude og lever, blev analyseret ved en enkelt QRT-PCR. Mann-Whitney-test blev anvendt til at sammenligne de PCR-resultater fra de forskellige patientgrupper.

Primære metastatiske colon adenokarcinomer viste en signifikant overekspression af HSA-MIR-21 (P-værdi = 0,0011), -31 (P -værdi = 0,0003), -93 (P-værdi = 0,0048), -103 (P-værdi = 0,0142) og nedregulering af HSA-mIR-566 (P-værdi = 0,0075) sammenlignet med deres tilstødende normalt væv (tabel 2 ). Desuden respekt til normal, HSA-miR-21 og -93 var signifikant opreguleret i levermetastaser med en P-værdi = 0,020 og P-værdi = 0,0002 hhv. HSA-miR-21 var også signifikant overudtrykt i metastatiske lymfeknuder (P-værdi = 0,009) (figur 1). Disse fem validerede microRNA korrelerede ikke med tumor iscenesættelse.

Normalt kolon væv (NORM), kolon adenokarcinomer (ADENOCA), lymphonodal metastase (POSLYM) og kolon lever (LIVERMET) for miR-21 (A), miR -31 (B), mIR-93 (C), mIR-103 (D) og mIR-566 (E). En Mann-Whitney-test blev anvendt til at sammenligne grupper. Grupper er vist på boxplots ‘X-aksen, mens de delta Ct-værdier er repræsenteret på y-aksen. For hver kasse, bar repræsenterer Median, området den 25

th og 75

percentil og whiskers af grafen de største og mindste værdier. Hver P-værdi bar svarer til en sammenligning: for hver miR den første nederste bar refererer til NORM vs ADENOCA sammenligning; miR-21 sekunder lavere bar P-værdi svarer til NORM vs POS lymfe sammenligning, mens den første øverste bar af både miR-21 og -93 svarer til NORM vs LEVER MET sammenligning.

I tumorer, er de inflammatoriske og stromaceller spredt mellem benigne og maligne epitelceller, og trinløst bidrage til cellularitet af læsionen. Det er således vigtigt at forstå, hvilken type celle udtrykker en specifik microRNA. Til dette formål in situ hybridisering blev udført på TMAs med primær adenocarcinomer, metastatiske lymfeknuder, hepatisk metastase og normale væv. HSA-MIR-21, -93, -103 og -566 prober blev hybridiseret på OSU TMA og USBiomax TMA lysbilleder. To uafhængige patologer scoret hver slide kerne blindet til stedet af kernen biopsi og til den kliniske stadieinddeling historie, overvejer signalintensiteten af ​​colon maligne celler sammenlignet med de tilstødende normale epitel og ikke-epitelceller (fig.2). HSA-MIR-21 (P-værdi 0,0001) og -103 (P-værdi = 0,0009) var signifikant overudtrykt i adenokarcinomer og metastatiske cancere sammenlignet med raske (Fig.2: A, B). En Chi-squared test afslørede en lineær tendens for begge, HSA-miR-21 (P-værdi 0,0001) og HSA-miR-103 (P-værdi 0,0001): de var i stigende grad opreguleres forløber fra normal, til adenocarcinom og metastase (fig.3, figur 4). Men mens HSA-MIR-103 blev signifikant overudtrykt i levermetastaser sammenlignet med adenocarcinomer og positive lymfeknuder, HSA-MIR-21 viste ingen signifikant forskel mellem de tre klasser. ISH af HSA-MIR-93 bekræftet sin opregulering i adenokarcinomer og levermetastaser, der viser en signifikant forskel mellem raske og enten adenocarcinomer (P-værdi = 0,0345), eller levermetastaser (P-værdi = 0,007) og mellem adenokarcinomer og levermetastaser (P -værdi = 0,043). Ingen signifikant forskel blev fundet ved sammenligning raske og adenokarcinomer versus positive lymfeknuder (Fig. 2C og fig.5). Således kunne HSA-MIR-93 ekspressionsmønster differentiere normal colon fra primær adenocarcinoma, og normal colon og primær adenocarcinom fra levermetastaser, men ikke fra sekundær tumoral lymphnodal invasion. HSA-MIR-566 blev ligeledes overudtrykt i normal tilstødende colonvæv, primær adenocarcinom maligne celler og lever colon metastatiske celler (fig. 2D). Viste imidlertid, positive lymfeknuder en væsentligt svagere signal i forhold til raske (P-værdi = 0,002) og adenocarcinom (P-værdi = 0,043), hvilket antyder, at tabet af HSA-miR-566 kan lette lymfeknude invasion i tyktarmskræft.

med normal colon tissue (NORM), kolon adenokarcinomer (ADENOCA), lymphonodal metastase (POSLYM) og colon lever (LIVERMET) for mIR-21 (A), mIR-103 (B), mIR-93 ( C), mIR-566 (D) og mIR-200C (E). En Mann-Whitney-test blev anvendt til at sammenligne grupper. Grupper vises på boxplots ‘x-aksen, mens den gennemsnitlige score Værdier er repræsenteret på y-aksen. For hver kasse, bar repræsenterer Median, området den 25

th og 75

percentil og whiskers af grafen de største og mindste værdier. Hver P-værdi bar svarer til en sammenligning: for miR-21, -103, -93, og -200c den første nederste bar svarer til NORM vs ADENOCA sammenligning; miR-21, -103, og -93 første øvre søjler refererer til NORM vs LEVER MET sammenligning, mens miR-566 og -200c øverste bar viser NORM vs POS lymfe sammenligning; miR-566 og miR-200C lavere søjler angiver ADENOCA vs POS lymfe og NORM vs POS lymfe sammenligning henholdsvis.

Som dokumenteret i litteraturen, miR-21 viste et svagt signal i normal colon hensyn til adenocarcinom (P-værdi = 0,0011), og det var stærkt udtrykt i metastase. MIR-21-ekspression kun detekteret i primær adenokarcinom og metastatiske maligne celler.

Ved normal colon pilen peger på den manglende miR-103-ekspression i epitelceller. I den primære tumor pilen peger på den øgede ekspression af miR-103 i den invasive adenokarcinom. Pilen i lever gentagelse og de to pile i lymfeknudemetastaser viser en dramatisk forøget ekspression af miR-103 i metastatisk adenokarcinom epitel.

Induktion af Epithelial-til-Mesenchimal Transition (EMT) er blevet betragtet som et vigtigt skridt i udviklingen af ​​metastatisk cancer. For nylig er det blevet påvist, at HSA-MIR-103/107 indirekte nedregulerer MIR-200 familiemedlemmer, og at en sådan mønster er associeret med mesenchymale fænotype i brystcancercellelinier [24].

I vores undersøgelse mikroarrayet platform og Taqman assay isoleret både HSA-mIR-103 og HSA-mIR-200c. Vi ønskede at forstå, om, som i bryst metastatisk cancer, blev disse to miRNA omvendt korreleret i tyktarmen metastatisk cancer. Selvom ikke signifikant ved QRT-PCR, blev TMAs hybridiseret med HSA, MIR-200C sonde og scoret (fig. 2E). Sammenlignet med normale, blev en højere signalintensitet detekteret i adenocarcinomer (P-værdi = 0,0023) og positive lymfeknuder (p-værdi = 0,0006). En signifikant positiv korrelation mellem HSA-MIR-103 og HSA-MIR-200C var til stede i lymfeknudemetastaser (P-værdi = 0,0225), men ikke i adenocarcinomer eller levermetastaser. Derfor HSA-miR-103 og HSA-200c blev ikke omvendt korreleret, og regulerer ikke EMT i metastatisk tyktarmskræft

in vivo

, men blev begge overudtrykt i adenokarcinomer og lymfeknuder metastaser. Vi har ikke undersøge HSA-miR-107 eller andre medlemmer af miR-200 familie, fordi EMT ikke var relevante for formålet med vores undersøgelse.

Interessant, HSA-miR-31 ISH (data ikke vist) afslørede et meget stærkt signal i inflammatoriske celler, der omgiver tumorerne. En svagere farvning blev observeret i tumor og normale colon-celler, men kun få HSA-MIR-31 udtrykkende lymfocytter var til stede i normale lymfeknuder, hvilket antyder, at HSA-MIR-31 opregulering resulterede hovedsageligt fra den inflammatoriske snarere end fra den maligne komponent i tumor

tabel 1 beretninger antallet af sager med TNM mellemstationer, der blev analyseret på hver teknisk trin i vores undersøgelse.; Tabel 2 viser de microRNA signaturer opnået med hver teknisk procedure.

Diskussion

2009 AJCC udgave har udgivet en ny tyktarmskræft TNM klassifikation, hvor er underklasser blevet tilføjet til (N) nodal sygdom iscenesættelse. Andre forfattere har foreslået at erstatte disse N kategorier med antallet af positive lymfeknuder, og flere kirurgiske publikationer har foreslået en mere radikal lymphadenectomy bedre at definere prognose for at forbedre kolon kræftpatienter overlevelse [26] – [29]. Nodal invasion er et afgørende skridt til at definere kolon kræftpatienter prognose og terapi. Men 25% af lymfeknude-negative patienter oplever tilbagefald og ikke alle patienter med positive lymfeknuder har en dårlig prognose [30] – [32].

På den anden side, primær tumor spredning til leveren, er den største årsag til sygdomsprogression hos patienter med tyktarmskræft, med 15-30% af patienter, der lider synkrone hepatiske læsioner på tidspunktet for primær kolorektal operation, og, viser metachronous gentagelser efter aggressiv leverresektion [33] – [35].

det er således vigtigt at identificere nye molekylære biomarkører, der, sammen med TNM kan forbedre diagnose og klassifikation af patienter med metastaserende tyktarmskræft.

Formålet med denne undersøgelse var at identificere en microRNA signatur for metastatisk tyktarmskræft, der kunne skelne mellem lymfeknuder og levermetastaser.

i litteraturen har de fleste af de rapporterede microRNA’er kræft signaturer blevet identificeret og valideret på de samme vævsprøver. For at øge pålideligheden af ​​vores data, med undtagelse af de to første analyser blev hver validering trin udført på en anden gruppe af patienter.

Microarray og kort platforme gennemskåret data identificeret fjorten differentielt udtrykte microRNA, hvoraf fem blev godkendt af QRT-PCR. HSA-miR-21, -31, -93, -103 blev opreguleret i primære tumorer i forhold til det normale, mens HSA-miR-566 blev nedreguleret. HSA-MIR-93 og -31 blev også opreguleret i levermetastaser, men ikke i lymfeknuder er positive for metastase, hvorimod HSA-MIR-21 overekspression var tydelig i begge, lever og lymfeknuder metastase. Med undtagelse af HSA-MIR-31, in situ hybridisering (ISH) i colon adenokarcinomer og den tilsvarende tilstødende normale væv, såvel som dets nodal og levermetastaser væv microarrays, bekræftede de underskrifter identificeret af kortene og qRTPCR analyser. HSA-miR-31 er blevet fundet dysreguleret i flere primære epiteliale tumorer, hvor der ifølge tumorlokalisering, det synes at udløse forskellige cancer veje: det er opreguleret i nogle karcinomer [36] – [41], og nedreguleret i andre [42] – [45]. En sådan dobbelthed, er blevet fundet i invasive tumorer samt: i colon cancer-cellelinjer, er invasion fremmes af HSA-MIR-31 overekspression [46], [47], mens den i brystcancer-cellelinier, dens lave niveauer fremme et mere aggressiv adfærd [42], som korrelerer til en dårligere patient prognose.

Målrettede funktioner af HSA-mIR-31 indbefatter angiogenese, hvor dens opregulering øger blod, men ikke lymfekar spiring [48], og akut inflammation [49]. Vi fandt, at HSA-MIR-31 er hovedsagelig opreguleret i peritumorale inflammatoriske celler, sammenlignet med cancer og normale celler. , HSA-miR-31 dysregulation i primære aggressive tumorer er således en indiskutabel beviser, men samspillet af sine funktioner mellem inflammatoriske, neoangiogenic og tumoral metastatisk kontekst, behov, stadig, at blive belyst.

Hsa-miR -21 er en anden multitaske microRNA der har været impliceret i inflammation [50] – [53], immunsygdom [54] – [57], udvikling [58] – [61], angiogenese [62], [63], cancer og metastase [18], [64] – [82]. Flere undersøgelser har faktisk rapporteret sin overekspression i forskellige typer af tumorer, herunder kolorektal cancer, hvor dens niveauer korrelerer til klinisk progression, dårlig overlevelse og terapeutisk resultat [83], [84].

Efter aftale med vores tidligere undersøgelser og andres, QRT-PCR valideret HSA-miR-21 opregulering i colon adenokarcinomer og metastase i forhold til det normale. In situ viste hybridisering data en tendens: HSA-miR-21 niveauer var den laveste i normalt væv, og i stigende grad højere i adenocarcinom og metastase, i mellemtiden blev en lignende udtryk observeret i cancerceller noder og lever gentagelser, tyder på, at HSA-miR- 21 opregulering kunne forudsige en avanceret metastatisk sygdom.

som med HSA-mIR-31, høje niveauer af HSA-mIR-21 og -93 er beskrevet af andre forfattere i hepatocellulært carcinom [39], [85] , [86], og derfor kan de ikke anses som et diagnostisk forskellen signatur mellem levermetastaser og hepatocellulært carcinom

de ISH data for HSA-miR-93 helt overlappede de QRT-PCR-resultater:. en intens farvning blev påvist i primære colon adenokarcinomer og levermetastaser. Induceret overekspression af HSA-miR-93 blev vist: at være tumorigent in vitro og in vivo, at fremme overlevelse, men ikke spredning og forbedre neoangiogenese [87]. Endvidere steg HSA-MIR-93 niveauer, korrelerer til progression og nedsat patienter overlevelse i serøs ovariekarcinom [88] og kan forudsige tilbagefald brystcancer [89].

Men den eneste opreguleret validerede microRNA identificeret i vores underskrift, der kunne skelne mellem colon hepatisk metastaser og primær hepatocellulært carcinom var HSA-miR-103. Relevansen af ​​dette miRNA i kræft er blevet vurderet i bugspytkirtlen, blære, esophageal, mavesår og brysttumorer [29], [90] – [93]. Høje niveauer af HSA-MIR-103 blev korreleret til ringe overlevelse i esophageal cancer og er knyttet til metastatisk sygdom i bryst- og mavekræft. Især blev HSA-MIR-103 opregulering detekteret i gastrisk kræftpatienter med positive lymfeknuder. Tilsvarende i vores undersøgelse, QRT-PCR detekterede HSA-MIR-103 over-ekspression i primære tumorer samt metastatiske knuder og lever. Igen, ISH gav os mere specifik celle-of-oprindelse information: mens, var der ingen signifikante forskelle mellem primære tumorer og positive lymfeknuder, viste levermetastaser de højeste niveauer af HSA-miR-103 udtryk

I. vores undersøgelse, selvom ikke valideret af QRT-PCR, HSA-mIR-200C var en af ​​de valgte microRNA ved microarray og kort platforme. For nylig, HSA-miR-103/107 niveauer blev fundet omvendt korreleret til HSA-miR-200C i reguleringen af ​​Epithelial-til-Mesenchimal Transition i brystkræft [25]. For at teste om vi kunne etablere den samme korrelation i tyktarmskræft, vi udførte ISH af tyktarmen TMA med miR-200C sonde. Vi har ikke observere nogen negativ korrelation mellem de to miRNA. De var begge overudtrykt, men, HSA-MIR-200C blev kraftigt opreguleret i lymfeknuder nodal metastase sammenlignet med normal colon, adenocarcinomer og lever gentagelser. Dette antyder, at HSA-miR-103 og HSA-miR-200C ikke kontrollerer EMT i tyktarmskræft, og at høje niveauer af HSA-miR-200C er nødvendige for nodal invasion.

Hsa-miR-200C lever metastaser ISH scoringer viste høj variabilitet, der dækker de gennemsnitlige værdier af normalt væv, adenokarcinomer, og positive lymfeknuder. Nedregulering af HSA-MIR-200C er blevet foreslået som en karakteristisk signatur af primær leverkræft (hepatocellulært carcinom, intrahepatisk cholangiocarcinom og hepatisk angiosarcoma) fra levermetastaser af epitelial oprindelse [86], [94], mens dens opregulering i colon adenocarcinom har været forbundet til en dårlig prognose [95]. I vores undersøgelse blev HSA-miR-200C opregulering i nodal metastase bekræftet af ISH, men blev ikke valideret af QRT-PCR. Dette fund skyldes primært eksperimentelle og tekniske procedurer. Først brugte vi forskellige grupper af patienter til validering, som, selv om at give mere pålidelige ende data, indført mere variation i den eksperimentelle procedure. For det andet blev RNA kommer fra vores første mikroarrays patientgruppe, ikke udvundet af Mikrodissekterede paraffin indlejret væv og indeholdt variable andele af kræft og godartede omgivende væv, mens RNA og analyserede væv i QRT-PCR og ISH blev væv mikrodissekeres kerner med en større cancer komponent. Dog kan QRT-PCR ikke skelne fra godartede og /eller ikke kræftceller, mens ISH kan skelne mellem de forskellige typer af celler. Andre forfattere valideret deres data på de samme patienter, og RNA blev ekstraheret fra hele væv. Desuden til vores bedste viden, i litteraturen er der ingen undersøgelse rapporterer et så stort omfang microRNA ISH. Vi har vist, at ISH kan give meget nyttige celle specifikke oplysninger, hvilket tyder på yderligere microRNA

in vivo

funktioner til yderligere undersøgelser.

En vigtig nyhed i vores underskrift var HSA-miR-566. Tilsyneladende nedreguleret kun i adenocarcinomer i forhold til kontroller og metastatiske colon væv ved QRT-PCR, HSA-MIR-566 digoxigenin-mærket probe, blev svagt påvist i positiv lymfeknuder cancerceller, og lige så udtrykkes ved normal tyktarm, samt adenocarcinomer og levermetastaser, støtter tanken om, at ISH kan give os mere informative detaljer end microarrays eller QRT-PCR. Desværre, i litteraturen, er der ingen undersøgelse rapporterer HSA-miR-566 involvering i kræft, eller beskrive dets biologiske funktioner, som kunne hjælpe diskussionen af ​​vores data.