PLoS ONE: Helicobacter pylori Fremmer Epithelial-Mesenchymale Transition i Gastric Cancer ved at nedregulere programmeret celledød Protein 4 (PDCD4)

abstrakt

Helicobacter pylori

, en gram-negativ, mikroaerofil bakterie findes i maven, antages at være forbundet med carcinogenese, invasion og metastase i fordøjelsessygdomme. Cytotoksin-associerede gen A (CagA) er et onkogent protein på

H. pylori

der kodes af en Cag patogenicitet ø forbundet med udviklingen af ​​gastrisk cancer. Den epitel-mesenkymale overgang (EMT) er den vigtigste biologiske begivenhed i invasion eller metastase af epitelceller.

H. pylori

kan fremme EMT i humane gastrisk cancer cellelinjer, men de specifikke mekanismer er stadig uklar. Vi udforskede den underliggende molekylære mekanisme af EMT induceret af

H. pylori

CagA i mavekræft. I vores artikel, vi har registreret mavekræft prøver og tilstødende ikke-kræft prøver ved immunohistokemi og fundet forøget ekspression af EMT-relateret regulatorisk protein TWIST1 og mesenchymale markør vimentin i cancervæv, mens programmeret celledød faktor 4 (PDCD4) og epithelial markør E-cadherin ekspression faldt i cancer prøver. Disse ændringer blev associeret med graden af ​​væv malignitet. Derudover blev PDCD4 og TWIST1 niveauer relateret. I gastrisk kræftceller samdyrket med CagA ekspressionsplasmid, CagA aktiveret TWIST1 og vimentin udtryk, og hæmmede E-cadherinekspression ved nedregulering PDCD4. CagA forfremmet også mobilitet af gastriske kræftceller ved at regulere PDCD4. Således

H. pylori

CagA induceret EMT i mavens kræftceller, som afslører en ny signalvej af EMT i gastrisk cancer cellelinjer

Henvisning:. Yu H, Zeng J, Liang X, Wang W, Zhou Y, Sun Y, et al. (2014)

Helicobacter pylori

Fremmer Epithelial-Mesenchymale Transition i Gastric Cancer ved at nedregulere programmeret celledød Protein 4 (PDCD4). PLoS ONE 9 (8): e105306. doi: 10,1371 /journal.pone.0105306

Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA

Modtaget: 12. februar 2014 Accepteret: 21 Juli 2014; Udgivet: 21 August, 2014

Copyright: © 2014 Yu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Basic Research Program Kina (nr 973 Program 2012CB911202.), National Natural Science Foundation of China (nos: 81.171.536, 81.371.781, 81.272.654, 81.372.680 og 81.170.514), Medical Technology Development Program i Shandong (ingen . 2013WS0209) og den uafhængige Innovation Foundation of Shandong University (nr. 2012TS106). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Helicobacter pylori

(

H. pylori

) er en helix-formet, Gram-negativ bakterie forbundet med fordøjelsessystemet sygdomme, herunder kronisk gastritis, mavesår, mavekræft, og mucosal-associerede lymfoide væv lymfom.

H. pylori

er klassificeret som kræftfremkaldende af Verdenssundhedsorganisationen og Det Internationale Agentur for Kræftforskning (WHO /IARC) i 1994 [1], [2].

H. pylori

gener besidder et cytotoksin-associeret gen A (CagA) patogenicitet ø, der koder for det store virulens protein CagA og en type IV secerneringssystem (T4SS). CagA leveres til værtsceller ved T4SS og inducerer cancer dannelse og progression [3].

H. pylori

kan deregulere celleproliferation, påvirke den normale apoptotiske vej, indflydelse celleform, afskaffe forbindelsesepitop aktivitet og fremme en epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) fænotype efter den translokerer i værtscellen [4], [5].

H. pylori

effektor-protein CagA påvirker de fleste af disse veje.

In vivo Salg forsøg viste, at transgen ekspression af CagA kan forårsage flere maligniteter hos mus, herunder gastrisk epitel hyperplasi, myeloid leukæmi og B-celle-lymfomer, eller gastriske polypper og adenocarcinomer i maven og tyndtarmen [6]. Men den molekylære mekanisme

H. pylori

CagA interagere på værtsceller er stadig uklart.

EMT blev oprindeligt indregnet som en funktion af embryogenese, en vital proces til morfogenese under embryonale og hjerte udvikling. Men det bidrager også til vævsfibrose, tumorinvasion og metastase. EMT er karakteriseret ved flere forskellige træk, såsom tab af celleadhæsion, forøget celle mobilitet, modstandsdygtighed over for apoptose, og nogle egenskaber af stamceller. Med EMT, epiteliale markører, såsom E-cadherin show reduceret ekspression og mesenchymale markører, såsom vimentin show forøget ekspression. Andre regulatoriske molekyler såsom SNEGLEN, TWIST og SLUG show skiftede udtryk [7], [8], [9]. Onkogene veje, der kan fremkalde EMT omfatter transformerende vækstfaktor β (TGF-p), Src, Ets, Ras, Wnt /β-catenin, Notch, nuklear faktor-KB og integrin [10], [11], [12].

Infektion med den menneskelige patogene faktor

H. pylori

antages at føre til EMT, invasion eller metastase af mavekræft. F.eks opregulering af matrixmetalloproteinase 7 af patogene

H. pylori

delvist afhænger gastrin og kan have en funktion i udviklingen af ​​gastrisk cancer, potentielt gennem EMT, ved indirekte at inducerende niveauer af opløselig heparin-bindende endotelvækstfaktor [13].

H. pylori

CagA er involveret i invasion af tumorceller ved at deregulere c-met receptor signalering [14]. Samt CagA kunne øge aktiveringen af ​​Wnt /β-catenin signalvejen ved at forstyrre stabiliseringen af ​​E-cadherin-β-catenin-komplekset. , CagA spiller således en afgørende rolle i udviklingen af ​​intestinal metaplasi [15]. Desuden microarray analyse foreslog, at phosphorylering status CagA kan påvirke ekspressionen af ​​EMT-beslægtede gener i gastriske cancerceller [16]. Men lidt om de mekanismer, der ligger til grund for EMT induceret af CagA.

Programmeret celledød protein 4 (PDCD4) er lokaliseret til kernen i prolifererende celler [17]. Som et vigtigt posttransskriptionel mål for microRNA (MIR) MIR-21, PDCD4 er relateret til tumorprogression og prognose i human lunge, colorektal, bryst og gastrisk cancer [18], [19]. Tumorsuppressoren PDCD4 kan binde til eIF4A eller eIF4G og inhibere translation. PDCD4 kan regulere mitogenaktiveret protein 4 kinase 1 eller urokinaseplasminogenaktivatorreceptorfunktion (uPAR) ekspression til inhibering carcinom invasion og intravasation [20], [21]. PDCD4 kunne også påvirke transkriptionen af ​​gener. Det interagerer med DNA-bindende domæne af TWIST1 og inhiberer Y-box-bindende protein 1-ekspression [22]. Samt, er tab af PDCD4 udtryk forbundet med malign transformation i gastrisk kræft [23], [24]. Nedregulering af PDCD4 er relateret til tumor differentiering i fordøjelseskanalen cancere [25]. Men om PDCD4 er involveret i EMT induceret af CagA i mavekræft og den specifikke mekanisme stadig brug for yderligere udredning.

Her har vi udforsket reguleringen af ​​EMT-associerede proteiner og PDCD4 udtryk i mavekræft væv og CagA aktivering af TWIST1 udtryk og hæmning af E-cadherin og PDCD4 udtryk i gastriske kræftceller.

Materialer og metoder

Patienter og vævsprøver

undersøgelsen blev godkendt af den etiske Udvalg af Shandong University School of Medicine, og alle prøver og information blev samlet med skriftligt informeret samtykke. Gastric tumorvæv og deres matchede ikke-kræft væv blev høstet fra 30 patienter under operation på Qilu Hospital, Shandong University (Jinan, Kina) fra 2010 til 2012. Ingen af ​​patienterne havde fået adjuverende kemoterapi eller strålebehandling før operationen. Diagnose af gastriske cancere blev histopatologisk bekræftet af hematoxylin og eosin-farvning.

Cellekultur og transfektion

Humane gastriske cancercellelinier (AGS, BGC-823 og SGC-7901) blev opnået fra Kina Academia Sinica Cell Repository (Shanghai). Celler blev inkuberet i de anbefalede medier og en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C uden antibiotika. SGC-7901 celler og BGC-823-celler blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), og AGS-celler blev dyrket i F12-medium suppleret med 10% FBS. Medier og FBS blev købt hos Invitrogen (USA). Derefter blev celler forbigående transficeret med plasmider pCDNA3.1 eller pCDNA3.1-CagA (en gave fra Dr. Yongliang Zhu, Zhejiang University, Kina) og pEGFP-C1 eller pEGFP-C1-PDCD4 (konstrueret og leveret af Dr. Youhai Chen , Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, USA) ved hjælp af X-treme GEN HP Transfektion Reagent (Roche Diagnostics, Tyskland) i overensstemmelse med producentens protokoller.

RNA isolering, revers transkription og QRT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler ved anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, USA). Revers transkription involveret Superscript III First Strand Synthesis kit (Invitrogen). Ekspression af gener blev påvist ved brug af kvantitativ real-time PCR SYBR Premix Ex Taq (Takara, Kina) og normalisering involverede 2

– △△ ct metode i forhold til p-actin. Primersekvenser var for PDCD4, sense, 5′-CAGTTGGTGGGCCAGTTTATTG-3 ‘og antisense, 5′-AGAAGCACGGTAGCCTTATCCA-3′; E-cadherin, sense, 5’-AATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACA-3 ‘og antisense, 5′-TTGGGTCGTTGTACTGAATGGTC-3′; CagA, sense, 5’-CCGGGGTACCAATTGGAGAGCAGAACCG-3 ‘og antisense, 5′-CCGTCGAGTTAAGATTTTTGGAAACC-3′; og TWIST1, sense, 5’-GGCATCACTATGGACTTTCTCTATT-3 ‘og antisense, 5′-GGCCAGTTTGATCCCAGTATT-3′; vimentin, sense, 5’-CTCTTCCAAACTTTTCCTCCC-3 ‘og antisense, 5′-AGTTTCGTTGATAACCTGTCC-3′; SNAIL, sense, 5’-GGAAGCCTAACTACAGCGAGCT-3 ‘og antisense, 5′-TCCCAGATGAGCATTGGCA-3′; β-actin, sense, 5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 ‘og antisense, 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’.

Western blot-analyse

Protein blev ekstraheret fra prøver og separeret ved SDS-PAGE og derefter overført til PVDF-membraner (Millipore Corp., Billerica, MA, USA), der blev blokeret straks med 5% fedtfri mælk i TBST indeholdende 1% Tween-20 i 1,5 time ved stuetemperatur. Efter at være blevet vasket i phosphatpufret saltvand (PBS) 3 gange blev membraner inkuberet med antistoffer mod PDCD4 (1:500; Cell Signaling Technology, USA), TWIST1 (1:2000, Novus Biologicals, USA), snegle (1:1000 , Cell Signaling Technology, USA), CagA (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), E-cadherin (1:1000, Cell Signaling Technology, USA), vimentin (1:1000, Cell Signaling Technology, USA ), og β-actin (1:2000, Sigma-Aldrich, USA), som en normalisering kontrol, ved 4 ° C natten over, derefter med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer ved stuetemperatur i 1 time. Efter en vask blev immunreaktive bånd visualiseret ved forøget kemiluminescens (Millipore Corp., Billerica, MA, USA). Western blotting blev udført 3 gange for hver prøve. Protein blev lastet ved 20 til 50 ug per bane.

Immunhistokemi

Paraffinindstøbte vævsprøver blev de-paraffinized med xylen og dehydreret med en gradueret serie af alkohol. Antigen-genvinding ved varmebehandling udført i 0,1 M citratpuffer. Og blokerer den endogene peroxidase aktivitet blev brugt af 3% H

2O

2. Derefter Objektglassene blev inkuberet med antistoffer mod PDCD4 (1:200), Twist1 (1:500), vimentin (1:100) eller E-cadherin (1:500), og tilsvarende peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer og DAB for kerner. Antistoffer til immunohistokemisk farvning blev dem, der anvendes til western blot. Endelig blev hematoxylin anvendes til kontrafarvning objektglas. Tumor differentiering af kræft væv blev bestemt i et blindet måde. Det første antistof blev erstattet med phosphatbufret saltvand som negativ kontrol. Prøver blev set under et Nikon Eclipse E800 (Nikon, Tokyo, Japan) mikroskop.

Alle farvede sektioner blev observeret og scoret af 2 uafhængige blindede efterforskere, og glider fik en total farvning (SI) scorer efter farvningsintensiteten og procentdelen af ​​positive tumorceller. Farvningsintensitet blev gradueret som 0, ingen farvning; 1, svag farvning; 2, moderat farvning; og 3, stærk farvning. Tumor celle andel blev scoret som 0, ≤20% positive tumorceller; 1, 20% -40% positive tumorceller; 2, 40% -60% positive tumorceller; 3, 60% -80% positive tumorceller; og 4, ≥80% positive tumorceller. Ved at vurdere SI blev farvningsresultaterne endeligt som 0-4, lav udtryk; 4-6, moderat udtryk; og 6-12, høj ekspression. Hvis farvningen fortolkning afveg mellem efterforskerne, blev data for afsnittet kasseret.

Matrigel invasion assay

Matrigel invasion assay involverede en transwell kammer (Costar, New York, USA). SGC-7901-celler blev transficeret med 2 ug pCDNA3.1, pEGFP-C1; pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1; eller pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1-PDCD4. Efter 48 timer, 1 × 10

5 efter transficerede celler blev trypsineret og udpladet på transwell kamre belagt med 20 ug Matrigel. Medium indeholdende 20% FBS i det nedre kammer tjente som kemoattraktant, og det øvre kammer blev fyldt med medium indeholdende 10% FBS. Ikke-migrerede celler blev fjernet med vatpinde efter 24 eller 48 timer. Celler migrerer til undersiden af ​​filteret blev farvet med 0,1% krystalviolet og talt på et mikroskop. Endelig blev tilbageværende celler høstet til protein og RNA-isolering. Hver behandling blev gentaget 3 gange.

Statistisk analyse

Data er udtrykt som middelværdi ± SD. Student

t

test eller chi-square test blev anvendt til sammenligning 2 grupper. Dataanalyse involveret SPSS 12.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

1.. Angivelse af TWIST1, E-cadherin, vimentin og PDCD4 i mavekræft

For at undersøge sammenslutning af EMT og mavekræft, vi høstede 30 kliniske vævsprøver fra gastrisk kræftpatienter. Biopsier blev inddelt i midten /lav differentiering væv, høj differentiering væv og ikke-kræftvæv støder op til carcinoma af hematoxylin og eosin-farvning (Fig. 1A). På Immunhistokemi, TWIST1 og vimentin ekspression var højere i malignt væv end ikke-cancervæv, mens ekspressionen af ​​E-cadherin og PDCD4 var modsat den af ​​TWIST1 (fig. 1A-E). TWIST1 og PDCD4 ekspression var forbundet med graden af ​​tumor differentiering, men ikke køn eller alder (p = 0,021 og p = 0,013, tabel 1). Samt, faldt PDCD4 ekspression blev omvendt forbundet med ændret TWIST1 ekspression under gastrisk cancer (p = 0,035, tabel 2). Derfor kan EMT spille en vigtig rolle i gastrisk carcinogenese og udvikling.

(A) Hematoxylin og eosin-farvning bekræftede præoperativ diagnose og histologisk bedømmelse. Repræsentant immunhistokemisk farvning af TWIST1, SNEGLEN, PDCD4, vimentin og E-cadherin tydelig i tilstødende normale væv og høj differentiering kræftvæv og midt /lav differentiering kræftvæv. (B-E) Kvantificering af TWIST1-, SNAIL-, PDCD4-, vimentin- og E-cadherin- udtryk i normale og cancer væv. Det samlede antal prøver er 30, og hvert punkt repræsenterer en prøve. Vandret medium bar er middelværdi og knurhår er SD.

*

P

0,05 og

**

P

. 0,01 versus kontrol Vejviser

2. TWIST1, vimentin eller E-cadherin ekspression i gastrisk cellelinjer er reguleret af CagA

Dernæst undersøgte vi, om CagA, som en virulent faktor

H. pylori

, påvirkede EMT og derfor fremmet invasionen og metastase i mavekræft. Vi valgte 3 humane gastrisk cancer cellelinier af differentiering status (AGS, veldifferentieret gastrisk epithel cellelinie, SGC-7901, moderat differentieret cellelinje og BGC-823 dårligt differentieret cellelinje). CagA ekspressionsplasmid blev transficeret ind i forskellige gastriske cellelinjer. Skønt de morfologiske ændringer af CagA-transficerede celler ikke blev observeret (data ikke vist), blev ekspressionen af ​​transkriptionsfaktorer og cellemarkører påvirket af CagA. MRNA og protein ekspression af TWIST1 og vimentin blev opreguleret med CagA transfektion (fig. 2A-G) og af PDCD4 og E-cadherin blev nedreguleret (fig. 2A-G), men ingen signifikante ændringer i SNAIL ekspression blev observeret i CagA transfektion gruppe. Derfor

H. pylori

CagA kan påvirke EMT regulatorer herunder TWIST1. Endvidere E-cadherin, som en vigtig epithelial markør og vimentin, som mesenchymal markør reguleret af TWIST1, blev også påvirket af CagA, og EMT-relateret gen PDCD4 blev nedreguleret.

plasmid CagA fuld længde transficeredes i AGS, SGC-7901 og BGC-823 celler i 48 timer, og celler blev høstet for mRNA og western blot analyse. (A-C) Kvantitativ RT-PCR-analyse af mRNA niveau af PDCD4, EMT-relaterede transskriptionsfaktorer (TWIST1 og sneglen) og cellemarkører (vimentin og E-cadherin) i 3 gastriske cancercellelinier. Alle værdier blev normaliseret til p- actin mRNA i den samme prøve. (D) Western blot-analyse af protein niveau af CagA, TWIST1, snegle, PDCD4, vimentin og E-cadherin i kontrol- eller CagA-transficerede celler. (E-G) Western-blot densitometri blev kvantificeret (ImageJ) og niveauet af det angivne protein blev normaliseret for p-actin. De viste data repræsenterer gennemsnit ± SD af 3 uafhængige forsøg. *

P

0,05, **

P

. 0,01 versus kontrol

3. Angivelse af TWIST1, vimentin og E-cadherin var påvirket af PDCD4

Vi analyserede næste den molekylære mekanisme af EMT reguleret af

H. pylori

CagA i gastriske kræftceller. PDCD4 undertrykker cellevækst via en direkte interaktion med TWIST1 i human prostatacancer [22]. Immunhistokemi og statistisk analyse viste relevansen af ​​PDCD4 og TWIST1 eksisterede i gastrisk karcinom (fig. 1, tabel 2). Men mekanismerne bag PDCD4 funktion i gastriske cancerceller var ikke klart. Så AGS? GSC-7901 og BGC-823 celler vi transficeret med et plasmid af overekspression PDCD4. PDCD4 mRNA og proteinekspression blev opreguleret i alle plasmid-transficerede cellelinjer (fig. 3A-G). Desuden mRNA og protein niveauer af TWIST1 og vimentin, men ikke SNAIL blev nedsat i forskellig grad, og E-cadherin-niveauer blev forøget (fig. 3A-G). Derfor kan TWIST1, vimentin og E-cadherin ekspression reguleres af PDCD4 i gastriske epitelceller.

Plasmider af pEGFP-C1 og pEGFP-C1-PDCD4 blev hver transficeret ind AGS, SGC-7901 og BGC-823 celler i 48 timer og derefter celler blev høstet til isolering af totalt cellulært RNA eller protein. (A-C) QRT-PCR-analyse af mRNA niveau af TWIST1, snegle, PDCD4, vimentin og E-cadherin i AGS, SGC-7901 og BGC-823 celler. Alle værdier blev normaliseret for p-actin mRNA i den samme prøve. (D) Western blot-analyse af 5 målproteiner ekspression i kontrolceller og PDCD4 overekspression celler. (E-G) Western blot-resultaterne blev kvantificeret (ImageJ) og niveauet af target-proteinet blev normaliseret for p-actin. Data er gennemsnit ± SD fra 3 uafhængige eksperimenter. *

P

0,05, **

P

0,01 versus pEGFP-C1 con

4.. EMT er reguleret af CagA via hæmme PDCD4 i gastriske epitelceller

På baggrund af ovenstående resultater vi hypoteser, at EMT proces induceret af

H. pylori

CagA forekom ved nedregulering PDCD4, vi cotransficeret gastriske epitelceller med CagA plasmid og PDCD4 overekspression plasmid. Den faldt udtryk for PDCD4 blev genvundet med CagA og overudtrykt PDCD4 transfektion. Samt, blev den forøgede ekspression af TWIST1 og vimentin inhiberet og reduceret ekspression af E-cadherin blev opreguleret i cotransficeret gruppe. Disse ændringer forekom ved både mRNA og protein niveauer (fig. 4A-G). Migrationen af ​​human gastrisk cancercellelinie SGC-7901 transficeret med plasmider blev bestemt ved matrigel invasion assay. Resultater viser, at det blev induceret ved CagA plasmid. Cellemigrationsassay afslørede også, at PDCD4 overekspression nedreguleret CagA-induceret deres invasion og metastase evne (fig. 5A). Fig. 5B viser de migrerede celleantal af SGC-7901 i CagA transfektion gruppe er naturligvis mere end kontrolgruppen, mens mængden af ​​migrerede celler i co-transfektion gruppe er signifikant mindre end CagA transfektion gruppe. De biologiske fænomener demonstrerer EMT fremme af CagA blev genfundet i en del af forhøjet PDCD4 udtryk. På grundlag af beviser, det udledes, at PDCD4 kan være påkrævet for

H. pylori

CagA-medieret gastrisk cancer progression

Alle eksperimenter blev inddelt i tre grupper: 1). pCDNA3.1 + pEGFP-C1 (kontrol), 2) pCDNA3.1-CagA + pEGFP-C1, 3) pCDNA3.1-CagA + pEGFP-C1-PDCD4. Ifølge forskellige grupper, blev de tilsvarende plasmider transficeret i AGS, SGC-7901 og BGC-823 celler. Derefter blev cellerne høstet til mRNA og western blot-analyse. (A-C) QRT-PCR-analyse af mRNA niveau af TWIST1, snegle, PDCD4, vimentin og E-cadherin i gastriske cancercellelinier. Alle værdier blev normaliseret til p- actin mRNA i den samme prøve. (D) Western blot-analyse af CagA, TWIST1, snegle, PDCD4, vimentin og E-cadherin-protein-ekspression i alle celler. (E-G) Western blot-resultaterne blev kvantificeret (ImageJ) og normaliseret for p-actin. De viste data repræsenterer middel ± SD fra 3 uafhængige eksperimenter. *

P

0,05, **

P

0,01 versus con,

Δ

P

0,05,

ΔΔ

P

0,01 versus pEGFP + CagA

(A) forsøget blev inddelt i tre grupper:. 1) pCDNA3.1 + pEGFP-C1 (kontrol), 2) pCDNA3.1- CagA + pEGFP-C1, 3) pCDNA3.1-CagA + pEGFP-C1-PDCD4.The tilsvarende plasmider blev transficeret ind SGC-7901 celler ifølge forskellige grupper. Invasion og metastase evne af celler blev analyseret ved matrigel invasion assay. (B) kvantitative de migrerede celle numre af SGC-7901 i tre grupper. De viste data repræsenterer middel ± SD fra 3 eksperimenter. *

P

0,05 versus con,

Δ

P

. 0,05 versus pEGFP + CagA

Diskussion

vigtigste resultater af denne undersøgelse er sammenfattet som følger: 1)

H. pylori

CagA er ansvarlig for induktion af TWIST1 eller vimentin og inhibering af E-cadherin i gastriske cancerceller. 2) CagA-induceret epithelial-mesenchymal overgang er delvis afhængig regulering PDCD4. 3) TWIST1 og PDCD4 indebærer i EMT af mavekræft.

mavekræft er en multi-trins og gradvis sygdom. Overskydende proliferation af epitelceller er en vigtig del af den oprindelige tumor angiogenese eller tidlig vækst [5]. Efterfølgende celleinvasion, indledningsvis reflekteret gennem basalmembranen, blev betragtet som en prædiktor for den sidste fase af kræft; det i sidste ende fører til metastatisk spredning og dødelighed [26]. Patogene infektion kan forårsage kræft tumorgenese og malign transformation af værtsceller. Som en vigtig risikofaktor patogene,

Helicobacter pylori

blev tæt knyttet til mavesår sygdom, slimhinde-associerede lymfoide væv lymfom af maven, og gastrisk adenocarcinom [20], [27], [28], [29] . CagA, en af ​​de mest princippet virulensfaktorer af

H. pylori

, inducerer forekomst og udvikling af mavekræft. Malign transformation af værtsceller involverer i regulationary netværk, herunder adskillige celleproteiner, ikke- kodende RNA, og andre biologiske aktivitet molekyler. Men mekanismen underliggende CagA virkninger på maveslimhinden er så kompleks og uklar.

EMT er et højt konserveret biologisk proces på embryonale organudvikling, som tillader epitelceller til at miste epitelial fænotype og opnå mesenchymale fænotype. Dette omfatter tab af cellepolaritet i epitelceller, tab af evnen til at forbinde med basalmembran, adgang til mesenchymale fænotype såsom højere migration og invasion, anti-apoptose, og evnen til at nedbryde den ekstracellulære matrix [8], [30] . EMT spiller en væsentlig rolle i kroniske inflammatoriske sygdomme, fibrotiske sygdomme, tumor progression og genopbygning væv proces, især i køb af migration og invasion evne til maligne epitelceller. Unormal aktivitet i EMT epith af voksne epitelceller inhiberede celleadhæsionsmolekyler, forårsaget nedsat celleadhæsion kapacitet, og dermed aktiveret tumorceller at sprede sig i kroppen, i sidste ende fremme tumormetastase [31], [32], [33]. EMT anses derfor i begyndelsen af ​​invasion og metastase og er også et tegn på stærk evne invasion og metastase af tumorceller.

H.pylori

inducerer epitel-mesenkymale overgang af TNF-α inducerende protein [34]. Den aktuelle undersøgelse viser CagA kan føre epitelceller til morfologiske ændringer. Det er blevet foreslået, at CagA ekspression ikke kun var tilstrækkelig til at forstyrre apikale vejkryds men også ligne epitelial til mesenkymale overgang i Madin-Darby hunde nyre celler [35]. Epiteliale celler inficeret af bakterierne optrådte forskellige genomics ændringer, og påvirkningen af ​​EMT-markører induceret af

H. pylori

var sandsynligvis på en cagPaI-relateret måde. Data viste, at epitelial mesenkymale overgang (EMT) -relaterede gener var op- eller nedreguleret af CagA-positive

H. pylori

stammer i AGS [36], [37]. Notatet de lovgivningsmæssige netværk af CagA involverer i EMT af gastrisk kræft er stadig skal afklares.

For at undersøge specifikke mekanisme EMT fremmes af CagA i mavekræft, vi sammenlignet gener udtryk for tilstødende ikke- tumorvæv og gastriske carcinoma væv ved immunohistokemi. Resultaterne viste, at Twist1 /vimentin udtryk i carcinom væv var højere end tilstødende ikke-tumorvæv, og dens udtryk i midten /lav differentiering karcinom væv højere end høj differentiering væv. Men E-cadherin og PDCD4 faldt i færd med epitel-mesenkymale overgang i gastrisk cancer. Interessant, eksisterer det på en negativ korrelation til ekspression af TWIST1 og PDCD4. Vores undersøgelse foreslog EMT-relaterede gener er forbundet med processen med gastrisk cancer, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser observere tab af epitel protein og /eller erhvervelse af ekspressionen af ​​mesenchymale proteiner forekom i gastrisk karcinom. Desuden blev de henholdsvis korreleret til dårligt differentieret histologi, fremskredent stadium og dårlig patient resultat [38]. Desuden PDCD4 er en nyligt fundet molekyle, der spiller en afgørende rolle i mange biologiske processer, som kan forårsage sygdom eller forekomst og udvikling af tumor. PDCD4 hæmmer oversættelsesprocessen ved binding til translationsinitiering faktor eIF4A eller eIF4G. Forskellige inducere af apoptose stimulerer celler og opregulere ekspressionen af ​​PDCD4, hvilket yderligere kan regulere P21, Cdk4, carbonanhydrase II og JNK /c-Jun /AP-1. PDCD4 kunne inhibere invasion-relaterede urokinaseplasminogenaktivatorreceptorfunktion ekspression, invasion eller infiltration af blodkar, og metastase; derfor nedsat ekspression af PDCD4 spiller en vigtig rolle i tumor forekomst, udvikling og prognose [17], [33], [39], [40]. Så vi spekulerede på, om Twist1 og PDCD4 deltog i CagA-induceret EMT.

Så vi opdaget EMT-associeret transkriptionsfaktorer og markører udtryk i CagA-transfekterede mavekræft cellelinjer. Vores data viser, at

H. pylori

CagA kunne opregulere ekspressionen af ​​TWIST1 og vimentin men ikke SNEGLEN, og nedregulerer E-cadherin og PDCD4 i gastrisk cellelinier (AGS, SGC-7901 og BGC-823). Resultaterne blev ikke påvirket af differentiering status transficerede celle. Selvom vi ikke observere morfologiske ændringer af CagA-transfekterede celler, kunne invasion og metastase evne gastriske cancerceller fremskyndes ved CagA via transwell celle invasion assay. Dette er delvist forårsaget af den funktionelle heterogenitet CagA i forskellige væv. Så effekten af ​​EMT induceret af

H. pylori

stadig behov for at blive undersøgt nærmere. MIR-21 fremmet TGF-β-induceret myofibroblastdifferentiering proces ved at målrette PDCD4. TGF-β inducerede MIR-21-ekspression i fibroblaster og mir-183 nedreguleret PDCD4 og hæmmede TGF-β-induceret apoptose i humane hepatocellulære carcinomceller [41], [42]. I mellemtiden, TGF-β reguleret SNEGLEN, TWIST, eller ZEB1 og påvirkede EMT og metastase [43]. Desuden blev PDCD4 fundet at være involveret i transkription også. Faktisk blev COOH terminalen af ​​Twist1 indeholder den grundlæggende helix-loop-helix domæne foreslået, at medierede den direkte interaktion med PDCD4 proteiner. Så PDCD4 interagerer med DNA-bindende domæne af Twist1 og inhiberer dets DNA bindende evne til at målrette gener i humane prostatacancerceller [22] .Derfor vi yderligere testet, om PDCD4 kunne regulere TWIST1 i gastriske cancerceller. Vores undersøgelse viste, at TWIST1 ned var reguleret af PDCD4 høj ekspressionsplasmid ved real-time PCR og western blotting, mens E-cadherinekspression var modsat TWIST1 i AGS, SGC-7901 og BGC-823. MRNA ekspressionen af ​​SNEGLEN blev nedreguleret i AGS og SGC-7901, mens preotein udtryk ikke blev observeret de samme ændringer. Det kan skyldes kompleksiteten af ​​proteinsyntese. Det vil sige, protein reguleres ikke kun på transkriptionsniveauet men også oversættelse og vendes niveau. Det lejlighedsvis tilsyneladende mRNA er ikke en direkte indikation af proteinniveauet i celler. Sidste, vi udført yderligere forskning på rolle PDCD4 i CagA-induceret epithelial-mesenkymale overgang. Gastriske epitelceller blev transficeret med CagA ekspressionsplasmid og PDCD4 overekspression plasmid samtidigt. Restaurering af PDCD4 udtryk kunne hæmme TWIST1 og vimentin, og fremkalde E-cadherin, som reguleres af CagA, PDCD4 blev også certificeret som kan påvirke invasionen og metastase evne i gastriske celler ved matrigel invasion assay. Selv bliver behov for yderligere undersøgelser for at teste denne hypotese, konkluderede vi dybest set, at CagA-induceret epithelial-mesenkymale overgang er delvist afhængig af at regulere PDCD4.

Sammenfattende viser vi, at

H. pylori

CagA fremkalde TWIST1 udtryk og EMT i gastriske kræftceller ved at regulere PDCD4 (fig. 6). Vi leverer en vis indsigt i den molekylære netværk af mavekræft induceret af

H. pylori

infektion, og levere et teoretisk grundlag for PDCD4 som et biologisk mål for diagnose eller behandling af cancer. Fremtidige forskning involverer musemodeller kan føre til en bedre forståelse af den rolle PDCD4 i

H. pylori

induceret EMT af mavekræft.

H.