PLoS ONE: Følsom og Specific Biomimetic Lipid Coated Microfluidics at isolere levedygtig Cirkulerende tumorceller og Microemboli for Cancer Detection

Abstrakt

Her har vi præsenteret en enkel og effektiv membran mimetisk mikrofluidanordning med antistof konjugeret understøttet lipid dobbeltlag (SLB) “smart belægning” at fange levedygtige cirkulerende tumorceller (CTCs) og cirkulerende tumor microemboli (CTM) direkte fra fuldblod af alle stadie patienter kliniske cancer. Den ikke-covalent bundet SLB kunne fremme dynamisk gruppering af lipid-tøjret antistoffer mod CTC antigener og minimeret uspecifik retention blodceller gennem sin ikke-fouling karakter. En svag strøm yderligere skyllet væk løst bundne blodceller at opnå en høj renhed af CTCs, og en strøm af luft skum indsprøjtes sønderdele SLB samlinger for at frigive intakte og levedygtige CTCs fra chippen. Menneskeblod spiked kræft cellelinje test viste ~ 95% samlet effektivitet til at genvinde både CTCs og CTMs. Levende /dead assay viste, at mindst 86% af genvundne celler opretholde levedygtighed. Ved at bruge 2 ml perifert blod blev CTCs og CTMS tællinger af 63 sunde og kolorektal cancer donorer positivt korreleret med kræft progression. Sammenfattende blev en enkel og effektiv strategi udnytter biomimetiske princip udviklet til at hente levedygtige CTCs til optælling, molekylær analyse, samt

ex vivo

kultur over uger. På grund af den høje følsomhed og specificitet, det er første gang at vise den høje opdaget og mængde CTCs i ikke-metastatiske kræftpatienter. Dette arbejde giver værdierne i både tidlig kræft opdagelse og prognose af CTC og giver en nøjagtig ikke-invasiv strategi for rutinemæssig klinisk undersøgelse på CTCs

Henvisning:. Chen JY, Tsai WS, Shao HJ, Wu JC, Lai JM, Lu SH, et al. (2016) følsomme og specifikke Biomimetic Lipid Coated Microfluidics at isolere levedygtige Cirkulerende tumorceller og Microemboli for Cancer Detection. PLoS ONE 11 (3): e0149633. doi: 10,1371 /journal.pone.0149633

Redaktør: Jeffrey Chalmers, The Ohio State University, USA

Modtaget: September 29, 2015; Accepteret: 2 februar 2016; Udgivet: 3 mar 2016

Copyright: © 2016 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Science Council (nu Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan) kontrakt: NSC101-2113-M-001 til 021 -MY2, NSC102-2321-B-001-060, MOST-103-2321-B-001-042, og Summit Program fra Academia Sinica, Taiwan under 104-0210-01-09-02. Dette arbejde blev også støttet af Taiwan Ministeriet for Sundhed og Velfærd (Welfare Tillæg på tobaksvarer), No.CMRPG3C1141. J. M. Lai blev støttet af Academia Sinica Postdoc Fellowship 2013-14. J.Y. Chen blev støttet af MEST-103-2811-B-001-132. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og fortolkning af data, beslutning om offentliggørelse, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret ikke konkurrerende interesser

Introduktion

Metastase er den vigtigste årsag til tilbagefald og mortalitet hos patienter med solide tumorer-verdensplan. Det menes, at når den primære tumor er etableret, vil yderligere mutationer og mikromiljøet interaktioner af kræftcellerne fremme formidling for cancermetastase. Den epitel-mesenkymale overgang (EMT) er blevet impliceret som ansvarlig for udgydelse af tumorceller fra vedhængende epitelceller i prækliniske modeller [1]. Intravasation af epitelial oprindelse primære kræftceller vil give kræftcellerne cirkulerer i blodet som cirkulerende tumorceller (CTCs) gennem migration /invasion progression. Den formidles CTCs kan således rejse en vis afstand og kolonisere på sekundære sites for metastatisk tumor etablering. Men den mekanisme af kræft metastaser er stadig uklar og opfattelse af formidling kræft som CTCs fortsat en udfordring. CTCs er undvigende til påvisning på grund af den ekstremt sjældne befolkning i omsætning af de kræftpatienter. Det kunne være så få som kun 1 ~ 1000’erne CTCs ud af milliarder af blodlegemer i symptomatiske kræftpatienter. På trods af sin sjældne befolkning, er mængden af ​​CTCs i blodet vist at korrelere med dårlig prognose af de metastatiske cancerpatienter [2], og resultaterne af kemoterapi i bryst-, prostata-, og melanom kræftpatienter [1,3,4]. Disse undersøgelser viste, at overvågningen af ​​CTC tæller kan være nyttige til tidlig opdagelse og effekt følges tæt under behandlingen.

For nylig viste ny dokumentation, at tilstedeværelsen af ​​cirkulerende tumor microemboli (CTM) er stærkt forbinder med fjernmetastaser. I sammenligning med tilstedeværelsen af ​​enlige CTCs alene tilstedeværelsen af ​​CTMs korrelerede godt med dårlig prognose i metastatisk bryst-, prostata-, og småcellet lungekræft, [5,6]. Det er blevet foreslået, at celleaggregater, såsom CTMs, tilvejebringe en celle-celle adhæsion fordel mod forskydningsspænding i blodstrømmen og aktiverer signalering for anti-apoptose og beskyttelse mod anoikis [5]. Bevis for kollektiv bevægelse i primære tumorceller via en β1-integrin-afhængig måde giver mulighed for kaste CTMs i blodet [7]. Opgivelse af plakoglobin-medieret celle-celle-interaktion resulterer i et fald i CTMs i blodet og korrelerer med bedre prognose [6]. På trods af den betydelige rolle CTCs, rolle CTMs og samspillet mellem CTCs og mikromiljø under kræft progression er stadig uklart. Optælling og karakterisering af de identificerede /oprensede CTCs fra kræftpatienter vil afdække karakteren af ​​CTCs /CTMs i kræft progression. Etablering af et CTCs capture system, der tillader høj følsomhed, specificitet, og levedygtighed for både CTCs og CTMs vil give stor gavn for diagnostik og behandling af patienter kliniske cancer.

Forskellige teknologier har oplyst CTCs berigelse og identifikation baseret på forskellige principper, herunder immuno-magnetisk isolering [8-14], celle-størrelse baseret filtrering [15,16], antistof-funktionaliserede mikrofluidenheder [17-21], fiberoptisk matrix scanning teknologi [22], dielektroforese, passiv celle sortering [23], negativ selektion [24,25], ensemble-beslutning alikvot ranking [26], nano-ru friktion [27], termo-responsive polymer belægning [28], eller kombinationer af ovenstående [29,30] . Nogle af disse teknologier viste bedre følsomhed end andre, herunder anekdotiske undersøgelser i ikke-metastatiske sygdomme [31]. Men næppe nogen har vist klinisk anvendelighed i rutinemæssige detektion af CTCs for alle-faser af kræft, da dette kræver en meget følsom og specifik platform til at isolere og bevare patient-afledte CTCs til yderligere undersøgelse.

Af alle de affinitet baserede metoder, mikrofluidenheder dukker op som lovende redskaber til effektivt at isolere sjældne celler, herunder CTCs og stamceller [18,32-34]. Den største udfordring for denne lovende platform er at frigøre og gendanne de isolerede målceller med biologisk aktivitet [35]. Ved at bruge enzymatisk nedbrydning, kan frigivelse af tilfangetagne celler forstyrre cellemembranen, nedbryde overflademarkører, og ændre både fænotypiske og funktionel information af CTCs, hvilket begrænser de nedstrøms analyser af celler [34,36]. Endvidere selvom strømmen induceret celle løsrivelse viser god genvinding effektivitet fra 60% til 90% [37-39], den 50 til 200 dyn /cm

2 høj forskydningsspænding er nødvendig for at frigøre celler ved at bryde antistof- celleoverfladeantigen obligationer [40]. Så store kræfter, som ændrer genekspression og muligvis føre til fænotypiske ændringer og celledød [32,41,42]. Boble-induceret frigørelse af affinitets-adsorberet blodlegemer, hvilket gearing luft-væske grænsefladespænding udøves på klæbet celle at udrydde den fra overfladen hvor 90 til 100% frigivelse effektivitet i mikrostruktur-fri lige kanaler. Imidlertid har lav cellernes levedygtighed og usammenhængende genanvendelsesprocenter ikke været ordentligt behandlet [43-45].

Blandt disse undersøgelser dog overflade virkninger er blevet overset. Begrebsmæssigt en “ikke-tilsmudsning” overflade, dvs. en overflade med minimal fysisk interaktion med celler, kunne reducere forskydningsspænding kræves for at skylle væk uspecifikt adhærerede celler og give mulighed for at reducere den kraft, der er nødvendige for celle desorption. Desuden en belægning designet med svag binding til overfladen, såsom fysisorption kunne give ikke-forstyrre spaltningsprodukter punkter (de svageste links), når udøver grænsefladespænding (såsom luftbobler). Evnen til at afbryde overfladebelægningen forhindrer direkte spaltning af cellemembranreceptor obligationer, som oftest resulterer i cellebeskadigelse. I denne meddelelse beskriver vi en smart belægning i en mikrofluid platform, der giver “ikke-fouling” ejendom for at øge afvisning af uønskede materialer i blodet og de “svageste led” for celle frigivelse. Her rapporterer vi det understøttede lipid dobbeltlag (SLB) belagt mikrofluidsystem, CMX platform ( “Celler fanget i Maximum”), og vise sig at være yderst følsom og specifik til at indfange både enkelt CTCs og CTMs og funktion med nem-at-release platform for erhverve levedygtige CTCs; alle kræver kun 2 ml fuldblod. En klinisk undersøgelse omfattende opregning af både CTCs og CTMs baseret på 9 raske donorer bekræftet af koloskopi og 54 patienter med trin I til IV i kolorektal cancer (CRC) bekræftede yderligere den overlegne følsomhed og kliniske anvendelighed af fluidik lipid belagt platform. Samtidig patient-afledte CTC kultur og mutation analyse, yderligere forbedret mulighederne og nytte for både grundforskning og klinisk behandling af CMX-platformen.

Materialer og metoder

Mikrofluid Chip Forberedelse og Overfladebehandlinger

det er beskrevet som fremstilling af brugerdefinerede antistof-konjugeret SLB (Ab-SLB) belagt mikrofluide chips, den CMX platformen følger: En kommerciel CO

2 laser SCRIBER (Epilog Helix 24, Golden, CO) er anvendes til at skabe micropatterns på poly (methylmethacrylat) (PMMA) slide (size = 76 mm x 25,4 mm, tykkelse = 1,5 mm). Laseren bruges også til at gravere en 63 um tyk dobbelt-side tape (8018PT, 3M Corp., Maplewood, MN) at skabe sig grænserne omkring de mikrofluide mønstre på PMMA. De microtrenched mønstre og mikrostrukturer på PMMA slide blev trukket ved hjælp af CorelDraw (Corel, Ottawa, Canada) og derefter overført til laser SCRIBER til direkte bearbejdning på underlaget. I denne undersøgelse seks typer af chips var forberedt. De graverede chips blev bundet med plasmaet behandlede objektglas ved at placere skåret ud 3M tape (klemt) mellem toppen (PMMA slide) og et objektglas i bunden til dannelse af forseglede kanaler. Fremstillingen af ​​lipidvesikler, biotinylering af antistof af EpCAM, EpAb4-1, og den sekventielle fremstilling af anti-EpCAM-understøttet lipiddobbeltlag belægning i mikrofluid chip blev beskrevet tidligere [46]. I korte træk blev de indre vægge af de mikrofluidkanaler behandlet med lipidvesikler bestående af 1-palmitoyl-2-oleoyl

sn

glycero-3-phosphocholin (POPC) og 1,2-dipalmitoyl

sn

glycero-3-phosphoethanolamin-N-cap-biotinyl (b-PE) i molære forhold på 95/5 til dannelse SLB. Til fluorescens-konjugeret SLB (Texas Red-SLB) blev de mikrofluidkanaler overtrukket ved lipidvesikler bestående af POPC, b-PE, og Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (Texas Red-DHPE; ThermoFisher videnskabelige, Waltham, MA) i molforhold på 94,5 /5 /0,5 følger de samme procedurer i lipidvesikler forberedelse. Efter fjernelse af overskydende lipider, blev Neutravidin ™ (NA) konjugeret til b-PE i SLB via NA-biotin anerkendelse, efterfulgt af konjugering af biotinyleret EpAb4-1 (b-EpAb4-1) til NA at fuldføre overfladen formation .

Cell linje brugt og Cell Culture

Den menneskelige kolorektal cancer HCT116 og pancreas ductal adenocarcinom cellelinie AsPC1 blev oprindeligt købt hos Bioresource Indsamling og Research center (BCRC, Taiwan) og anvendt som EpCAM positive cellelinie. Cellerne blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM i HCT116, Gibco, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) eller RPMI-1640 (for AsPC1; Gibco) med 1% antibiotisk-antimycotisk (ThermoFisher Scientific) og 10% føtalt bovint serum ( FBS, Gibco) under 5% CO

2 fugtig atmosfære. De HCT116 cancerceller blev præ-farvet med CellTracker Green CMFDA farvestof (Life Technologies, Carlsbad, CA) eller ektopisk ekspression af rød fluorescens protein (RFP), før standardtilsætningsforsøg. Kuglen dyrkningsmedium (SPH-medium) blev formuleret som 10 ng /mL epidermal vækstfaktor (EGF, Gibco), 10 ng /mL fibroblastvækstfaktor (FGF, BD Biosciences, San Jose, CA), 10 ng /ml insulin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), og B27 (Gibco) i serumfrit DMEM-medium. De eluerede levedygtige celler blev derefter dyrket enten under komplet DMEM medium eller SPH medium med normal fastgørelse dyrkningsskål (Corning, Corning, NY) eller suspensionskultur ved anvendelse af en ultralav fastgørelsesplade (Corning). Levende /Dead assay (Life Technologies) blev udført ved at følge producentens instruktioner. Den HS68 hudafledte nontumorigene human fibroblast-cellelinje blev opretholdt i lav-glucose DMEM-medium (Gibco) med 1% antibiotika og 10% FBS. For en bestemt cellelinje i dette manuskript, blev HCT116 og AsPC1 oprindeligt købte fra Bioresource Indsamling og Research Center (BCRC, Taiwan).

Capture Kontrol af CMX Platform

capture effektivitet af CMX platformen blev karakteriseret ved anvendelse af human colorektal cancercellelinie HCT116. HCT116 enkeltceller pre-farvet med CellTracker Green CMFDA (Life Technologies) blev tilsat til glas-bund (Diameter: 6 mm, højde: 5 mm) og 10 min fik lov til cellerne til at bundfælde sig. De godt bunde blev afbildet før og efter cellerne blev overført til fuldblod tappet fra raske personer ved fluorescens mikroskopi (Leica AF 6000 Advanced Fluorescens Imaging-system) for at sikre nøjagtige tæller. Det faktiske antal spidse celler blev defineret som (celletal i godt før overførsel) minus (celle forbliver i godt efter overførsel nummer). Efter korrekt, forsigtig blanding blev celle-blod-blandingen strømmet gennem de funktionaliserede mikrokanalplade under strømningshastighed på 1,5 ml /time. Bagefter blev mikrokanalplade vasket med 0,5 ml phosphatpufret opløsning (PBS) under 4 ml /h strømningshastighed og farvet med 0,3 ml Hoechst-opløsning (1 pg /ml i PBS) i kerner plet. Kanalen blev fotograferet under fluorescensmikroskop (Leica DM16000B) at optælle det totale antal celler fanget i kanalen. Cancerceller indfange ydeevne defineret som forholdet mellem antallet af HCT116 celler bundet på chippen til antallet af celler, der sendes til chippen. Til test af fangst og frigivelse effektiviteten af ​​klyngen celler blev ufuldstændig fordøjet HCT116 celler udvalgt af mikromanipulator under mikroskop som tidligere beskrevet [6] og blev direkte tilsat til CMX-platformen. For både cellelinie og kliniske prøver validering blev CTCs og CTMs fanget under samme forsøgsbetingelser med samme indsprøjtningsstrømningsstørrelsen (1,5 ml /h) og PBS rensningsgrad (4 ml /h).

immunfluorescensfarvning

de indfangede celler, der frigives fra chippen på filtermembranen, blev fikseret med 4% paraformaldehyd, permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS, og blokeret med bovint serumalbumin (Millipore, Bedford, MA). Efterfølgende blev celler farvet med kanin-anti-human cytokeratin 20 (CK20; Abcam, Cambridge, UK) og rotte-anti-humant CD45 (Abcam) natten over ved 4 ° C efterfulgt af PBS vask. Efter PBS vask blev cellerne inkuberet med det FITC-konjugerede gede-anti-rotte-IgG-antistof (Abcam) og Alexa Fluor

® 568 anti-kanin IgG-antistof (Life Technologies) i 1 time ved stuetemperatur, blev de overskydende antistoffer fjernes derefter PBS vask og fotograferet af fluorescensmikroskop (Leica DM16000B). For immunfarvning af fibroblastceller, α-glatmuskelactin (α-SMA, DAKO, Danmark) og fibroblastvækstfaktor-receptor (FGFR, Abcam) blev anvendt som fibroblast markører.

etiske retningslinjer og kliniske prøver Collection

perifere blodprøver blev opnået fra 54 CRC patienter med trin I (n = 11), II (n = 13), III (n = 12) og IV (n = 18) med ingen forudgående cancerterapi og tyktarm sygdomsfrie donorer (n = 9) som negative kontroller blev indbefattet i en dobbelt blindet, prospektivt studie (31 kvindelige og 32 mandlige). I alt 2 ml prøve af helblod blev opsamlet ved ethylen-diamin-tetra-eddikesyre (EDTA) vakuumbeholderrør (BD Biosciences) fra hver patient og blev anvendt til både CTC og CTM indfangning på vores platform til yderligere analyse. CRC patienter blev accepteret i denne undersøgelse ikke har nogen kræftbehandling forudgående, modtager blod tegne før operationen på samme dag eller en dag før operationen. De sunde donorer blev bekræftet ved koloskopi undersøgelse uden kolon sygdom og modtog blodprøve før proceduren. Gennemsnitlige alderen patienter og raske donorer er 62 og 47 år, hhv. Patienterne blev rekrutteret fra juni til oktober 2012 i Chang Gung Memorial Hospital, Linkou, Taiwan. Alle prøver blev behandlet i Academia Sinica, Taipei, Taiwan. Den kliniske status og CTC resultater blev dobbelt-blindet. Undersøgelsen protokol, herunder eksperimenterende design og ydeevne med denne undersøgelse var klart beskrevet og blev revideret og godkendt af Institutional Review Boards of Academia Sinica (AS · IRBOI-12040) og Chang Gung Memorial Hospital (100-1023B). Den skriftlige informerede samtykke blev opnået fra alle patienter, herunder raske frivillige og CRC patienter før undersøgelsen.

Molekylær Analyse

I alt 7 mutation hotspots i KRAS (G12V, G12D), p53 (R248W, R175H , R248Q), og APC (E1309fs * 4, 1556fs * 3) mutation status blev detekteret ved kommercielt tilgængeligt TaqMan® mutationsdetektion assay (Life Technologies) ifølge producentens instruktion. Kort fortalt assayet anvender konkurrencedygtige allel-specifik TaqMan PCR (castPCR teknologi). Hver vildtype eller mutant allel assay blev sammensat af en modificeret eller umodificeret allelspecifik forward primer, locus-specifik TaqMan® probe, locus specifik revers primer og allelspecifik MGB blokker. Hver testprøve blev kørt med en mutant allel assay (er) og det tilsvarende gen henvisning assay. Resultater blev analyseret med Seq Detection System version 2.3 til at generere værdierne af CT

mål- og CT

reference. Den detekterede ACt afskæringsværdi blev anvendt til at bestemme grænsen for procent mutation i en prøve, at mutant allel assayet kan detektere. Konverteringen formel mellem% og ACt er 2

– (ACt) × 100%. Mutantallelen analysesensitivitet var 0,1%. Derfor er værdien af ​​ACt ≤ 9,96 betragtes som positiv, og værdien af ​​ACt 9.96 som negativ.

Statistisk analyse

Capture effektivitet blev rapporteret som middelværdi ± standardafvigelse. Gruppediskussionerne midler blev sammenlignet ved en uafhængig t-test. Forskelle blev betragtet som signifikante ved et konfidensniveau på 95% (

s

0,05).

Resultater

Strategi for CTCs og CTMs Capture, Rensning, og Release

capture, oprensning, og strategi frigivelsen udnytter SLBs at inkorporere native-state proteiner [46-53] og fungere som forbindelsesled mellem den indre væg af mikrofluid chip og antistof. De biomimetiske SLBs sagens natur skabe en smørende lag afvise blodkomponenter ( “ikke-fouling”), og bistå antistof mobilitet til at danne en fremragende celle capture platform. I dette arbejde, et lag af antistof til epitel celleadhæsionsmolekyler (anti-EpCAM), klone EpAb4-1, konjugeres til de SLBs til selektive CTCs indfange [46]. Tidligere undersøgelser har vist, at protein-konjugeret SLBs kan skabe en fremragende cellesortering og kultur platform; desuden den laterale fluiditet SLBs muliggør gruppering af proteiner og dermed øge bindingsaffiniteten og specificitet til målcellerne [47,49]. Derudover zwitterioniske karakter lipidmolekyler i SLB minimerer yderligere ikke-specifikt protein og /eller celler adsorption [48,49,54-56], og derved reducere tilsmudsning af overfladen af ​​perifert blod. Vi indarbejdet anti-EpCAM-SLB overflade i en mikrofluid chip med ætset mønster designet til at forbedre kaotisk blanding [57]. Ved at styre fluidstrømmen parametre, vi først fange CTCs på overfladen og derefter forøge strømningshastigheden af ​​buffer at mindske ikke-specifikke adsorberet blodlegemer uden at forskyde nogen af ​​de bundne CTCs (Fig 1A). Endelig er oprensede CTCs elueres fra chippen via forstyrre SLB samling, ikke cellemembranen eller proteinbindingssteder, af en blid feje af luft skum. Denne kombinerede strategi er i stand til at udføre separation og oprensning af CTCs, efterfølgende at tillade dem at blive frigivet forsigtigt i længere nedstrøms molekylær analyse eller dyrkning. Oversigten og indstillingen af ​​CMX plarform blev vist i figur 1B.

(A) Strategier til at fange, rense og slip CTCs af CMX-platformen. I den øverste række, blod strømmer gennem en mikrofluid kanal overtrukket med anti-EpCAM konjugeret til NeutrAvidin som er klæbet til et SLB lag på substratet. Selektiv binding af CTCs til anti-EpCAM er styrke af antistoffet clustering virkninger gennem mobiliteten af ​​strømningstekniske SLB laget, mens andre blodceller er let flush væk fra strømningstekniske overflade. Den nederste række viser frigivelse proces, hvor indførte luftbobler forstyrre de svageste led mellem substrat og SLB lag tillader elueres intakte CTCs for indsamling uden for mikrofluid chip. (B) Oversigt over CMX platform og resumé af CMX platformen workflow. Ca. 2 ml af hele blodprøver opnået frisk fra CRC patienter blev indlæst ligeligt i hver CTC fangstanordninger. Alle chips gik gennem celle capture, oprensning, og udgivet til forskellige downstream-applikationer, herunder immunfluorescensfarvning, celletælling, molekylær analyse,

ex vivo

cellekultur og /eller cryobanking.

effektivitet af Target Cell Indbinding og Capture

de indre vægge af mikrofluide kanaler blev ændret ved lipidvesikler bestående af POPC og b-PE og konjugeret af b-EpAb4-1 via NA-biotin anerkendelse [46]. En række mikrofluide chips med forskellige strømningsbaner, dimensioner og mikrostrukturer blev fulgt med den samme overflade modifikation (figur 2A). Human colorektal cancercellelinie HCT116 pre-farvet med CellTracker Green CMFDA blev derefter tilsat til 1 ml fuldblod tappet fra sunde individer i EDTA-rør til målcelle capture i en funktionaliseret mikrokanal og fulgt med PBS oprensning og Hoechst nuklear farvning. Den totale mængde af kræftceller fanget af chippen blev derefter afbildet og optælles under et fluorescensmikroskop. De dobbeltstrengede positive celler med både CellTracker Green og nuklear farvning blev identificeret som cancerceller. De enkelte positive plet kun celler nukleare blev identificeret som uspecifikt bundne hvide blodlegemer (WBCs). Indfangning ydeevne blev defineret som forholdet mellem antallet af HCT116 celler bundet på chippen til det totale antal celler tilsat til chippen [21].

(A) Geometrien og mønstre af 6 forskellige mikrofluide kanal designs (til venstre) og capture effektiviteten af ​​disse mikrofluide platforme (til højre), som defineret ved at dividere indfangede celler i forhold til samtlige spidse celler. (B) De beskåret fluorescerende billeder (5,5 mm x 5,5 mm) inde i flowet kanal og tælling af HCT116 (grøn) og WBCs (blå) på Ab-SLB eller Ab-silan belagt Type E chips. (C) Cellefrigørelse effektivitet (%, Y-akse) versus strømningshastigheder (ml /h, lavere x-aksen) og den tilsvarende forskydningsspænding (øvre X-aksen). Flowhastigheder er generelt holdes under 4 ml /h for at undgå enhver potentiel tab af tilfangetagne CTCs. (D) Meget CTM opsamling og nyttiggørelse effektivitet Ab-SLB belagt chip. Tilfangetagelsen effektivitet og recovery rate af HCT116-RFP genereret tumor microemboli blev viste i højre panel. De frigivne HCT116-RFP CTC klynger med DAPI farvning blev viste i venstre panel. *:

s

0,05; **:

s

0.01.

Fig 2A illustrerer geometri og mønstre af 6 forskellige mikrofluide kanal design (Type A til F). Type A repræsenterer lineær form mikro-kanal uden mikro-mønstre, type B repræsenterer lineær form mikro-kanal med lineært arrangeret mikro-mønstre, type C repræsenterer lineær form mikro-kanal med dobbelt-række lineært arrangeret mikro-mønstre, Type D repræsenterer lineær forme mikro-kanal med alternativ permutation lineære mikro-mønstre, Type E repræsenterer U-form mikro-kanal med alternativ permutation lineære mikro-mønstre, og Type F repræsenterer fire-kanals mikrofluid med alternativ permutation lineære mikro-mønstre. Relative værker blev officielt tildelt i september 2014 ved US Patent and Trademark Office (US 20140255976 A1). De lige kanaler med enkle mønstre under samme lineære hastighed repræsenterer meget lav capture ydeevne på grund af den begrænsede opholdstid og manglende blande strømningsmønster: Indfangning ydeevne af type A chip = 1,2 ± 0,6% og type B chip = 4,5 ± 2,2%. Når antallet af mikro mønstre stiger til skabe effektiv blanding, capture effektivitet øges væsentligt: ​​Type C chip = 17,9 ± 3,0% og Type D chip = 33,5 ± 6,6%. Yderligere fordoble kanal længde kun let øget effektiviteten til 37,0 ± 10,5% (type E), mens 4 parallelle kanaler yderligere forbedret opsamling effektivitet til 93,7 ± 8,9% (type F). De spiking celletal blev yderligere sænket til intervallet ~ 5 til ~ 100 pr 2 ml blod for at bekræfte linearitet capture præstation i Type F chip (S1A Fig).

Ingen tilstopning Ejendom i SLB Coated overflade og Target Cell Rensning

for yderligere at evaluere overfladen effekt blev en type E-chip overtrukket med konventionelle anti-EpCAM tøjret silan (Ab-silan) eller anti-EpCAM konjugeret SLB (Ab-SLB). Fig 2B viste, at indfangning ydeevne HCT116 er omkring 15% på Ab-silan overtrukket chip, med over 2000 WBCs er ikke-specifikt bundet på chippen. Til sammenligning Ab-SLB overtrukket chip væsentligt forbedret fangsteffektivitet og reducerede ikke-specifik WBC på chippen.

Renheden af ​​de opfangede celler kan forbedres yderligere ved blot at øge strømningshastigheden af ​​PBS-buffer flush i et antistof-SLB overtrukket chip. Som strømningshastigheden for PBS steg procentdelen af ​​tilbageholdt WBCs faldet betydeligt. I vores undersøgelse, at den forhøjede forskydningsspænding fjerne 55 ~ 80% af WBCs samtidig bevare mere end 90% HCT116 kræver ~ 4-8 dyn /cm

2 (svarende til strømningshastigheder af ~ 5-10 ml /h, Fig 2C). Forskydningsspændingen kræves for at oprense målceller er væsentligt lavere end hvad der blev rapporteret i tidligere Cellefrigørelse undersøgelser baseret på konventionelle antistof-silaniseret overflader og betragtes som lav nok til at have minimal eller ingen indvirkning på cellelevedygtighed eller proteinekspression [40,58]. Tværtimod forblev HCT116 bundet selv ved 50 ml /time på grund af den stærke antistof-antigen-interaktion (S1 Film). For de kliniske prøver, valgte vi en mindre gennemstrømningshastighed på 4 ml /h for at undgå potentielt tab af CTCs.

Frigivelse af Captured levedygtige Target Celler

Releasing levedygtige CTCs fra mikrofluide chips er et kritisk trin muliggør bekvem celle præservering, cellekultur, og nedstrøms molekylær analyse. Tidligere forsøg anvender enzymatisk spaltning [34,36] eller mekaniske kræfter [40,58] for at frigøre celler har vist enten delvis frigivelse eller uundgåelige celledød, tildelt af brud på antistof-antigen bindinger eller membran brud. SLB er et lipid molekylær samling på vand-faststof-grænsefladen stabiliseret ved indadrettet hydrofobe-hydrofobe interaktioner af lange carbonhydridkæder med lipidmolekyler og udad hydrofile hovedgrupper interagerer med vand eller hydrofile siliciumoxid overflader (dvs. glas). Den SLB samling kunne let nedbrudt af indføre en hydrofob komponent så simpelt som luftbobler. Vi tilbød en strategi forsigtigt af adhæsive CTCs uden at forstyrre de antistof-antigen-bindinger ved at injicere kontinuerlig luft skum til mikrofluidik (S2 Film). Den skummende opløsning blev skabt af en blanding af luft med celledyrkningsmedium og forsigtigt hvirvlet i skabelsen skum. Effektiviteten gennemsnitlige frigørelse med 250 pi skummende opløsning var 99,7% i 3 gentagelser (S1B Fig). For at validere celle integritet frigivet fra mikrofluide chips ved hjælp af luft skum blev HCT116 celler præ-farvet med CellTracker Green CMFDA og Texas Red-SLB blev anvendt til overfladebehandling indikation. Efter frigivet af luft skum blev cellerne farvet med DAPI nuklear farvning og fotograferet under fluorescensmikroskop. Fig 3A viste, at det eluerede cellen blev indpakket lipider, hvilket indikerer celle frigivelse gennem skrælning SLB med fly. Levende /Dead assay blev udført umiddelbart efter celle eluering; Resultaterne viste 86% af eluerede celler forbliver levedygtige sammenlignet med 0% levedygtighed fra konventionelt coated anti-EpCAM silaniseret chip (S2 Fig). Ved at indføre hydrofobe luft skum, kunne blid frigivelse af tilfangetagne CTCs ske uden at beskadige cellerne. Som følge heraf er den ikke-fouling SLB overflade bevaret intakt celle morfologi og bundet levedygtige celler til yderligere undersøgelse.

(A) De fluorescerende billeder af HCT116 cancercellen frigivet fra Texas Red-SLB overtrukket chip. Cellen blev omviklet med Texas Red-SLB lipid molekyler rundt membranen (blå: DAPI, grøn: pre-farvet CellTracker Green CMFDA, rød: Texas Red konjugeret lipid molekyle). (B og C) Overlaid fluorescerende billeder af den frigivne single CTC og CTM for celle karakterisering. Eluerede celler fra kliniske prøver blev kategoriseret som CTC efter størrelse, morfologi og immunostainning (DAPI + /CK20 + /CD45-). WBCs blev identificeret ved DAPI + /CK20- /CD45 + immunfarvning (blå: DAPI, grøn: CD45, red: CK20).

Capture og Frigivelse af CTMs

For at validere evne Ab-SLB belagt mikrofluid chip til CTMs opsamling og slip, RFP ektopisk udtrykte HCT116 blev brugt.

ex vivo

tumor emboli blev simuleret ved hjælp ufuldstændig fordøjelse med trypsin og udvalgt af mikromanipulator under mikroskop som tidligere rapporteret [6]. Diverse antal udvalgte HCT116-RFP emboli blev tilsat i mikrofluide chips til yderligere opsamling og slip test effektivitet. De frigivne emboli blev derefter afbildet under fluorescerende mikroskop efter DAPI nukleare farvning (Fig 2D, venstre panel).