PLoS ONE: en meget nøjagtig Inclusive kræftscreening Test Brug Caenorhabditis elegans Scent Detection

Abstrakt

tidlig påvisning og behandling er af afgørende betydning for en vellykket udryddelse af forskellige kræftformer, og udvikling af økonomiske og ikke-invasive nye kræft screening systemer er kritisk. Tidligere rapporter ved hjælp hunde duft afsløring demonstrerede eksistensen af ​​kræft-specifikke lugte. Det er imidlertid vanskeligt at indføre hunde duft anerkendelse til klinisk praksis på grund af behovet for at opretholde nøjagtighed. I denne undersøgelse har vi udviklet en nematode Scent Detection Test (NSDT) ved hjælp af

Caenorhabditis elegans

at tilvejebringe en ny meget præcise kræft afsløring system, der er økonomisk, smertefri, hurtig og bekvem. Vi demonstrerede vildtype

C

.

elegans

vises attraktive kemotaksi mod human cancer celle sekreter, kræft væv og urin fra kræftpatienter, men undgik kontrol urin; parallelt, svaret fra de olfaktoriske neuroner i

C

.

elegans

til urin fra kræftpatienter var betydeligt stærkere end at kontrollere urin. I modsætning hertil blev G-protein α mutanter og olfaktoriske neuroner-ablerede dyr ikke tiltrukket kræftpatient urin, tyder på, at

C

.

elegans

sanser lugt i urinen. Vi testede 242 prøver til at måle effektiviteten af ​​NSDT, og fandt følsomheden var 95,8%; dette er markant højere end for andre eksisterende tumormarkører. Endvidere specificiteten var 95,0%. Vigtigere er det, denne test var i stand til at diagnosticere forskellige kræfttyper testet på det tidlige stadium (stadie 0 eller 1). Afslutningsvis

C

.

elegans

duft-baserede analyser kan give en ny strategi for at opdage og studere sygdom-associerede dufte

Henvisning:. Hirotsu T, Sonoda H, Uozumi T, Shinden Y, Mimori K, Maehara Y et al. (2015) en meget nøjagtig Inclusive kræftscreening Test Brug

Caenorhabditis elegans

Scent Detection. PLoS ONE 10 (3): e0118699. doi: 10,1371 /journal.pone.0118699

Academic Redaktør: Myon-Hee Lee, East Carolina University, UNITED STATES

Modtaget: 26 september, 2014 Accepteret 22. januar 2015; Udgivet: 11 Mar 2015

Copyright: © 2015 Hirotsu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne forskning blev understøttet af en JSP’er Grant-in-støtte til unge forskere (a), Grant-in-støtte til videnskabelig forskning (C), Senri Life Science Foundation, Inamori Fonden, Kurata Memorial Hitachi Videnskab og Teknologi Foundation, The Japan Health Foundation, Mishima Kaiun Mindefond og Kyushu University Tværfaglige programmer i uddannelse og projekter i Forskning Udvikling (type E-4, 24.425). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en førende dødsårsag på verdensplan, og tegnede sig for 7,6 millioner dødsfald (ca. 13% af alle dødsfald) i 2008; dette tal forventes at fortsætte stigende, med en anslået 17 millioner dødsfald i 2030 [1]. Kun få symptomer er tydelig i den tidlige fase kræft og kræft ikke hurtigt videre uden at passere gennem et tidligt stadium. Kræft er langt vanskeligere at behandle, da det udvikler sig til et fremskredent stadium og symptomer bliver synlige. Således er der et presserende behov for udvikling af en ny økonomisk og ikke-invasiv screeningsmetode, der er i stand til at påvise tidlige cancer. Det er blevet rapporteret, at cancere udstråler lugte, som kan detekteres med stor nøjagtighed af hunde [2-5] eller mus [6]. Men det er praktisk at indføre hunde duft afsløring til klinisk praksis er vanskeligt, fordi dens nøjagtighed påvirkes af hundenes koncentration. Lavere organismer, der kan detektere lugte udsendes af cancere med høj nøjagtighed af hunde kan være egnet til udvikling af en teknologi til at registrere dufte udsendes af cancere. Nematoder såsom

Anisakis simplex

kan forårsage mave- anisakidosis når mennesker indtager forurenet råt eller utilstrækkeligt fisk, og rapporter om omkring 30 patienter med tidlige fase mavekræft med Anisakis larver knyttet til deres tumorer er særligt provokerende (caserapport og gennemgang af Sonoda et al., 2014 [7]). Fordi genomet af

Caenorhabditis elegans

koder for mindst 1.500 forudsagt G-protein-koblede receptorer (GPCR’er), herunder olfaktoriske receptorer [8,9], er formålet med den foreliggende undersøgelse var at bruge

C

.

elegans

at udvikle et system til detektering lugtstoffer udsendes af kræft. Vi kalder det “nematode Scent Detection Test” (NSDT).

Materialer og Metoder

Udarbejdelse af dyrkningsmedium fra humane cancerceller og fibroblaster

menneskelige kræftceller SW480, COLO201, Colo205 og ikke-tumorigene udødelig fibroblast human cellelinie KMST-6 blev opnået fra japanske Indsamling af Research Bioressourcer Cell Bank (Tokyo, https://cellbank.nibio.go.jp). Den human fibroblast cellelinje CCD-112CoN, der var afledt af normal colon væv, blev erhvervet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), og de andre cellelinjer beskrevet nedenfor var fra Cell Resource Center for Biomedical Research, Institut for Samfundsudvikling, Aging og Kræft (Tohoku Universitet, Sendai, Japan). Alle cancercellelinier blev holdt ved subkonfluens i RPMI 1640, KMST-6 celler blev dyrket i MEM, og CCD-112CoN celler blev dyrket i EMEM. Alle dyrkningsmedier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum, og cellerne blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% befugtet CO

2. De klare lag i toppen af ​​mediet blev opnået og plettet på assayplader at bestemme, om de inducerede en kemotaktiske respons af

C

.

elegans

.

Kræft og normalt væv prøveudtagning

Friske kirurgiske prøver blev opnået fra patienter med colorectal eller gastrisk cancer og opretholdt i 10 ml saltvand ved -20 ° C. Det normale væv blev ekstraheret fra den del, der blev skilt fra kræft så meget som muligt i den resekterede organ. Patienterne havde gennemgået kirurgi på Imari Arita Kyoritsu Hospital (Arita, Japan) fra januar til maj 2014.

Patient og kontrol prøve donorer

Deltagerne fra Imari-Arita Kyoritsu Hospital blev inkluderet fra 12 oktober 2011 til den 4. april 2012 for udvidede analyser og fra den 20. september 2012 til den 22. maj 2013 for begrænsede analyser. Der var ingen begrænsninger for måltider eller aktiviteter for prøveudtagning. Deltagerne skulle være 20 år. Deltagerne gennemførte et spørgeskema vedrørende de faktorer, der kan påvirke de flygtige molekyler i deres urin eller serumprøver, herunder alder, fysiske symptomer (f.eks appetit, træthed, hovedpine, bryst eller abdominal udspiling, hoste, blodige afføring, forstoppelse, diarré), graviditet, historie af kræft behandling, nuværende brug af medicin, alkohol forbrug (3 eller flere dage om ugen) og rygning inden for de sidste 2 uger. Eksklusionskriterier omfattede deltagere, der havde gennemgået cancer kirurgi inden for det sidste år, dem, der ikke blev undersøgt for kræft tilbagefald trods gennemgået cancer kirurgi mere end 5 år tidligere, og dem i øjeblikket modtager kemoterapi. Som vi mistanke om, at kemoterapi behandling eller operation ville ændre urin kemikalier i kræftpatienter, vi søgte patienter, der endnu ikke havde været underkastet anden behandling. Et serienummer blev skrevet på hver prøve rør på tidspunktet for indsamlingen til at identificere individuelle oplysninger.

Etik Godkendelse

Denne undersøgelse blev foretaget med godkendelse af de institutionelle anmeldelse bestyrelser på Imari-Arita Kyoritsu Hospital, og alle emner, der er fastsat skriftligt informeret samtykke.

Blood serum og urin prøveudtagning

Hver serumprøver blev adskilt fra ca. 7 ml blod. Derefter blev 1 til 5 ml serum indeholdt i en 10 ml polypropylen skruelåg rør og opbevaret ved -20 ° C indtil præsentation på prøve.

Ca. 10 ml urin blev opsamlet fra hver deltager, sat til en 10 ml polypropylen skruelåg rør og opbevaret ved -20 ° C indtil test. Kun én prøve blev indsamlet fra hver deltager.

Bestemmelse af tumormarkører

Tumor markør blev bestemt på Central Laboratory CRC Inc. i Fukuoka. CEA serum blev bestemt under anvendelse kemiluminescerende enzymimmunoassay [10], og afskæringsværdien for serum CEA var 5,0 ng /ml. De serum-anti-p53 Ab koncentrationer blev bestemt ved enzymimmunassay [11], med en cut-off værdi for serum-anti-p53 Ab på 1,30 U /ml. De urin DiAcSpm blev bestemt ved hjælp af en Auto DiAcSpm reagenskittet (Alfresa Pharma Co., Osaka, Japan). Dette assay er baseret på den specifikke binding mellem et bovint serumalbumin-konjugat acetylspermine, som DiAcSpm mimic, og en stabil rød-violet opløsning af kolloide guld antistofkomplekser [12]. De afskæringsværdier for urin DiAcSpm var 243 nmol /g Cre hos mænd og 354 nmol /g Cre hos kvinder, henholdsvis.

Statistisk analyse

Forskelle i deltagernes karakteristika, laboratoriedata og tumormarkører mellem kontrol- og kræft deltagere blev undersøgt ved hjælp af den parrede

t

-test for kontinuerlige variabler og χ

2 test for dikotomiseret variabler. En

P

-værdi af 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Kræft iscenesættelse var baseret på Union Internationale Contre le Cancer (UICC) kriterier. Derefter blev odds ratio (OR) og 95% konfidensintervaller (CIS) til påvisning af kræft estimeret ved hjælp fem logistiske regressionsmodeller. Model 1: NSDT, alder og klager [appetitløshed, forstoppelse eller diarré, nogle klager]; Model 2: NSDT, alder og andre sygdomme [hypertension, hyperlipidæmi, cerebralt infarkt, nogle andre sygdomme]; Model 3: NSDT, alder, Plt, CEA, anti-p53-Ab og DiAcSpm /Cre; Model 4: NSDT, alder, hypertension, nogle andre sygdomme, CEA og nogle TM’er; Model 5: NSDT, alder og CEA. OR for hver efter- variabel blev udtrykt for én standardafvigelse (SD) stigning. Diagnostisk nøjagtighed blev beregnet som sensitivitet, specificitet positiv prædiktiv værdi og effektivitet af CEA, anti-p53 Ab, DiAcSpm, nogle TM’er, og NSDT af prøver, sammenlignet med den nuværende diagnose.

Worm kulturer og stammer

C

.

elegans

stammer blev dyrket ved 20 ° C under standardbetingelser på NGM plader [13] med

Escherichia coli

NA22, som vokser i tykke lag, der tjener som et egnet fødekilde for storstilet worm kulturer, der anvendes til kemotaksi analyser [14-17]. Stammer, der anvendes i denne undersøgelse var vildtype N2 og

OTB-3 (n2150)

.

kemotaksiassays

De kemotaksiassays blev udført ved hjælp af 50-100 ca. synkroniseret unge voksne, og beregningen af ​​kemotaksi indekset blev udført som tidligere beskrevet [16,18]. Det var vigtigt at opretholde stuetemperatur ved 23 ± 1 ° C. Urinprøver opbevaret ved -20 ° C blev tøet op og holdt ved stuetemperatur lige før analyserne. Kun velnærede dyr blev brugt, fordi sult påvirker tiltrækning til kræft urin samt undgåelse af kontrol urin.

Genetisk ablation af sensoriske neuroner

Vi brugte mus caspase-1 (mCasp1) for ablation af AWC, AWA, ASH og AWB neuroner [16,17].

CEH-36

[19],

ODR-10

[20],

SRA-6

[21] og

str-1

[ ,,,0],22] promotorer blev anvendt til at drive ekspressionen af ​​mCasp1 i hver af disse neuroner, henholdsvis.

Calcium imaging

Fordi urinprøver strømme i tynde rør i billeddannelse eksperimenter under anvendelse af en mikrofluidanordning, udfælder og faste legemer i urinen skulle fjernes ved centrifugering og filtrering (porestørrelse 0,22 pm, MillexGP, Merck Millipore). At overvåge reaktionerne fra AWC og AWA neuroner, YC3.60 [23] blev udtrykt i disse neuroner af

ODR-1

[24] og

ODR-10

[20] initiativtagere, henholdsvis. Calcium imaging blev udført som tidligere beskrevet [25-27]. Hvert dyr blev immobiliseret i en mikrokanal sådan at næsen af ​​dyret blev udsat for en flydende strøm indeholdende urin ved 10

-1 fortynding. Reaktionerne på både kontrol- urin og urin fra cancerpatienter blev testet i de samme individer. Fluorescerende billeder af YC3.60 blev opnået under anvendelse af et Leica DMI3000B mikroskop udstyret med en 40 × objektivlinse og en ORCA-D2 digitalkamera (Hamamatsu). Alle billeder blev indsamlet med eksponering på 200 ms. Tid stakke af AWC eller AWA celle organer blev taget til fange og analyseret for emission forholdet YFP til FFP fluorescens hjælp Metamorph software (Molecular Devices). Forholdet blev beregnet som YFP intensitet /CFP intensitet (= R), og det gennemsnitlige forhold i en 10-s vindue (-10-0 s) blev oprettet som R0.

Resultater og Diskussion

C

.

elegans

er tiltrukket eller undgår forskellige flygtige lugtstoffer [18]. For at undersøge om

C

.

elegans

opdaget lugte udskilles af kræft væv, vi først analyseret svaret fra individuelle

C

.

elegans

til konditioneret medium fra kulturer af humane cancer og fibroblast cellelinjer. Cellelinier afledt fra humane tumorer var som følger: colorektal cancer, SW480, COLO201 og Colo205; brystcancer, MCF7; og gastrisk cancer, NUGC4, MKN1 og MKN7. Cellelinier afledt fra normale humane væv var som følger: fibroblaster, KMST-6 (udødeliggjort ved hjælp af

60Co bestråling) og colon fibroblaster, CCD-112CoN. De klare lag i toppen af ​​dyrkningsmediet blev opnået og plettet på assayplader at vurdere den kemotaktiske adfærd vildtype

C

.

elegans

. At udelukke enhver effekt af duften af ​​mediet, fortyndet frisk medium blev spottet modsatte side til det konditionerede medium på assaypladerne. Vi fandt, at vildtype

C

.

elegans

viste signifikant tiltrækning til 10

-6 eller 10

-7 fortyndinger af det medium, hvori kræftceller var blevet opretholdt (Fig. 1A). blev observeret dosis-afhængige reaktioner, og peak tiltrækning blev induceret af 10

-6 og 10

-7 fortyndinger af mediet (S1 Fig. A). I modsætning hertil blev vildtype-orme ikke tiltrukket af en lang række koncentrationer af dyrkede medier fra humane fibroblast-cellelinjer (fig. 1A og S1B Fig.). Wild-typen

C

.

elegans

viste også tiltrækning til medier fra en anden dyrkning linje af kræftceller, men ikke til de af fibroblaster (S2 Fig.). Ved højere koncentrationer, dyrene havde tendens til at vise undvigeadfærd (S1 Fig. A), i overensstemmelse med vores tidligere rapport, at

C

.

elegans

undgår højere koncentrationer af attraktive lugtstoffer [16-18,21,28,29].

(A) Kemotaksis af vildtype

C

.

elegans

til 10

-6 og 10

-7 fortyndinger af MEM, EMEM eller RPMI medium alene eller dyrkningsmediet fra fibroblast (KMST-6 og CCD-112CoN), kolorektal cancer (SW480 , COLO201 og COLO205), brystkræft (MCF7) eller gastrisk cancer (NUGC4, MKN1 og MKN7) celler (n ≥ 5 assays). (B) Kemotaksis af vildtype og

ODR-3

mutanter (n ≥ 5 assays) som svar på en 10

-6 fortynding af konditioneret dyrkningsmedium fra colorectal, bryst eller gastriske kræftceller. (C) Kemotaksis af vildtype til 10

-2, 10

-3 og 10

-4 fortyndinger af saltvand med normale og cancer væv (n ≥ 5 analyser). (D) Kemotaksis til normal og cancer væv ved vildtype og

ODR-3

mutanter (n ≥ 5 assays). (E) Chemotaxis af vildtype til humane urinprøver fra kontrolindivider (blå søjler; C1-C10) eller cancerpatienter (orange bar; p1-p20) ved 10

-1 fortynding (n = 5 assays). (F) Kemotaksis til urin fra kræftpatienter med vildtype og

ODR-3

mutanter ved 10

-1 udvanding (n ≥ 6 analyser). Fejl- søjler repræsenterer SEM. Betydelige forskelle fra kontrolprøver er angivet med * (

P

0,05); ** (

P

0,01); *** (

P

0,001) ved Dunnett tests (A) eller Students

t

-tests (B, C, D, F). † angiver en signifikant forskel (

P

0,05) ved Students

t

-tests (A)

I

C

..

elegans

, attraktive lugtstoffer sanses ved AWC og AWA olfaktoriske neuroner [18]. I disse sensoriske neuroner, ODR-3 (G protein α) fungerer som et centralt element i en olfaktoriske signalvej, og

OTB-3

mutanter ikke kan reagere på attraktive lugtstoffer [30]. Dog er ODR-3 ikke involveret i svarene på andre typer af attraktive kemikalier, herunder vandopløselige stoffer. Vi observerede, at

OTB-3

mutanter viste alvorlige defekter i tiltrækning til medium fra cancer cellelinjer (fig. 1B), hvilket indikerer, at

C

.

elegans

sanser lugtende materialer fra dyrkede kræftceller.

Dernæst testede vi, om

C

.

elegans

viser tiltrækning mod human cancer væv fra en kræftpatient. Vi fandt vildtype

C

.

elegans

udviste indlysende tiltrækning til cancervæv af 0,1-0,8 mm i diameter fra en cancerpatient (sigmoid colon cancer, gastrisk cancer eller rektal cancer), men svagt undgås normalt væv fra den samme deltager (S3 Fig.) . Når kræft eller normalt væv blev placeret på modsatte punkter hinanden på den samme plade, vildtype

C

.

elegans

foretrukne kræftvæv (S1 Fig. A).

For at kvantitativt evaluere denne adfærd, vi fjernet kræft og normalt væv på 0,5 cm hver fra den samme fase II sigmoid kolon kræftpatient og vedligeholdes dem i 10 ml saltvand. Wild-typen

C

.

elegans

viste tiltrækning til 10

-3 eller 10

-4 fortyndinger af kræftvæv vedligeholdt saltvand, mens det viste undgåelse til saltvand med normalt væv (Fig. 1C). Svarer til ovenfor resultat af kemotaksi for cancerceller, dyrene havde tendens til at vise svag tiltrækning ved højere koncentrationer [16]. Disse resultater viser, at

C

.

elegans

vise tiltrækning til kræft væv. Desuden

OTB-3

mutanter ikke udviser tiltrækning til kræft væv (fig. 1D), hvilket indikerer, at

C

.

elegans

sanser lugtende materialer af kræft væv. Tværtimod mutanterne havde normal undgåelse af normalt væv, som sandsynligvis er i overensstemmelse med den tidligere resultat ODR-3 primært medierer attraktion hvorimod delvist regulerer undgåelse og andre G-proteiner er involveret i sensing afskrækningsmidler [16,30].

for at afgøre, om NSDT kunne være et effektivt redskab til screening af humane kræftformer, vi sammenlignet svarene fra

C

.

elegans

til serum og urin af kontrolpersoner og patienter med kræft (begrænset karakterisering). Vi testede 30 serum- og urinprøver; 10 prøver fra kontroller uden historie af kræft og 20 prøver fra patienter med colorectal, gastrisk eller bugspytkirtelkræft (S1 tabel). I respons på serum, iagttoges ingen forskel mellem prøver fra kontrolindivider og cancerpatienter, selvom koncentrationerne af serum blev ændret (S4 Fig.). Dette kan skyldes tilstedeværelsen af ​​andre stærke lugtstoffer eller molekyler, der maskerer lugten af ​​molekyler udskilles i blodbanen. Men

C

.

elegans

blev tiltrukket af 10

-1 fortynding af urinprøver fra kræftpatienter, mens de undgået alle kontrol urinprøver (fig. 1 E og S5 Fig.). Vi testede forskellige koncentrationer af urin og fandt, at tiltrækning til kræft urin og undgåelse af kontrol urin toppede ved en 10

-1 fortynding af hvert (S6 Fig.). Dette resultat viser den mulighed, at

C

.

elegans

diskriminerede mellem urin fra kontroller og kræftpatienter. Blandt de testede patienter, der var seks tilfælde af tidlige fase cancer (fase 1) (p1, p3, p6, p8, p11 og p12) (S1 tabel), hvilket tyder på den mulighed, at NSDT kan anvendes til screening af tidlig cancer . Desuden

OTB-3

mutanter udstillet betydelige defekter i deres tiltrækning til urin fra kræftpatienter, hvilket yderligere tyder på, at

C

.

elegans

registrerer lugte i urinen (fig. 1 F).

Som nævnt ovenfor, er attraktive lugtstoffer registreres af AWC og AWA olfaktoriske neuroner i

C

.

elegans

, mens afskrækningsmidler er registreres af ASH, AWB og andre sensoriske neuroner [21,22,31,32]. For at afgøre, hvilke sensoriske neuroner fornemmer kræft lugter i urinen, vi analyserede svarene fra dyr med sensorisk neuron ablation. En tidligere rapport viste, at ekspressionen af ​​muse-caspase 1 (mCasp1) effektivt dræber AWC, AWA, ASH og AWB neuroner [16,17]. Vi fandt Ash eller AWB- ablation forårsaget defekter i undgåelse af kontrol urin (Fig. 2A), hvilket antyder, at disse neuroner regulerer denne adfærd. I modsætning hertil viste AWC- eller AWA-ablerede dyr betydelige mangler i deres tiltrækning til urin fra cancerpatienter (fig. 2A), hvilket indikerer, at AWC og AWA olfaktoriske neuroner mægle tiltrækning til kræft lugter i urin.

( A) Kemotaksis til urin fra kontroller (c5 og c10) eller kræftpatienter (p5, P8 og p18) i vildtype dyr med AWC, AWA, ASH eller AWB neuron ablation (n ≥ 5 analyser). (B) Kemotaksis af vildtype

C

.

elegans

til urinprøver fra kontroller (A og B) eller kræftpatienter (C og D) med eller uden filtrering, der blev anvendt i billeddannelse eksperimenter (n ≥ 5 assays). Filtrering af urin havde ingen signifikant effekt. (C) Calcium svarene fra AWC olfaktoriske neuroner om fjernelse af kontrol eller kræftpatient urin. (D) Gennemsnitlige fluorescens ændringer i AWC for 10 s efter urin fjernelse (n ≥ 8 dyr). Værdier er normaliseret til den gennemsnitlige ændring i forholdet mellem kontrol-A. (E) Calcium svarene fra AWA olfaktoriske neuroner efter tilsætning af urin fra kontroller eller kræftpatienter. (F) Gennemsnitlige fluorescens ændringer i AWA for 10 s efter urin stimulation (n ≥ 8 dyr). Værdier er normaliseret til den gennemsnitlige ændring i forholdet mellem kontrol-A. Den brune skygger indikerer, at urinen var til stede. Fejl barer og skyggefulde områder omkring kurverne repræsenterer SEM. Betydelige forskelle fra kontrolprøver er angivet med * (

P

0,05); ** (

P

0,01); *** (

P

0,001). Som beregnet af Dunnetts test (A, D, F)

På baggrund af resultaterne er beskrevet ovenfor, til direkte at overvåge svarene fra

C

.

elegans

olfaktoriske neuroner til urin fra kræftpatienter, vi udførte calcium imaging eksperimenter ved hjælp af genetisk kodet calcium indikator, gul Cameleon (YC) 3,60 [23,25-27]. For imaging eksperimenter, vi opnåede store mængder af urin fra kontroller (A og B) og patienter med mavekræft (C og D), og observeret undgåelse af eller tiltrækning til disse urinprøver efter

C

.

elegans

henholdsvis (fig. 2B). For de billeddannende eksperimenter, udfælder og faste legemer i urin blev fjernet ved centrifugering og filtrering (se fremgangsmåder). En sådan behandling påvirkede ikke kemotaktiske adfærd

C

.

elegans

mod urinprøver (Fig. 2B). Fordi vores tidligere resultater viste, at AWC og AWA olfaktoriske neuroner mægle

C

.

elegans

tiltrækning til urin fra cancerpatienter (fig. 2A), vi overvågede svarene fra disse neuroner efter urin stimulation. Tidligere rapporter viste stigninger i calciumkoncentration forekomme i AWC neuroner ved lugt fjernelse (en lugt-OFF respons) [25], mens der i AWA neuroner opdages efter lugt tilføjelse (en lugt-ON respons) [33]. Vi fandt AWC olfaktoriske neuroner klart reageret på urin fra patienter med mavekræft (Fig. 2C og S1 film). Forøget intracellulær Ca

2 + niveauer i AWC neuroner blev observeret efter fjernelse af urin, mens AWC neuronale reaktioner på kræftpatient urin var signifikant stærkere end dem at kontrollere urin (fig. 2D), hvilket indikerer, at disse neuroner spiller vigtige roller i diskriminerende mellem urin fra kontroller og kræftpatienter. Vi observerede signifikant stærkere responser af AWC neuroner til urin fra patienter med andre cancertyper (rektal og sigmoid colon cancer) (S7 Fig.). AWC neuroner også svagt reageret at kontrollere urin, hvilket tyder på tilstedeværelsen af ​​urenheder i urinen, der kan lidt aktivere AWC neuroner. Også i de AWA olfaktoriske neuroner, svage, men væsentlige svar på tilsætning af urin fra kræftpatienter blev observeret (fig. 2E og F), selv om der blev fundet nogen forskelle mellem urin fra kontrollerne og patienterne i de billeddannende eksperimenter fordi svarene AWA neuroner var meget svag i forhold til AWC neuroner

for at undersøge nøjagtigheden af ​​NSDT, vi analyserede 242 urinprøver.; 218 kontrolprøver og 24 prøver fra kræftpatienter (udvidet karakterisering) (S2 tabel). Alle urinprøver blev fortyndet til 10

-1 koncentration og kemotaksiassays blev udført tre gange for hver prøve. Når resultatet af tre gange assays skrævende 0 blev tre gange assays udført igen for den samme prøve.

C

.

elegans

viste tiltrækning til forskellige kræftpatient urinprøver (23/24) (fig. 3). Følsomheden af ​​NSDT var 95,8% (tabel 1). Men

C

.

elegans

udstillet undgåelse af de fleste kontrol urinprøver (207/218) (fig. 3). Specificiteten af ​​NSDT var 95,0%, og den positive prædiktive værdi og effektivitet af testen var 67,6% og 95,0% (Tabel 1). Vi analyserede også patienten spørgeskema og andre eksisterende tumormarkører herunder serum CEA [10], serum anti-p53 antistof (anti-p53 Ab) [11] og urin N

1, N

12-diacetylspermine (DiAcSpm) [12] i de samme deltagere. Sammenlignet med disse eksisterende tumormarkører, specificitet NSDT var meget højere (tabel 1). Alligevel følsomheden af ​​de eksisterende tumormarkører tendens til at være lavere med tidligere fase kræft, men det færdige NSDT forblev høj for alle faser af kræft. Vi målte også urin kreatinin koncentration, som blev anvendt som indikator for urin koncentration for alle prøver. Men svarene fra

C

.

elegans

til urin ikke var forbundet med urin koncentration, hvilket tyder på, at kræft lugt sekretion er uafhængig. Selvom DiAcSpm niveauer naturligvis blev forhøjet i urinen hos alle tre testede gravide kvinder blev NSDT ikke påvirket af graviditeten. Også kemotaksi til urin havde ingen sammenhæng med køn af deltagerne, de fleste fysiske skavanker og andre end kræft sygdomme, herunder diabetes, eller typen af ​​medicin administreret (S2 tabel). Der var signifikante forskelle i NSDT, deltageren alder, appetitløshed, forstoppelse eller diarré, nogle klager, hypertension, hyperlipidæmi, cerebralt infarkt, nogle andre sygdomme, blodplader, CEA, og nogle tumormarkører (TMS) mellem kræftpatienter og deltagere kontrol (S2 tabel). Logistisk regressionsanalyse blev udført for at identificere uafhængige faktorer til påvisning af kræft og effekten af ​​NSDT blev undersøgt via disse analyser. Appetitløshed, forstoppelse eller diarré, nogle klager, hypertension, hyperlipidæmi, cerebralt infarkt, nogle andre sygdomme, blodplader, anti-p53-Ab og DiAcSpm /Cre blev ikke signifikant associeret med cancer detektion (S3 tabel). Som et resultat heraf NSDT og deltageren alder var uafhængige variabler for cancer påvisning i alle modeller i de logistiske analyser. Den odds ratio for 0,2 stigning i NSDT var mellem ca. 30,4-49,8 for alle modeller (S3 tabel). Disse resultater indikerer, at NSDT specifikt kan detektere cancer. Deltagerne i dette forsøg omfattede patienter med tidlig cancer (fase 0 eller 1) (tabel 1), hvilket indikerer, at NSDT kan detektere tidlige fase kræft. Bemærk, at i fem deltagere, der ikke blev kategoriseret som kræftpatienter, når urin blev opnået i 2011, den NSDT identificerede urinen af ​​disse deltagere som kræft-positive; kræft blev fundet i løbet af de efterfølgende to år. Den NSDT kunne detektere forskellige former for kræft testet i dette studie med øsofageal, gastrisk, colorektal, bryst, pancreas og prostatacancer i alle faser (fig. 3 og tabel 1), hvilket antyder, at denne test kan anvendes for inkluderende kræftscreening.

Box plots (A) og dot plots (B) af kemotaktiske reaktioner af vildtype

C

.

elegans

til urinprøver fra kontrolpersoner (n = 218) eller kræftpatienter (n = 24). Whiskers indikerer 10. og 90. percentiler.

I den foreliggende undersøgelse, viser vi, at

C

.

elegans

diskrimineret effektivt mellem urinen af ​​kræftpatienter og kontrolpersoner. Ikke desto mindre, identifikation af unikke kræft lugte i urin og bekræftelsen af ​​svarene fra

C

.

elegans

kræves for at understøtte den konklusion, at

C

.

elegans

registrerer kræft lugter i urinen. Vi mener, at de data, der præsenteres her, viser, at brug af

C

.

elegans

viser lovende for kræft diagnose. Erfarne klinikere ved, at den menneskelige næse er et værdifuldt redskab i bedside diagnose, men evnen af ​​mennesker til at diagnosticere sygdommen ved lugten har kun meget sjældent været genstand for kvantitative undersøgelser. For nylig har mange duft afsløring undersøgelser blevet udført med dyr [2-6,34], gaskromatografi /massespektroskopi (GC /MS) [6,35-39] eller elektroniske næser (Enoses) [40-42]. Kræft detektion af GC /MS eller Enoses er problematisk med hensyn til afsløring følsomhed, støj af de flygtige organiske forbindelser, der findes i miljøet, og høje omkostninger. Selvom ingen direkte sammenligning undersøgelser er blevet udført, hunde synes at klare sig bedre end GC /MS eller Enoses [43]. Men den intelligens og koncentration af disse dyr er ufordelagtigt i cancer screening, der kræver den mekaniske inspektion af talrige prøver. Derfor vi postuleret, at hvis vi kunne adskille duft afsløring fra intelligens vi kunne undersøge forholdet mellem sygdomme og dufte. Vi observerede den ivrige duft afsløring af nematode

C

.

elegans

, som ikke er påvirket af eller afhængig af intelligens.

For at opdage kræft lugter mere præcist og kvantitativt, er det nødvendigt at identificere specifikke kræft lugte og deres receptorer. Adskillige flygtige organiske forbindelser er blevet identificeret som kandidat stoffer til påvisning af kræft ved hjælp af gaskromatografi /massespektroskopi (GC /MS) [6,35-39] eller Enoses [40-42] i cancer cellelinjer, urin eller udåndingsluft. Men mens disse data er lovende, er de foreløbige resultater. Ved at bruge

C

.

elegans

at teste et stort antal prøver, omfattende screening af kræft lugte kan udføres effektivt. Desuden olfaktoriske receptorer, der binder kræft lugt endnu ikke er blevet identificeret, fordi molekylære og genetiske analyser er vanskelige eller utilgængelige i højere organismer såsom hunde. I betragtning af den magt genetik og molekylære teknikker i

C

. Fejl- søjler repræsenterer SEM.