PLoS ONE: Menneskelig Subperitoneal fibroblast og Kræft Cell Interaction Opretter mikromiljø Det Forbedrer Tumor Progression og Metastase

Abstrakt

Baggrunde

Peritoneal invasion i tyktarmskræft er en vigtig prognostisk faktor. Peritoneal invasion objektivt kan identificeres som periotoneal elastisk laminal invasion (ELI) ved anvendelse elastica pletten, og cancer mikromiljø dannet af kan også iagttages det peritoneale invasion (CMPI). Sager med ELI viser oftere fjernmetastaser og gentagelse. Derfor kan CMPI repræsentere en bestemt miljø, der letter tumorprogression. Patologiske og biologiske undersøgelser CMPI kan kaste lys over dette muligvis særprægede kræft mikromiljø.

Metoder

Vi analyserede områdespecifikke væv microarrays at bestemme de patologiske funktioner i CMPI, og opformeret subperitoneal fibroblaster (fondene for mindre projekter ) og submukøse fibroblaster (Standard MIDI) fra human colon væv. Biologiske egenskaber og resultater af genekspressionsprofil analyser blev sammenlignet for bedre at forstå den peritoneale invasion af tyktarmskræft og hvordan dette kan danne en særlig mikromiljø gennem interaktion med fondene for mindre projekter. Mus xenotransplantattumorer, afledt ved co-injektion af kræftceller med enten fondene for mindre projekter eller Standard MIDI, blev oprettet for at vurdere deres aktive rolle på tumorprogression og metastase.

Resultater

Vi fandt, at fibrose med alfa glatmuskelactin (α-SMA) ekspression var en betydelig patologisk træk ved CMPI. Forskellene i proliferation og genekspression profil analyser foreslået fondene for mindre projekter og Standard MIDI var forskellige populationer, og at fondene for mindre projekter var præget af en højere udtryk for ekstracellulær matrix (ECM) associeret gener. Desuden sammenlignes med Standard MIDI, viste fondene for mindre projekter mere variabel ændring i gen udtryk efter kræft-celle-medium stimulation. Gene ontologi analyse afslørede, at fondene for mindre projekter-specifikke opreguleres gener blev beriget ved actinbindende eller kontraktile-associerede gener herunder α-SMA kodende ACTA2. Mus xenotransplantattumorer afledt ved co-injektion af kræftceller med fondene for mindre projekter viste forøgelse af tumorvækst, metastase, og kapacitet til tumordannelse i forhold til dem, der stammer fra co-injektion med kræftceller og Standard MIDI.

Konklusioner

CMPI er en speciel mikromiljø, og samspillet mellem fondene for mindre projekter og cancerceller inden CMPI fremme tumorvækst og metastase

Henvisning:. Kojima M, Higuchi Y, Yokota M, Ishii G, Saito N, Aoyagi K, et al. (2014) Menneskelig Subperitoneal fibroblast og Kræft Cell Interaction Opretter mikromiljø Det Forbedrer Tumor Progression og metastase. PLoS ONE 9 (2): e88018. doi: 10,1371 /journal.pone.0088018

Redaktør: Soroku Yagihashi, Hirosaki University Graduate School of Medicine, Japan

Modtaget: 27. september 2013; Accepteret: 2 januar 2014; Publiceret: 4 februar 2014

Copyright: © 2014 Kojima et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af JSP’er KAKENHI tilskud nummer 24590458, og et tilskud på en 3. sigt Omfattende 10-årig strategi for Cancer Kontrol (23-a-3). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Selvom tumorstørrelse er en vigtig prognostisk faktor i mange cancere, prognose gastrointestinal kræft er stratificeret ikke af tumorstørrelse men af ​​tumorspredning [1]. Peritoneal invasion i kolorektal cancer er blevet rapporteret at være en stærk prognostisk faktor, men dette udtryk var ikke veldefineret, og detektion og diagnose metoder er blevet afhørt [2] – [4]. Nylige patologiske rapporter har vist, at elastica plet, som fremhæver peritoneal elastiske lamina nær periotoneal overflade, er nyttig til objektiv detektion af peritoneal invasion. Vi og andre har bestemt, at peritoneal invasion defineret som tumor invasion ud over den peritoneal elastiske lamina (elastisk laminal invasion: ELI) er en stærk prognostisk faktor, der kan påvirke fremtidige pT kriterierne i Union for International Cancer Control (UICC) TNM klassifikation [5] – [7]. Bughinden er en meget tynd membran, inden 500 um tyk, og det peritoneale elastiske lamina eksisterer inden denne membran. Hyppigheden af ​​synkrone metastase og tilbagefald øges med 2 til 4 gange, når en tumor invaderer dette snævre rum [5]. Disse resultater kan antyde, at tumorprogression og metastase er lettet ved en cancer mikromiljø dannet af peritoneal invasion (CMPI). Omfanget af CMPI kan identificeres ved hjælp elastica plet, og kan også bestemmes patologiske træk ved CMPI.

Et væv microarray letter evalueringen af ​​proteinekspression for et stort antal vævsblokke fra et enkelt eksemplar, og områdespecifikke væv microarrays er blevet rapporteret at være anvendelige til at studere specifikke tumor områder i store kohorter [8]. Efter bestemmelse af CMPI ved hjælp elastica plet, kan et væv kerne opnås fra dette område, og kan også udføres en sammenligning med trækkene ifølge andre tumorområder. Denne proces kan foretages en vurdering af de vigtige biologiske fænomener, der forekommer i denne kræftform mikromiljø.

Nylige fremskridt i kræftforskning har etableret begrebet kræft mikromiljø, der fremmer tumor initiering, invasion, og metastase [9]. Selvom cancer mikromiljø er sammensat af mange typer af celler, kan anvendelsen af ​​områdespecifikke væv microarrays tillade fokus på cellekomponenter der karakteriserer CMPI. Desuden, hvis disse cellekomponenter kan dyrkes fra histologisk tilsvarende subperitoneal region, en biologisk undersøgelse for at belyse denne formodede kræft-fremme mikromiljø kan udføres.

Formålet med denne undersøgelse var at forklare, hvordan kolorektal cancer prognose påvirkes af peritoneal invasion. Vi konstruerede område-specifikke væv microarray system til at bestemme de karakteristiske cellekomponenter af CMPI. Dernæst vi dyrkede specifikke fibroblast subpopulationer fra det submukøse og subperitoneal lag af det humane colon-væg. De biologiske egenskaber og gen-profiler af submukøse fibroblaster (Standard MIDI) og subperitoneal fibroblaster (fondene for mindre projekter) med eller uden cancer-celle-konditioneret medium (CCCM) stimulering blev sammenlignet. Efterfølgende konstruerede vi xenotransplantattumorer ved co-injektion af cancerceller med enten fondene for mindre projekter eller Standard MIDI. Vores undersøgelse foreslået en ny kandidat til en kræft-fremmende mikromiljø i tyktarmskræft og belyst fondene for mindre projekter som afgørende aktører i styrkelsen af ​​tumorprogression og metastase.

Patienter og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af National Board Cancer center Hospital East Institutional Review (No: 19-021). En skriftlig generel tilladelse til at anvende biologiske materialer til forskning blev opnået fra hver deltager før overtagelsen væv. Dyreforsøg blev godkendt af Animal Ethics Committee for National Cancer Center Hospital East (K11-032).

Patient Karakteristika og Påvisning af ELI

Fire hundrede konsekutive patienter med TNM klassifikation (5

th edition) pT3 og pT4a tyktarmskræft [10], der gennemgår kirurgi mellem 1996 og 2003 på National cancer center Hospital East, blev indrulleret. Brug elastica plet, vi identificeret 173 sager med ELI og yderligere undersøgt disse ved hjælp af områdespecifikke væv microarrays [5], [8]. Af de 173 sager med ELI, 107 var pT3 og 66 var pT4a.

Konstruktion af områdespecifikke væv Microarrays

For at belyse de patologiske funktioner i CMPI i tyktarmskræft væv, vi definerede kræft mikromiljø som følger: (a) CMPI har en tumor grænse med peritoneal invasion og (b) cancer mikromiljø dannet af submukøst invasion (CMSI) har en submukøs invasiv tumor grænsen (figur 1A) [5]. Det 2-punkts væv microarray blev derefter etableret som tidligere beskrevet [8]. Hver tumor område blev markeret med blæk på den histologiske slide; et enkelt væv kerne på 2 mm i diameter blev opnået fra hver cancer mikromiljø og overført til en modtager-blok under anvendelse af en Tissue Microarrayer (Azumaya, Tokyo, Japan). I 24 tilfælde blev utilstrækkelig kræft væv opnået fra CMPI. Blev imidlertid tilstrækkeligt væv opnået i 149 tilfælde; disse blev analyseret histologisk og immunhistokemisk (se materialer og metoder S1, og tabel S1).

(A) Skematisk af kræft mikromiljø dannet ved peritoneal invasion (CMPI) og cancer mikromiljø dannet af submukøst invasion (CMSI) defineret som (a) invasiv front med peritoneal invasion og (b) submukøst invasiv forreste hhv. (B) Fordelingen af ​​fibrose i human tyktarmskræft væv. Mørke grå søjler viser antallet af tilfælde med fibrose over 50% af kernen fra hver tumor område, og lys grå søjler viser antallet af de sager uden omfattende fibrose. Core prøver med CMPI viste en højere frekvens af markant fibrose end gjorde kerneprøver med CMSI (

P

0,01). (C) Fordeling af α-SMA-ekspression i human coloncancer væv. CMPI viste højere α-SMA udtryk end dem, der ses i CMSI (

P

0,01). (D) Fordeling af CD3-positive celler i human coloncancer væv. Antal CD3-positive celler var ikke signifikant forskellig mellem CMPI og CMSI. (E) Fordeling af CD68-positive celler i humant tyktarmskræft væv. Antal CD68-positive celler var ikke signifikant forskellig mellem CMPI og CMSI. (F) Fordeling af CD31-positive skibe i humant tyktarmskræft væv. Numre af CD31-positive skibe var ikke signifikant forskellig mellem CMPI og CMSI. Resultater i (B) bliver præsenteret af sagsnumre, og dem i (C-F) er præsenteret som gennemsnit ± SD af 149 sager (**

P

0,01).

Antistoffer, Regents, og Immunhistokemi

de antistoffer, reagenser og de immunhistokemiske procedurer anvendes, er beskrevet i Materialer og metoder S1 og tabel S2.

Evaluering af områdespecifikke Tissue Microarray Sektioner

høj opløsning lysbilederne blev erhvervet fra alle væv kerner med hæmatoxylin-eosin (HE) og immunhistokemi farvning hjælp NanoZoomer 2.0-HT slide scanner (Hamamatsu fotonik, Hamamatsu, Japan). Alle kerner blev undersøgt ved hjælp af seeren software (NDP view: Hamamatsu fotonik, Hamamatsu, Japan). Når området af fibrose oversteg 50% af en hel væv kerne med en diameter på 2 mm ved H.E farvning, blev det defineret som positivt for markant fibrose. På immunhistokemisk farvning, hot spots med CD3-, CD31- og CD68-positive var celler eller fartøjer valgt i fremviseren software, så et billede af x20 forstørrelse (0,51 mm

2) blev taget, og gemt som en JPEG-fil . Positive celler eller fartøjer blev talt i hvert billede ved hjælp af morfometrisk software (WinRoof, Mitani Corporation, Fukui, Japan). Desuden blev området med højeste alpha glatmuskelactin (α-SMA) udtryk i fibroblaster valgt, så en x20 forstørrelse (0,51 mm

2) billede blev taget, og gemt som en JPEG-fil. Forholdet mellem α-SMA positive område i billedet, blev beregnet ved anvendelse af morfometrisk software, som tidligere [11] beskrevne. Den α-SMA-ekspression i normalt muskelvæv, som bestemt ved sammenligning med en seriel H.E slide, blev ikke evalueret. HE og immunhistokemiske farvning data for CMPI blev sammenlignet med CMSI at belyse de histologiske karakteristika CMPI.

Primære celler og cellelinier

Submukøs væv blev opnået fra sigmoid kolon væv mere end 5 cm fjernt fra tumoren. Colonvæv blev dissekeret fra det muskulære lag på den luminale side, og lamina propria og mucosale lag væv blev opnået. Dernæst blev lamina propria skrubbes væk for at få submucosavæv. Subperitoneal væv blev opnået fra sigmoid colon mesenterium på mere end 5 cm fjernt fra tumoren ved hjælp opererer pincet og saks. Disse væv blev vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) og inkuberet i 5% trypsin i 20 minutter, 3 gange. Supernatanten blev centrifugeret, udpladet på et fad, og submukøse fibroblaster (Standard MIDI) og subperitoneal fibroblaster (fondene for mindre projekter) blev opnået og derefter dyrket og opretholdt i MF-medium (Toyobo, Tokyo, Japan) [12]. Alle forsøg blev udført på celler i 8 passager.

De humane kolorektal cancer cellelinjer DLD-1 og Caco-2 blev opnået fra American Type Culture Collection og dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) indeholdende 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), og 10% føtalt bovint serum (FBS;. Gibco, Palo Alto, CA)

Cell Proliferation assay, immuncytokemisk farvning, og flowcytometri Analyse

celleproliferationsassays, immuncytokemisk farvning, og flowcytometri analyser blev udført som beskrevet i Materialer og metoder S1.

Stimulering af fibroblaster af Cancer Cell Medium

Oprindeligt 1,7 × 10

4 /cm

2 af fibroblaster og DLD-1-celler blev dyrket separat i DMEM indeholdende 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, og 10% FBS i 48 timer og derefter blev sultet i 24 timer. Dernæst blev mediet fjernet fra fibroblasterne, og mediet fra de udsultede DLD-1-celler blev sat til fibroblasterne i 24 timer for at etablere fibroblaster med cancer-celle-konditioneret medium (CCCM) stimulation. Som kontrol blev fibroblaster sultet i 48 timer (hvilket giver fibroblaster uden CCCM). Fondene for mindre projekter og Standard MIDI enten med eller uden CCCM blev vurderet ved hjælp af immuncytokemi eller genekspression analyse. Med hensyn til vurderingen af ​​immuncytokemisk α-SMA udtryk, blev området med højeste α-SMA-ekspression valgt, så en x20 forstørrelse (0,51 mm

2) billede blev taget, og gemt som en JPEG-fil. Forholdet mellem α-SMA positive område i billedet blev beregnet ved anvendelse af morfometrisk software (WinRoof, Mitani Corporation, Fukui, Japan).

Gene Expression Analysis hjælp Microarray

Tre sæt fondene for mindre projekter og Standard MIDI enten med eller uden CCCM, opnået fra 3 forskellige patienter, blev anvendt i denne undersøgelse. Vi brugte GeneChip Human Genome U133 Plus 2,0 arrays (Affymetrix, Santa Clara, Californien). Target cDNA blev dannet fra 100 ng af total RNA ekstraheret fra hver prøve ved anvendelse af en 3 ‘IVT Express Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA). Procedurerne for target-hybridisering, vask og farvning for signalforstærkning blev udført ifølge leverandørens protokoller. Opstillingerne blev scannet med en Gene Chip Scanner 3000 (Affymetrix, Santa Clara, CA), og intensiteten af ​​hvert element i arrayet blev beregnet ved hjælp GeneChip Operating Software, Version 1.1.1 (Affymetrix, Santa Clara, CA). Den gennemsnitlige intensitet blev standardiseret til målet intensitet, som blev sat lig med 1000, til pålideligt sammenligne forskellige arrays. Værdierne var log transformeret og median centreret. Den programmer GeneSpring (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) og Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA) blev anvendt til at udføre den numeriske analyser for gen-valg.

xenotransplantat Transplantation og tumordannelse Assay

enten 1 × 10

6 humane kolorektal kræftceller Caco-2 eller DLD-1 alene, eller sammen med enten 1 × 10

6 fondene for mindre projekter eller Standard MIDI, blev injiceret subkutant (sc) ind i bagsiden af ​​SCID-mus (8 -12 ugers alderen; Clea, Tokyo, Japan). Tumorvolumener blev beregnet ugentligt som tidligere [13] beskrevne. Mus injiceret med Caco-2 alene eller sammen med enten fondene for mindre projekter eller Standard MIDI blev dræbt efter 10 uger, og dem injiceret med DLD-1 alene eller med enten fondene for mindre projekter eller Standard MIDI blev dræbt efter 8 uger, og tumorvægte blev evalueret. For fjernt metastatisk analyse blev lunge- og levervæv fjernet og fikseret i 10% formalin, og til analyse af lymfeknudemetastase, hals og inguinale fedtvæv blev også fjernet og fikseret; alle væv blev histologisk undersøgt. Vi anvendte 8 mus i hver gruppe.

For at belyse kapacitet fibroblaster kan forbedre tumordannelse seriefortyndinger af Caco-2 eller DLD-1 cancerceller blev tilsvarende co-injiceret med enten 1 x 10

6 Standard MIDI eller fondene for mindre projekter. Tumordannelse bedømtes 4 uger efter injektionen. Vi brugte 4 mus for hver gruppe.

Statistisk analyse

X

2 test og Students

t

testen blev anvendt i vævet microarray analyse, celleproliferationsassay, xenotransplantat transplantation, og tumordannelse assay. En

P

0,05 blev defineret som statistisk signifikant. I microarray analyse blev genekspression analyseres data ved brug GeneSpring GX12 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Row data blev opsummeret ved at bruge MAS5 og normaliseret ved log transformation og median centrering for numerisk analyser for gen-valg. For principal komponent analyse (PCA), brugte vi probe sæt, som pålideligt blev målt og varierede med 3 gange over den globale medianen i mindst 2 prøver (ca. 10%); analyser blev udført ved hjælp GeneSpring GX12. De differentielt udtrykte probesæt anvendes i overvåget hierarkisk klyngedannelse blev udvalgt på grundlag af

P

0,05 og fold ændring (FC) 2,0.

P

værdier blev beregnet ved hjælp af en ANOVA med Benjamini og Hochberg FDR multipel testning korrektion. Hierarkisk klyngedannelse med vægt-gennemsnittet kobling klyngedannelse blev udført ved hjælp af Cluster og TreeView programmer (Michael Eisen, Stanford University, genome-www.stanford.edu). Den funktionelle annotation gruppering af Gene ontologi Berigelse analyse blev udført ved hjælp af DAVID software, med stringens klassifikation sat til “High”, og de betydelige klynger blev udvalgt på grundlag af en berigelse score 2,0 og en

P

0,01 (Fishers eksakte test efter Benjamini og Hochberg FDR korrektion multiple test) [14], [15].

Resultater

histologiske træk af ELI

Ikke kun tumorceller, men også sorter af stromaceller udgør et særskilt cancer mikromiljø, og nogle fremme tumormetastase [9]. Først, vi belyst de betydelige histologiske træk CMPI at belyse fænomener forekommer i dette miljø ved hjælp af områdespecifikke væv microarrays. De klinisk-patologiske træk ved de 149 tilfælde anvendte er vist i tabel S1. På H.E farvning, fandt vi omfattende fibrose (over 50%) hyppigere i CMPI end der blev set i CMSI (figur 1B). Forholdet mellem α-SMA positive område i CMPI var også højere end hos CMSI (figur 1C). Andelene af T-lymfocytter, makrofager eller mikrokar evalueret under anvendelse CD3, CD68, eller CD31 henholdsvis var ikke signifikant forskellig mellem CMPI og CMSI (figur 1D-F). Både i CMPI og CMSI, fyldigt spindelformede fibroblaster var væsentlig kilde til α-SMA-ekspression, og forholdet blev succesfuldt analyseret ved hjælp af morfometrisk software (Figur 2A-D). Overvejer vores tidligere resultater, som angav, at peritoneal invasion defineret af ELI var tæt knyttet til fjernmetastaser, vi den hypotese, at fibroblaster i subperitoneal lag kunne være impliceret ikke kun i fremtrædende fibrose og aktivering, men også i tumorens progression og metastase. Derefter besluttede vi at isolere fibroblaster fra subperitoneal lag, der histologisk svarede til peritoneal invasion. Fibroblaster fra det submukøse lag blev anvendt som kontroller. Salg

(A) histologiske træk af stromal komponent i CMPI. Både i CMPI og kræft mikromiljø dannet af submukøs invasion (CMSI), buttet spindel-formet fibroblaster var vigtigste kilder til stroma. (B) mærket α-SMA-ekspression blev fundet i fibroblaster. (C) Højere forstørrelse tydeligere afslørede fyldige spindelformede fibroblaster. (D) Ved hjælp af morfometrisk software, vi med succes opdaget og analyseret α-SMA udtryk.

Isolering og karakterisering af dyrkede humane fondene for mindre projekter og Standard MIDI

I første omgang vi vurderet den morfologiske og biologiske karakteristika af fondene for mindre projekter og Standard MIDI i en normal tilstand. Både dyrkede humane fondene for mindre projekter og Standard MIDI viste lignende spindel-formet morfologiske egenskaber (Figur S1A-B). Fondene for mindre projekter og Standard MIDI fra 3 patienter kunne dyrkes over 10 passager, bortset fra 1 SPF tilfælde (data ikke vist). Immunocytokemi og flowcytometri afslørede de opnåede fondene for mindre projekter og Standard MIDI stemte overens med fibroblaster (figur S1c-D). Vi fandt svag α-SMA-ekspression i et par fondene for mindre projekter og Standard MIDI. Den fordoblingstid for fondene for mindre projekter og Standard MIDI var 79,9 timer og 36,3 timer henholdsvis og væksten i Standard MIDI var hurtigere end fondene for mindre projekter (

P

0,05), der foreslog en biologisk forskel mellem fondene for mindre projekter og Standard MIDI ( Figur S1E).

Gene Expression Profiling sammenligning mellem fondene for mindre projekter og Standard MIDI

for at vurdere de fænotypiske forskelle mellem fondene for mindre projekter og Standard MIDI, genekspressionsprofilerne af fibroblaster med eller uden CCCM stimulering blev sammenlignet. PCA afslørede 4 forskellige klynger, afhængigt af deres oprindelse og CCCM stimulation, som overvandt den individuelle variation (figur 3A og B). Overvåget klyngeanalyse afslørede også 4 forskellige klynger (figur 3C). Dette indikerede den fænotypiske forskel i fibroblaster i colon væg. Og denne forskel afhang af histoanatomical placering. Desuden reaktionen på CCCM stimulation var også anderledes.

(A) Rød er microarray profil i Standard MIDI med CCCM stimulation, blå er Standard MIDI uden CCCM stimulation, grøn er fondene for mindre projekter med CCCM stimulation, og sølv er fondene for mindre projekter uden CCCM stimulation. Tredimensionel fremstilling af principal komponent analyse (PCA) komponent 1, 2, og 3. (B) To dimensional repræsentation af PCA komponenter 1 og 2 (øvre) og PCA komponenter 1 og 3 (lavere). Fibroblaster dannet uafhængige klynger, afhængigt histoanatomical websted og tilstedeværelsen af ​​CCCM stimulering. (C) Overvåget klyngeanalyse i fibroblaster viste også distinkte klynger afhængigt histoanatomical websted og tilstedeværelsen af ​​CCCM stimulering. (D) Gene ontologi analyse af opregulerede gener i fondene for mindre projekter sammenlignet med Standard MIDI. (E) Gene ontologi analyse af gener opreguleret i fondene for mindre projekter med CCCM stimulation sammenlignet med Standard MIDI med CCCM stimulation. De fleste af de gener med øgede udtryk i fondene for mindre projekter blev bevaret efter CCCM stimulation; men der var nogle forskelle, og rækkefølgen af ​​annotation klynger blev ændret efter CCCM stimulation.

Næste, vi sammenlignet genekspression profiler i disse fibroblaster med og uden CCCM stimulation, separat (Figur 3D-E ). Data fra fondene for mindre projekter uden CCCM stimulering blev beriget af genet ontologi (GO) udtrykkene “ekstracellulære matrix” og “proteinholdige ekstracellulær matrix”, som dannede annotation klynge 1. Major expracellular matrix (ECM) komponenter af collagener (COL1A1, COL4A1, COL4A2, COL5A1 og COL16A1), laminin eller fibronectin blev inkluderet i denne klynge. Desuden blev genekspression relation til komponenter, som binder til ECM også opreguleret i fondene for mindre projekter og dannede annotation klynge 2. Annotation klynge 3 blev beriget med GO termer forbundet med “granulat” eller “vesikler” (figur 3D og tabel S3). Dette resultat foreslog genekspressionsprofilen forbundet med grundlæggende funktion i fibroblaster er forskellig mellem fondene for mindre projekter og Standard MIDI inden colon væg. De 20 bedste gener stærkt udtrykt i fondene for mindre projekter omfattede også flere ECM komponenter. Gener forbundet med fibrogenese eller myofibroblastisk differentiering af FLI1 og NOX4 blev også fundet i de 20 gener (Tabel S4). Blandt andre højt udtrykte gener i fondene for mindre projekter uden CCCM stimulation, fandt vi POSN, SPARC, eller COL4A1, som vides at være højt udtrykt i cancer stroma; og mange af disse er prognostiske faktorer [11], [16], [17]

De fleste af de gener med øgede udtryk i fondene for mindre projekter uden CCCM stimulation blev også tilbageholdt i tilstedeværelse af CCCM stimulation.; der var imidlertid nogle forskelle (figur 3D-E, tabel S5-6). I GO-analyse af fondene for mindre projekter med CCCM stimulering, blev rækkefølgen af ​​annotation klynger ændret i forhold til den, der ses hos fondene for mindre projekter uden CCCM stimulation. Blandt de 20 gener, blev 13 gener bevares og 7 gener blev udskiftet. Disse resultater tyder på en forskel i reaktionen på CCCM stimulation mellem fondene for mindre projekter og Standard MIDI. Eksistensen af ​​fondene for mindre projekter-specifikke gener, der er opreguleret efter CCCM stimulering blev estimeret.

Vi analyserede derefter disse gener for at etablere de biologiske karakteristika af fondene for mindre projekter efter udsættelse for CCCM. En Venn-diagram afslørede 193 opreguleres gener i fondene for mindre projekter og 59 i Standard MIDI efter CCCM stimulation. Af disse blev 51 almindeligt opreguleret både i fondene for mindre projekter og Standard MIDI, 142 var fondene for mindre projekter specifikke, og kun 8 var Standard MIDI specifikke (figur 4A). Vi derefter også fokuseret på nedreguleret gener, og opdagede 215 i fondene for mindre projekter og 146 i Standard MIDI. Af disse blev 138 almindeligt nedreguleret i både fondene for mindre projekter og Standard MIDI, 77 var fondene for mindre projekter specifikke, og kun 8 var Standard MIDI specifik (figur 4B). Disse resultater antydede, at fondene for mindre projekter viste mere variabel ændring i genekspression efter CCCM stimulation. GO sigt analyse af SPF-specifikke gener nedreguleret efter CCCM stimulation ikke afsløret nogen annotation klynge løbet 3.0 af berigelse score (data ikke vist). I modsætning hertil GO sigt analyse af fondene for mindre projekter-specifikke gener opreguleres efter CCCM stimulering viste, at udtryk som “actin bindende”, “cytoskeletal bindende protein”, “kontraktile fiber”, “LIM domæne”, “kontraktile fibre del”, “sarkomeret” og “myofibrillære” dannet annotation klynge 1-3 (figur 4C). De fleste af disse gener var kendt for at være relateret til celle sammentrækning. Blandt de 20 gener var mange cytoskeletale eller kontraktilitet associerede gener. Overraskende ACTA2 der koder α-SMA blev opreguleret specifikt i fondene for mindre projekter efter CCCM stimulation (figur 4D). Dette resultat blev bekræftet ved immunocytokemi (figur 4E-F). Morfometrisk analyse i immuncytokemisk udtryk afslørede, at α-SMA-ekspression opreguleret specifikt og betydeligt i fondene for mindre projekter efter CCCM stimulation i proteinniveau (figur S2,

P

0,05). Variabel opregulering og nedregulering af gener efter CCCM stimulation var en markant træk i fondene for mindre projekter. ACTA2 koder α-SMA blev inkluderet i denne fondene for mindre projekter-specifikke opreguleret gensæt. Cancer associeret fibroblaster (CAF) indbefatter α-SMA-positive aktiverede myofibroblaster. Sammen med resultatet af områdespecifikke væv microarrays, mærket α-SMA-ekspression i CMPI er afhængig af den følsomme karakter af fondene for mindre projekter, som kan forbundet med forskellen i kræft mikromiljø.

(A) Gener opreguleret ved CCCM stimulation . (B) Gener nedreguleres af CCCM stimulering. (C) Top 3 annotation klynger i gen ontologi analyse af fondene for mindre projekter-specifikke gener opreguleres ved CCCM stimulation. (D) Top 20 gener opregulerede specifikt i fondene for mindre projekter efter CCCM stimulation. (E) Immuncytokemiske α-SMA-ekspression i Standard MIDI efter CCCM stimulation. (F) Immuncytokemisk α-SMA-ekspression i fondene for mindre projekter efter CCCM stimulation. α-SMA-ekspression opreguleret specifikt i fondene for mindre projekter efter CCCM stimulation (se også figur S2).

fondene for mindre projekter Forbedre tumorvækst, metastase og tumordannelse Evne stærkere end gør Standard MIDI

Til belyse de funktionelle forskelle af fibroblaster i colon væg injicerede vi humane kolorektal cancer cellelinjer Caco-2 eller DLD-1 fm, alene eller sammen med enten fondene for mindre projekter eller Standard MIDI, i SCID-mus. Ved 7 uger efter injektionen, alle mus demonstrerede tumordannelse. Væksten af ​​tumorer, der følger af cancerceller injiceret sammen med fondene for mindre projekter voksede hurtigere end den som følge af injektion af cancerceller alene eller co-injektion med Standard MIDI (figur 5A). De endelige vægt af tumorer opstået fra cancerceller co-injiceret med fondene for mindre projekter var også større end dem, der følger injektionen af ​​cancerceller alene eller fra co-injektion med Standard MIDI (figur 5B). Selvom forskellen ikke var statistisk signifikant, tumorer hidrørende fra co-injektion af DLD-1-celler med fondene for mindre projekter resulterede oftere i lymfeknudemetastaser end gjorde dem dannet fra co-injektion af DLD-1-celler med Standard MIDI (figur 5C).

(A, venstre) xenograft tumorvækst i mus injiceret med DLD-1 humane kolorektal cancer celler alene (blå linje, 840.7 ± 112,6 mm

3 i 7 uger), co-injiceret med DLD-1 celler og submukøse fibroblaster (Standard MIDI, rød linje, 1178.0 ± 177,6 mm

3 i 7 uger), og co-injiceret med DLD-1 celler og subperitoneal fibroblaster (fondene for mindre projekter, grøn linje, 1672.8 ± 214,7 mm

3 i 7 uger). Forskellene i tumorvolumen mellem DLD-1 celler alene og DLD-1-celler med fondene for mindre projekter og mellem DLD-1 celler alene og DLD-1-celler med Standard MIDI var statistisk signifikant (

P

0,05). (A, højre) xenograft tumorvækst i mus injiceret med Caco-2 humane kolorektal cancer celler alene (blå linje, 308,6 ± 127,7 mm

3 i 9 uger), co-injiceret med Caco-2 celler og Standard MIDI (rød linje , 1363.1 ± 284,3 mm

3 i 9 uger), og co-injiceret med Caco-2 og fondene for mindre projekter (grøn linje, 2595.1 ± 349,5 mm

3 i 9 uger). Forskellene i tumor volumen mellem Caco-2 celler alene og Caco-2 celler med fondene for mindre projekter (

P

0,01) og mellem Caco-2 celler med Standard MIDI og Caco-2 celler med fondene for mindre projekter (

P

0,05) var statistisk signifikante. Xenotransplantattumorer afledt af co-injektion af kræftceller og fondene for mindre projekter voksede hurtigere end dem, der stammer fra injektion af kræftceller alene eller co-injektion af kræftceller og Standard MIDI. (B, venstre) Xenograft tumorvægt i mus injiceret med DLD-1 celler alene var 0,71 ± 0,11 g, co-injiceret med DLD-1 celler og Standard MIDI var 1,27 ± 0,19 g, og co-injiceret med DLD-1 celler og fondene for mindre projekter var 1,82 ± 0,28 g i 8 uger. Forskellene af tumor vægt mellem DLD-1 celler alene og DLD-1 celler med fondene for mindre projekter (

P

0,01) og mellem DLD-1 celler alene og DLD-1 celler med Standard MIDI (

P

0,05) var statistisk signifikante. (B, højre) Xenograft tumorvægt i mus injiceret med Caco-2-celler alene var 0,53 ± 0,24 g, co-injiceret med Caco-2-celler og Standard MIDI var 1,91 ± 0,34 g, og co-injiceret med Caco-2-celler og fondene for mindre projekter var 3,66 ± 0,45 g i 10 uger. Forskellene af tumor vægt mellem DLD-1 celler alene og DLD-1 celler med fondene for mindre projekter (

P

0,01), mellem DLD-1 celler alene og DLD-1 celler med Standard MIDI (

P

0,05), og mellem DLD-1 celler med fondene for mindre projekter og DLD-1 celler med Standard MIDI (

P

0,05) var statistisk signifikante. Lodder af xenotransplantattumorer afledt af co-injektion af kræftceller med fondene for mindre projekter var højere end tumorer stammer fra injektion af kræftceller alene eller co-injektion af kræftceller og Standard MIDI (venstre: DLD-1, til højre: Caco-2) . (C) Selvom værdien ikke nåede statistisk signifikans, xenotransplantattumorer afledt af co-injektion af DLD-1 celler og fondene for mindre projekter viste to gange frekvensen af ​​lymfeknudemetastase (n = 4) sammenlignet med dem, der følger af co-injektion af DLD-