PLoS ONE: Undertrykkelse af STAT3 og HIF-1 Alpha medierer antiangiogene aktivitet af Betulinsyre i Hypoxic PC-3 prostatakræft Cells

Abstrakt

Baggrund

Signal transducer og aktivator af transkription 3 (STAT3) er en transkriptionsfaktor som regulerer forskellige cellulære processer, såsom celleoverlevelse, angiogenese og proliferation. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi, at betulinsyre (BA), en triterpen fra barken af ​​hvide birk, havde de inhibitoriske virkninger på hypoxi-medieret aktivering af STAT3 i androgenuafhængig human prostatacancer PC-3-celler.

Metode /vigtigste resultater

BA hæmmede protein-ekspression og transkriptionelle aktiviteter af hypoxi-inducerbare faktor-1α (HIF-1α) under hypoxisk tilstand. Konsekvent, BA blokeret hypoxi-induceret phosphorylering, DNA bindende aktivitet og nuklear akkumulering af STAT3. Desuden BA væsentligt reduceret cellulære og udskilte niveauer af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), et kritisk angiogen faktor og et målgen af ​​STAT3 induceret under hypoxi. Endvidere BA forhindret

in vitro

kapillarrør dannelse i humane navlevene-endotelceller (HUVEC’er) holdes i konditioneret medium af hypoxiske PC-3-celler, hvilket indebærer antiangiogen aktivitet af BA under hypoxiske tilstand. Notatet kromatin immunofældning (chip) assay viste, at BA hæmmede bindingen af ​​HIF-1α og STAT3 til VEGF promotor. Endvidere silencing STAT3 hjælp siRNA transfektion reelt forbedret den reducerede VEGF-produktion induceret af BA behandling under hypoxi.

Konklusioner /Signifikans

Tilsammen vores resultater antyder, at BA har antiangiogen aktivitet ved at forstyrre bindingen af ​​HIF-1α og STAT3 til VEGF-promotoren i hypoxiske PC-3-celler

Henvisning:. Shin J., Lee HJ, Jung DB, Jung JH, Lee HJ, Lee EO, et al. (2011) Undertrykkelse af STAT3 og HIF-1 Alpha medierer antiangiogene aktivitet af Betulinsyre i Hypoxic PC-3 prostatacancerceller. PLoS ONE 6 (6): e21492. doi: 10,1371 /journal.pone.0021492

Redaktør: Karen L. Mossman, McMaster University, Canada

Modtaget: 16 marts 2011; Accepteret: 29 maj 2011; Udgivet: 24 Jun 2011

Copyright: © 2011 Shin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Korea Science and Engineering Foundation (KOSEF) Tilskud finansieret af den koreanske regering (MEST) (nr 2011 til 0.063.466). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Signal transducer og aktivator af transkription 3 (STAT3) er en af ​​STAT proteinfamilie og konstitutivt aktiv i en lang række humane cancerceller [1]. Aktiverede STAT3 proteiner ved cytokiner og vækstfaktorer danne homo- eller heterodimerer, og derefter translokerer fra cytoplasmaet til cellekernen, hvor de binder til promotoren af ​​forskellige genprodukter, der er involveret i anti-apoptose (bcl-2, bcl-x

L og survivin), proliferation (cyclin D1), og angiogenese (vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF)) [2]. Interessant nok viser nylige undersøgelser, at STAT3 aktiveres som respons på hypoxi, et fælles træk ved forskellige faste tumorer [3], [4]. Aktiveret STAT3 medierer opregulering af hypoxi inducerbar faktor alfa (HIF-1α), til en større regulator tilpasse under hypoxiske betingelser ved at forøge dens stabilitet og transkriptionelle aktivitet [5]. Således nylig STAT3 og HIF-1α er attraktive mål molekyler ved naturlige forbindelser og urteekstrakter i kræftforskning.

Betulinsyre (BA), først rapporteret som et humant melanom-specifik inhibitor, er en triterpenoid hovedsageligt stammer fra bark af den hvide birk (

Betula pubescens

) [6]. Nylige beviser foreslår anti-cancer effekter af BA [7], [8], antiinflammatoriske [9] og anti-viral [10] aktiviteter via forskellige signalveje såsom epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) [11], pindsvin [12], signaltransducer og aktivator for transkription 3 (STAT3) [13] og nuklear faktor-kappa B (NF-KB) [14]. Ikke desto mindre, er der ingen beviser for, at BA medierer anti-cancer aktivitet gennem hæmme STAT3 signalering i solide tumorer.

I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi roller STAT3 og HIF-1 α i BA-induceret anti- angiogene aktivitet i hypoxiske PC-3 prostatacancerceller ved MTT assay, Western blotting, immunocytokemi, ELISA og EMSA.

Resultater

cytotoksiske effekt af betulinsyre (BA) mod PC-3 celler

cytotoksiske virkning af BA (fig. 1) blev vurderet ved MTT-assayet. PC-3-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af BA (0, 12,5, 25, 50 eller 100 uM) i 24 timer. Cellelevedygtighed blev reduceret til 78,49 ± 5,67 og 62,64 ± 1,26% ved koncentrationer på 12,5 og 25 uM, og vedvarende to~60% ved over 25 pM (Fig. 2A).

Molekylvægt = 456.

(A) PC-3-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af BA (0, 12,5, 25, 50 eller 100 uM) i 24 timer. Cellelevedygtighed blev analyseret ved MTT-assayet. (B) Celler blev eksponeret for normoxi eller hypoksi i 0,5, 2, 4, 6, 8, 12 eller 24 timer. Cellelysater blev fremstillet og underkastet Western blotting for at bestemme ekspressionen af ​​HIF-1α. (C) Celler blev behandlet med eller uden BA (5 eller 10 uM) under normoxiske eller hypoxisk tilstand i 4 timer. Cellelysater blev fremstillet og underkastet Western blotting for at bestemme ekspressionen af ​​HIF-1α. (D) kerneekstrakt blev fremstillet fra cellerne behandlet med BA (0, 10, 20 eller 40 uM) under normoxi eller hypoksi i 4 timer. HIF-1α transskription aktivitet blev målt ved hjælp Transam HIF-1 transkriptionsfaktor assaykit. Data repræsenterer middelværdier ± S.D.

##, s 0,01

vs

normoxi kontrol, og

*, p 0,05 og

** 0.01

vs

hypoxi kontrol.

Effekt af betulinsyre (BA) på hypoxi-induceret HIF-1α aktivering i PC-3 celler

Hypoxi er kendetegnende af faste tumorer [15] og HIF-1α er en transkriptionsfaktor, reaktioner på hypoksi [16]. For at undersøge, om BA kan påvirke HIF-1α induceret af hypoxi, vi først bestemt det bedste tidspunkt af hypoxi-induceret HIF-1α udtryk i PC-3 celler. Celler blev eksponeret for normoxi eller hypoksi i 0,5, 2, 4, 6, 8, 12 eller 24 timer. HIF-1α ekspression blev dramatisk induceret under hypoxiske betingelse for 4 h (fig. 2B). Derefter blev celler behandlet med eller uden BA under hypoxi i 4 timer. BA faldt hypoxi-induceret HIF-1α ekspression i en dosisafhængig måde sammenlignet med hypoxi kontrol (fig. 2C). Desuden hypoxi betydeligt aktiveret HIF-1α transskription mens BA behandling inhiberede hypoxi transkriptionel aktivering af HIF-1α på en dosis-afhængig måde (Fig. 2D). Disse resultater antyder, at BA har evnen til at inhibere ekspressionen samt transkription af HIF-1α i hypoxisk PC-3-celler.

Virkning af betulinsyre (BA) hypoxi-induceret STAT3-aktivering i PC-3 celler

Nylige undersøgelser rapporteret, at en transkriptionsfaktor STAT3 er involveret i den transskriptionelle regulering af HIF-1α [17]. I vores undersøgelse, hypoxi forbedret phospho-STAT3 niveau, mens normoxi ikke påvirkede den. BA behandling inhiberede hypoxiamedieret STAT3 phosphorylering på en dosis-afhængig måde (Fig. 3A). Endvidere viste den EMSA at BA forhindrede STAT3 /DNA-bindingsaktivitet under hypoxi på en dosis-afhængig måde (Fig. 3B). Endvidere imunocytochemical (ICC) farvning med anti-HIF-1α antistof viste en signifikant nuklear ekspression af HIF-1α under hypoxiske tilstand. I modsætning hertil BA behandling svækket HIF-1α ekspression i kernen i hypoksiske PC-3-celler (fig. 3C), tyder hæmmende virkning på den nukleare translokation af HIF-1α.

PC-3-celler blev behandlet med eller uden BA (5 eller 10 uM) under normoxiske eller hypoxisk tilstand i 4 timer. (A) Cellelysater blev fremstillet og underkastet Western blotting for phospho-STAT3 og STAT3. (B) Nukleare ekstrakter blev fremstillet og påført EMSA at analysere STAT3-DNA bindingsaktivitet. (C) Celler blev behandlet med eller uden BA (10 uM) under hypoxi. Immuncytokemi blev udført for STAT3. DAB (brun) og hematoxylin-eosin blev anvendt som et substrat og et modfarvning henholdsvis.

Virkninger af betulinsyre (BA) hypoxi-induceret angiogenese

Hypoxi er en af angiogenese induktorer gennem HIF-1α aktivering [18]. Således blev den inhiberende virkning af BA vurderet på hypoxi-medieret angiogenese. VEGF, et kritisk angiogenese faktor [19], blev vurderet ved de udskilte cellulære og proteinniveauer ved ELISA og Western blotting hhv. BA signifikant reduceret VEGF-produktion på en dosis-afhængig måde ved ELISA (fig. 4A). Konsekvent, BA svækket VEGF proteinekspression i en dosis-afhængig måde ved Western blotting (fig. 4B).

(A og B) PC-3-celler blev behandlet med 0, 5 eller 10 uM BA i 24 timer . (A) VEGF-niveauer i kultursupernatanterne blev målt ved anvendelse af et Quantikine VEGF ELISA kit. (B) Cellelysater blev fremstillet og underkastet Western blotting for at bestemme VEGF-ekspression. Grafer repræsenterer relative båndintensiteter af VEGF /β-actin. Data repræsenterer middelværdier ± S.D.

##, s 0,01

vs

normoxi kontrol, og

*, p 0,05 og

** 0,01

vs

hypoxi kontrol. (C) HUVEC’er blev behandlet med VEGF (20 ng /ml) som positiv kontrol eller kultursupernatanten fra PC-3-celler behandlet med eller uden BA (10 uM) under normoxi eller hypoksi. Tube formation assay blev udført under anvendelse af vækstfaktor reduceres Matrigel. Celler blev fikseret med Diff-Quick løsning, fotograferet tilfældigt under en Axiovert S 100 lysmikroskop ved × 100 forstørrelse og talt.

Derudover HUVEC rørdannelse assay, der er kendt som en typisk angiogenese

in vitro

model, blev udført for at bekræfte antiangiogene effekt af BA på hypoxi-medieret angiogenese. VEGF blev anvendt som en positiv kontrol af angiogenese induktion. HUVEC’er blandet med supernatanterne fra PC-3-celler blev dyrket i fravær eller nærvær af BA under hypoxi. Som vist i fig. 4C, hypoxi-induceret rør dannelse blev forhindret af BA behandling i PC-3 celler, mens klar dannelse rør blev udstillet i ubehandlet kontrol under hypoxi, hvilket tyder på, at BA hæmmer hypoxi-medieret angiogenese.

Virkninger af betulinsyre (BA ) på bindingen af ​​STAT3 og HIF1 α til VEGF-promotoren i hypoxiske PC-3-celler

Nylige undersøgelser viste, at STAT3-aktivering er direkte link til den transkriptionelle regulering af VEGF ved binding til VEGF-promotoren [20], [ ,,,0],21]. I lyset af denne begivenhed, vi gennemførte kromatin immunofældning (chip) assay. Som vist i fig. 5A, bindingsaktiviteten af ​​STAT3 og HIF-1α til VEGF-promotoren blev detekteret under hypoxi (bane 5-8) i forhold til normoxi (bane 1-4). Især BA behandling undertrykkes bindingen af ​​STAT3 og HIF-1α til VEGF-promotoren i hypoxisk tilstand (bane 9-12).

(A) PC-3-celler blev behandlet med eller uden BA (10 uM) under normoxi eller hypoksi i 4 timer. Den immunopræcipiterede DNA med kanin normal IgG, HIF-1α eller STAT3 antistof blev amplificeret ved PCR-analyse for VEGF-promotoren. (B) Celler blev transficeret transient med siRNA for scramble eller STAT3 i 24 timer og behandlet med eller uden BA (10 uM) i 18 timer under hypoxi. VEGF-niveauer i kultursupernatanterne blev målt ved anvendelse af et Quantikine VEGF ELISA kit. Data repræsenterer middelværdier ± S.D.

#, s 0,05

vs

kontrol, og

*, p 0,05

vs

kontrol siRNA. Cellelysater blev udsat for Western blotting for phospho-STAT3, STAT3 og HIF-1α.

For at bekræfte den kritiske rolle STAT3 i antiangiogen regulering af BA i hypoxiske PC-3 celler, STAT3 siRNA transfektion blev udført i PC-3-celler. Behandling med enten BA eller STAT3 siRNA reduceret produktionen af ​​VEGF med 39,6% og 45,9% sammenlignet med ubehandlet kontrol. Endvidere BA-behandlingen reducerede VEGF-produktion med 63,25% i STAT3 siRNA-transficerede PC-3-celler (fig. 5B). Western blotting afslørede, at siRNA for STAT3, men ikke styre, effektivt blokeret STAT3 (fig. 5B).

Diskussion

Prostatakræft klassificeret som en adenocarcinom er den anden mest almindelige maligne tumorer i amerikanske mænd , med skøn over 192,280 nye tilfælde og ca. 27,360 dødsfald i 2009 [22], [23]. Betulinsyre (BA), en plante-afledt pentacyklisk lupane-typen triterpenoid, kan udvindes fra forskellige planter, såsom

Sarracenia flava

[24],

Diospyros

spp.,

Inga punctata

[25],

Ziziphus

spp., og

Vauquelinia corymbosa

[26]. Flere grupper rapporterede anti-cancer aktivitet af BA i forskellige kræftformer, herunder lunge, tyk-, bryst-, prostata- og livmoderhalskræft [27], men ikke normale celler [28]. Også, BA fuldstændigt inhiberede tumorvækst uden toksicitet i athymiske mus, der bærer humane melanomer [6]. Desuden blev anti-cancer aktivitet af BA udøves ved at inducere apoptose i cancercellerne. For eksempel, BA-induceret apoptose var uafhængig af p53 i neurorectodermal tumor [29] og melanomceller [30]. I neuroblastomceller, BA-induceret apoptose gennem tab af mitochondriemembranpotential, reaktive ilt arter (ROS) produktion og caspaseaktivering [31].

Interessant, Karna og kolleger for nylig rapporteret, at BA hæmmede ekspressionen af ​​HIF- 1α og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) i humane endometriske cancerceller [32]. Imidlertid er de regulatoriske mekanismer, hvorved BA hæmmer angiogenese ikke fuldt forstået. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at BA undertrykt hypoxiamedieret proteinakkumulering, transkriptionel aktivering og nuklear lokalisering af HIF-1α i PC-3-celler. I overensstemmelse med resultaterne af Karna papir, vores data viste også, at BA signifikant hæmmet VEGF-sekretion og proteinekspression i hypoxiske PC-3-celler. Derudover

in vitro

rør dannelse assay yderligere bekræftet anti-angiogenenic effekt af BA i hypoxiske PC-3 celler.

For nylig Niu og kolleger foreslog, at konstitutivt aktiveret STAT3 opreguleret VEGF og induceret tumorangiogenese [20]. Også, Wei og kolleger rapporterede, at STAT3-aktivering regulerer ekspressionen af ​​VEGF og human pancreascancer angiogenese Endvidere beskrev flere papirer rolle STAT3 som en potentiel modulator af HIF-1α-induceret VEGF-signalering i cancerceller [4], [33] . I denne forbindelse blev virkningen af ​​BA på STAT3 og HIF-1α aktivering undersøgt i hypoxiske PC-3 celler i vores undersøgelse. I overensstemmelse med beviser fra Pandey og kolleger, at BA undertrykt STAT3 aktivering i myelomatose celler [13], BA forhindrede hypoxi-induceret tyrosinphosphorylering, DNA bindende aktivitet og nuklear translocalization af STAT3, hvilket tyder på den hæmmende effekt af BA på STAT3 aktivering.

VEGF promotor indeholder forskellige transskription faktor bindingssteder herunder STAT3 [20] samt HIF-1 [34]. Fysisk vekselvirkning af STAT3 med HIF-1 styrer VEGF transkriptionel aktivering med deres binding til VEGF-promotoren [4]. I vores undersøgelse, hypoxi fremmet binding af STAT3 og HIF-1α til VEGF-promotoren i PC-3-celler. I modsætning hertil BA inhiberede bemærkelsesværdigt bindingen af ​​STAT3 og HIF-1α til VEGF-promotoren websted under hypoxiske tilstand. Derudover tavshed STAT3 bruge sin specifikke siRNA væsentligt forbedret BA-medieret hæmning af VEGF produktion, hvilket indebærer inddragelse af STAT3 i antiangiogen regulering af BA i hypoxiske PC-3 celler. Svarende til vores undersøgelse, Gariboldi og kolleger rapporterede, at NVP-AEW541, en IGFR1 inhibitor, forstyrret IGF /STAT3 /HIF1 vej hos humane glioblastom-celler [35]. Leeman-Neill og hans kolleger rapporterede også, at Guggulsteron hæmmede STAT3 og HIF-1α og foreslog en biologisk begrundelse for yderligere klinisk undersøgelse BA for menneskelig hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) terapi [36].

Kollektivt, vores data viser, at BA undertrykt ekspression og transaktivering af hypoxi-induceret HIF-1α, STAT3, VEGF samt kapillarrør dannelse i PC-3-celler. Det er bemærkelsesværdigt, at anti-cancer aktivitet af BA udøves ved at hæmme angiogenese via hæmning af binding af STAT3 og HIF-1α til VEGF-promotoren i PC-3-celler. Således er vores fund tyder på, at BA kan være en potent anti-angiogent middel ved at målrette STAT3 /HIF-1α /VEGF signalering for prostatakræft terapi.

Materialer og Metoder

Forbindelser

betulinsyre (BA) (figur 1) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) og opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) som en 10 mM stamopløsning til eksperimentel brug.

Cellekultur

human prostatacancer-cellelinie PC-3 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) og opretholdt i RPMI1640 (Welgene, Daegu, Korea) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotisk-antimyotic opløsning. Humane umbilical vene-endotelceller (HUVEC’er) blev isoleret fra frisk humant navlestreng vene og opretholdt i EBM-2 (Lonza, Valais, Schweiz) suppleret med 2% FBS, 0,04% hydrocortison, 0,1% VEGF, 0,1% IGF-1, 0,4 % hFGF-B, 0,1% hEGF, 0,1% ascorbinsyre og 1% heparin.

Hypoxi induktion

Celler blev inkuberet i anaerob inkubator ved 94% N

2, 5% CO

2 og 1% O

2 (Thermo videnskabelige, Rockford, IL) som tidligere beskrevet [37].

cytotoksicitet assay

for at vurdere cytotoksicitet BA, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay blev udført som tidligere beskrevet [38]. PC-3-celler blev udpladet på 96-brønds mikroplader med en tæthed på 1 x 10

4 celler per brønd og udsat for forskellige koncentrationer af BA (0, 12,5, 25, 50 eller 100 uM) i 24 timer. MTT-opløsning (1 mg /ml) (Sigma-Aldrich) blev tilsat på hver brønd og inkuberet i 2 timer ved 37 ° C. Ekstraktionsbuffer (20% SDS og 50% dimethylformamid) blev derefter tilsat, og optisk densitet (OD) blev målt ved anvendelse mikropladelæser (Tecan Austria GmbH, Grödig, Østrig) ved 570 nm. Cellelevedygtighed blev beregnet som en procentdel af levedygtige celler i BA-behandlede gruppe versus ubehandlet kontrol ved følgende ligning

Cellelevedygtighed (%) = [OD (BA) – OD (Blank)]. /[OD (kontrol ) – OD (Blank)] x 100

Western blot-analyse

helcelle ekstrakter blev fremstillet under anvendelse af lysepuffer [50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% Triton X -100, 0,01% SDS, 1 mM EDTA (pH 8,0) og proteaseinhibitorcocktail tabletter (Roche Applied Science, Inndianapolis, IN)]. Nuclear og cytoplasmatiske ekstrakter blev opnået ved fraktioneret ved hjælp af NE-PER nukleare og cytoplasmatiske udvinding reagenser (Thermo videnskabelige, Rockford, IL). Proteinprøver blev adskilt på 10% SDS-PAGE-gel og overført til en nitrocellulosemembran. Membranen blev blokeret i 5% fedtfri skummetmælk og probet med primære antistoffer for HIF-1α (1:500, Gene Tex, Irvine, CA), STAT3 (1:1000, Cell Signaling, Danvers, MA), phospho-STAT3 (1:500, Cell Signaling, Danvers, MA), VEGF (1:500, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) og β-actin (Sigma, St. Louis, MO) natten over ved 4 ° C. Membranerne blev eksponeret for HRP-konjugerede sekundære antistoffer i 2 timer ved stuetemperatur og proteinekspression blev detekteret ved anvendelse af forøget kemiluminescens (ECL) Western blotting påvisningsreagens (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ).

HIF-1α transskription aktivitetsassay

HIF-1α transkriptionel aktivitet blev analyseret ved HIF-1α transskriptionsfaktor assay under anvendelse Transam HIF-1 transkriptionsfaktor assaykit (Active Motif, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev kerneekstrakter tilføjet på 96-brønds mikroplade overtrukket med oligonukleotider indeholdende hypoxi responselement (HRE) (5′-TACGTGCT-3 ‘) fra erythropoietin (EPO) genet. HIF dimerer stede i kerneekstrakter binder med høj specificitet til dette reaktionselement og efterfølgende detekteres med et antistof rettet mod HIF-1α. Tilsætning af et sekundært antistof konjugeret til peberrodsperoxidase (HRP) giver et følsomt kolorimetrisk udlæsning, der er let kvantificeret ved spektrofotometri. Værdier er udtrykt som optisk densitet (OD) ved 450 nm med en referencebølgelængde på 655 nm.

Immuncytokemi

PC-3-celler blev podet på 4-chamber slides ved en densitet på 3 × 10

4 celler pr kammer og behandles enten med eller uden BA (10 uM) under hypoksi som tidligere beskrevet [37]. Cellerne blev fikseret i 4% formaldehydopløsning i 10 minutter ved stuetemperatur og blokeret i blokeringspuffer (10% BSA /Triton X-100 i PBS) indeholdende 6% hesteserum i 1 time ved stuetemperatur. Objektglassene blev inkuberet med anti-STAT3 (1: 100) antistof natten over ved 4 ° C og derefter probet med anti-mus eller kanin biotinylerede antistoffer (Vector Labs, Burlingame, CA) i 1,5 timer ved stuetemperatur. Ekspressionen blev detekteret ved anvendelse af Vector ABC-kompleks /HRP kit (Vector Labs, Burlingame, CA) og farve-udviklet med 3,3′-diaminobenzidintetrahydrochlorid i mørke. Prøverne blev derefter kontrastfarvet med hæmatoxylin-eosin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og analyseret under et mikroskop (Leica Microsystems Res., Wetzlar, Tyskland).

Elektroforetisk mobilitet (EMSA)

STAT3-DNA binding blev analyseret ved elektroforetisk mobility shift-assay (EMSA) under anvendelse Gelshift Chemiluminescent EMSA kit (Active Motif, Carlsbad, CA) som tidligere beskrevet [39]. Kort fortalt blev kerneekstrakter fremstillet ud fra anethol-behandlede celler og inkuberet med STAT3 konsensus oligonukleotider (5′-CTT CAT TTC CCG TAA ATC CCT AAA GCT-3 ‘) (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA). DNA-proteinkompleks dannes, skilles fra frie oligonukleotider på 5% native polyacrylamidgeler. Kemiluminescerende detektion blev udført ved hjælp af ECL reagenser i henhold til leverandørens protokoller (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ).

In vitro rør dannelse assay

In vitro dannelse rør assay blev udført som tidligere beskrevet [40]. Matrigel (BD) blev tilsat på 24-brønds plader og polymeriseres ved inkubation i 1 time ved 37 ° C. HUVEC’er blev podet på Matrigel overtrukne plader og inkuberet i EBM-2 supplementeret med VEGF (20 ng /ml) eller supernatanten fra PC-3-celler behandlet med BA (0 eller 10 uM) under normoxi eller hypoksi i 24 timer. Efter 8 timers inkubation blev cellerne fikseret med 4% formaldehyd og tilfældigt valgte områder blev fotograferet under en Axiovert S 100 lysmikroskop (Carl Zeiss, Weimar, Tyskland) ved 100 × forstørrelse.

enzymmaerket assay ( ELISA) for VEGF

PC-3-celler blev udpladet på 60-mm-skål med en tæthed på 1 x 10

6 celler /plade og inkuberet i fravær eller nærvær af BA (10 uM) under normoxi eller hypoxi i 24 timer. VEGF-niveau i supernatanten blev målt ved anvendelse af human VEGF ELISA kit ifølge producentens protokol (Biosource International Inc., Camarillo, CA).

chromatin immunoprecipitation (chip) assay

PC-3 celler blev udpladet på 100 mm skåle ved en densitet på 1,5 × 10

6 celler /skål, behandledes med BA i 4 timer under normoxiske eller hypoxisk tilstand og derefter 1% formaldehyd og 0,125 M glycin. Opløselige kromatin blev isoleret ved anvendelse af EZ-zyme chromatin prep kit (Millipore, Billerica, MA) og immunpræcipiteret med antistoffer af normalt kanin IgG (EMD Biosciences, Gibbstown, NJ), HIF-1α eller STAT3. Histon /DNA tværbindinger blev tilbageført ved tilsætning af 5 M NaCl ved 65 ° C i 4 timer, efterfulgt af phenol /chloroform-ekstraktion og ethanolfældning. PCR-reaktion blev udført for at forstærke VEGF promotor hjælp chip primere (sense 5′-AGACTCCACAGTGCATACGTG-3 ‘og antisense 5′-AGTGTGTCCCTCTGACAATG-3’.

siRNA trasnfection

PC-3 celler var forbigående transficeret med scramble eller STAT3 siRNA (SantaCruz bioteknologi, SantaCruz, CA) ved 50 nM ved hjælp INTERFERin siRNA transfektionsreagens (POLYPLUS-transfektion Inc., New York, NY). efter inkubation i 24 timer blev cellerne behandlet med BA og vedligeholdes i 18 timer under hypoxi.

Statistisk analyse

Alle data blev udtrykt som middelværdi ± SD Statistisk signifikans blev analyseret ved t-test.