PLoS ONE: Mitokondrisk haplogruppe og Kontrol Region polymorfier er ikke forbundet med prostatakræft i Middle europæiske kaukasiere

Abstrakt

Baggrund

Ud over at være ansvarlig for energiproduktion i cellen, mitokondrier er centrale spillere i apoptose samt den vigtigste kilde til skadelige reaktive ilt arter. Derfor kan det være den hypotese, at sekvensvariation i mitochondriegenom er en medvirkende faktor til ætiologien af ​​sygdomme relateret til disse forskellige cellulære begivenheder, herunder cancer. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at vurdere hyppigheden af ​​haplogruppe og polymorfier i kontrolområdet (CR) af mitokondrie-DNA af perifere mononukleære blodceller fra patienter med prostatacarcinom (n = 304), over for patienter screenet for prostata sygdom men fundet at være negativ for cancer på biopsi (n = 278) i et Mellemøsten europæiske befolkning.

Metode /vigtigste resultater

de ni store europæiske haplogruppe og CR polymorfier blev identificeret ved hjælp af primerforlængelse analyse og DNA-sekventering, hhv. Vi fandt, at mitokondrie haplogroup frekvenser og CR polymorfier ikke afviger væsentligt mellem patienter med og uden prostatacancer, hvilket indebærer ingen indvirkning af nedarvet mitokondrie-DNA variation på prædisposition for prostata karcinom i en Mellemøsten europæiske befolkning.

Konklusioner /Betydning

Vores resultater kontrast til en nylig rapport hævder en sammenhæng mellem mtDNA haplogroup U og prostatakræft i en nordamerikansk population af kaukasisk afstamning

Henvisning:. Mueller EE, Eder W, Mayr JA, Paulweber B , Sperl W, Horninger W, et al. (2009) mitokondrie haplogruppe og Kontrol Region polymorfier er ikke forbundet med prostatakræft i Middle europæiske kaukasere. PLoS ONE 4 (7): e6370. doi: 10,1371 /journal.pone.0006370

Redaktør: Andrew Vickers, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, USA

Modtaget: April 24, 2009; Accepteret: Juni 24 2009. I Udgivet: 28 juli 2009

Copyright: © 2009 Mueller et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra “Oesterreichische Krebshilfe – Krebsgesellschaft Tirol”, og Paracelsus Medical University Salzburg (07/05/027). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer er en væsentlig dødsårsag i den udviklede verden. Det er den hyppigste kræftform blandt mænd i USA og den næsthyppigste i Den Europæiske Union [1], [2].

Et skift i cellulær energiproduktion fra oxidativ fosforylering i mitokondrier anaerob glykolyse, kaldet Warburg virkning, er en fundamental egenskab af cancerceller. På grund af den væsentlige rolle af enzymer kodet af mitokondrie-DNA (mtDNA) i energistofskiftet, er blevet mistænkt ændring af mitokondrie-genomet at være i stand til at forårsage en metabolisk skift i tumorer [3]. Endvidere mitokondrie respiratoriske aktivitet associeret med genereringen af ​​reaktive oxygenspecies (ROS), som kan bidrage til ætiologien og progression af cancer [4]. Fordi mitokondrier spiller en vigtig rolle i både ROS produktion og apoptose, er den konklusion, at de kunne påvirke forekomsten af ​​kræft nemt trukket.

De fleste eukaryote celler indeholder hundredvis af mitokondrier, som huser mange kopier af mtDNA [5], [ ,,,0],6]. Den cirkulære og dobbeltstrengede mitochondriegenom er omkring 16 kilobasepar lange og kan yderligere opdeles i to hovedområder: den kodende region og kontrolområdet. Den kodende region består af 37 gener, 24 kodning komponenter af mitokondrie translationel maskiner og 13 gener, der leverer væsentlige underenheder af den energi-genererende enzymer af den oxidative fosforylering (OXPHOS) vej [5], [7]. Kontrolområdet (CR), som er ikke-kodende, indeholder to hypervariable regioner (HVI og HVII) og en forskydning (D-loop) region, og er involveret i mtDNA replikation og transkription [8].

Den menneskelige befolkning har oparbejdet et stort antal mtDNA basesubstitutioner sammen udstrålende maternelle slægter, hvoraf specifikke kombinationer udgør de såkaldte mitokondrie haplogruppe [7], [9]. Ni forskellige europæiske mtDNA haplogruppe (H, U, J, T, K, W, I, V, X) blev defineret af Torroni et al. [10], [11]. Selv om de fleste mitokondrie polymorfier menes at være neutral, kan population-specifikke mtDNAs være funktionelt forskellige og øve forskellige påvirkninger på resultaterne af sygdomme [7], [12] – [14].

Mitochondriale haplogruppe og polymorfier har vist sig at være forbundet med carcinogenese. For eksempel er mtDNA 10398A polymorfi impliceret i forøget ROS produktion, og viste sig at være en risikofaktor for brystkræft og kræft i spiserøret i indiske patienter, og for invasiv brystcancer i afroamerikanske kvinder [4], [15]. Desuden blev Asian haplogroup D sig at være forbundet med en højere risiko for at udvikle endometriecancer i Kina [16]. I den hvide befolkning, blev haplogroup K forbundet med en betydelig stigning, og haplogroup U et signifikant fald i risikoen for brystkræft [17].

Booker et al. [18] rapporterede en forhøjet hyppighed af haplogroup U i prostata carcinoma patienter i en undersøgelse af nordamerikanske hvide. Denne Kaukasisk haplogroup var korreleret med en 2-fold risiko for at udvikle sygdommen [18].

Vi havde til formål at kopiere sidstnævnte undersøgelse af en Mellemøsten europæiske befolkning. Fordi sammenslutninger af aldersrelaterede sygdomme er blevet påvist ikke kun med mitokondrie haplogruppe, men også med enkelte nukleotid polymorfier (SNP) i CR [19], undersøgte vi også sekvens variationer i HVI og HVII i vores kohorter.

Resultater

Vi vurderede de ni store europæiske haplogruppe samt CR polymorfier i perifere mononukleære blodceller af 582 kaukasiske mænd, 304 af dem blev diagnosticeret med prostatakræft; de resterende 278 blev identificeret med forhøjede serum PSA-niveauer, men var histologisk negativ for cancer ved prostatabiopsi og tjente som kontrolgruppe. Kliniske karakteristika af kræftpatienter og kontroller er vist i tabel 1. Alle ni europæiske haplogruppe blev observeret i vores kohorte. Hyppigheden af ​​mitokondrie haplogruppe ikke signifikant forskellig mellem patienter med prostatakræft og kontrolpersoner (tabel 2). Når mitokondrie haplogroup frekvenser blev sammenlignet mellem kræftpatienter med biopsi Gleason Score ≤6 til kræftpatienter med biopsi Gleason Score ≥7 heller ingen signifikante forskelle blev observeret (tabel 3). Vejviser

Den mitokondrie CR blev sekventeret og analyseret mellem nukleotidpositionerne 16145 og 530. To hundrede og nitten polymorfier blev fundet blandt de 582 forsøgspersoner, med 197 homoplasmiske enkelt udvekslinger basepar, 10 enkeltværelser basis-pair sletninger og 5 enkelt basis-pair indsættelser sammenlignet til den reviderede Cambridge reference Sequence. To prøver præsenterede samme 6 base-par sletning af nukleotider 106 til 111. En CA-sletning på positionerne 514 og 515 fandt sted 40 gange, og CA-indsættelser og Caca-indsættelser blev også fundet på dette site 64 gange. CC-insertioner forekom i positionerne 302 og 310, og heteroplasmy blev fundet i en prøve (A 16280 A /G). Af disse 219 polymorfier, er 16 ikke er opført i MITOMAP eller menneskelige mitochondriegenom Database (www.mitomap.org, www.genpat.uu.se/mtDB/). Alle polymorfier og deres frekvenser i kontrol- og kræft studiegrupper er anført i supplerende tabel S1

To af de 219 polymorfier -. A 189 G, og T 310 C – viste sig at have en signifikant lavere frekvens i cancerpatienter i sammenligning med kontrolgruppen populationen (p 0,05) (tabel 4, supplerende tabel S1). Imidlertid blev betydningen tabt efter korrektion for multiple sammenligninger (Bonferroni analyse), hvilket fører til en nye nødvendige signifikansniveau på 0,00023. Tabel 4 lister de 35 polymorfismer med en frekvens ≥ 5% i enten kontrol eller prostatakræft studiegruppe.

Diskussion

Formålet med denne undersøgelse var at replikere undersøgelse af Booker et al. [18], der udførte en case-kontrol undersøgelse af 221 hvide mænd med prostatakræft og 246 hvide kontroller i Nordamerika og fundet mitokondrie haplogroup U skal overrepræsenteret i kræft sammenlignet med kontrolgruppen (OR: 1,95). I Middle europæiske kaukasere fandt vi ikke signifikante forskelle mellem de haplogroup udlodninger i prostata cancer patienter sammenlignet med kontrollerne. Justering for multiple sammenligninger anvendes til studiet af Booker et al. også ført til tab af statistisk signifikans [18]. Den haplogroup fordeling af det nordamerikanske undersøgelse ligner fordelingen i vores kræftpatienter, mens kontrolgruppen i studiet af Booker et al. [18] er underrepræsenteret i haplogroup U med omkring 45% i forhold til vores kontrolgruppe (tabel 5). Når vi sammenlignet den amerikanske case gruppe til den østrigske kontrolgruppe ingen signifikant association af haplogruppe til prostatakræft blev opdaget

For at udelukke, at have prostata problemer i almindelighed -. Angivet med forhøjede PSA serumniveauer i vores patient og kontrolgruppe – er forbundet med en højere haplogroup U frekvens, vi yderligere vurderet haplogroup U frekvens blandt deltagerne i SAPHIR undersøgelsen (Salzburg Åreforkalkning Prevention Program, som tidligere offentliggjort [14], [20]). Hyppigheden af ​​haplogroup U i vores kontrol- og prostatakræft grupper er ikke signifikant forskellige fra dem af disse sunde SAPHIR fag. En undergruppe af denne population, der kun består af mænd (n = 988, gennemsnitsalder 49 år), har også en frekvens på haplogroup U svarende til den prostatacancer gruppen (data ikke vist). Endvidere frekvensen af ​​haplogroup U blandt 277 tilfældige vesteuropæiske kaukasiere studeret af Brandstätter et al. [21] også er ikke signifikant forskellig fra frekvensen i vores kontrolgruppe (tabel 5). Emnerne for denne undersøgelse blev indskrevet på samme Universitetshospital i Østrig, hvor vores patient og kontrol kohorter blev recruted.

I mtDNA-relateret epidemiologiske undersøgelser betydningen af ​​passende kontrolgrupper tidligere har været fremhævet [22], [ ,,,0],23]. Der er flere grunde, der kan forklare de afvigende resultater. For eksempel kunne de regionale variation, alder eller køn forskelle påvirke resultatet af statistiske beregninger. Booker et al. [18] definerer ikke, om deres kontrol bestod udelukkende af mænd eller også kvinder. Deres kontrol kohorte bestod af organdonorer, der i USA udtrykkeligt skal angive ønske om at blive organdonor; således, afhængigt af tilbøjeligheder af forskellige etniske grupper til at donere organer, orgel donor banker kan udvise forskellige haplogroup fordelinger i forhold til den almindelige befolkning. Gennemsnitsalderen for deres kontrol var mindre end den for patienter med cancer. Alder kan have en indvirkning på den regionale befolkning variation, især i et land som USA med et stort indvandrerbefolkningen. Indvandring mønstre kunne have ændret sig over en periode, hvilket fører til forskellige haplogroup distributioner i forskellige aldersgrupper af en population.

I en anden amerikansk undersøgelse, som søgte at kopiere resultaterne af Booker et al. [18] med hensyn til en forening mellem haplogroup U og prostatakræft i hvide mænd, Canter et al. [24] rapporterede haplogroup U procentdele af 26,7% for deres prostatakræft (n = 71) og 11,7% for deres kontrolgruppe (n = 128). En begrænsning ved deres undersøgelse er det lave antal af patienter med prostatacancer. Hertil kommer, at deres kort rapport ikke give karakteristika undersøgelsens deltagere, eller hvordan de blev valgt.

Det kan ikke udelukkes, at den geografiske variation af haplogroup frekvenser i kontrol studiepopulationer er til stede mellem Østrig og USA.

I overensstemmelse med vores resultater, en koreansk undersøgelse viste ingen sammenhæng mellem eventuelle mitokondrie haplogruppe og prostatakræft [25]. Det fælles sæt af 22 østasiatiske haplogruppe blev undersøgt, og blev observeret nogen statistisk signifikant forskel i fordelingerne af mtDNA haplogroup frekvenser mellem sagen (n = 139) og kontrolgrupper (n = 122).

Sammenligning CR polymorfier af kræftpatienter til kontrol fandt vi to ud af 219 statistisk signifikante forskelle, der mistede deres betydning efter korrektion for multiple sammenligninger.

som vi analyserede kun mitokondrie haplogruppe og kontrol region polymorfier, vi kan ikke udelukke, at polymorfier i mitokondrie-kodende region, der ikke er medtaget i de foruddefinerede haplogroup polymorfier, kunne være forbundet med prostatacancer. En anden begrænsning ved vores analyse er den lave undersøgelse effekt. Meget store stikprøvestørrelser ville være forpligtet til at detektere en beskeden forskel i haplogroup frekvenser mellem to grupper [26].

Somatiske mutationer af mtDNA er blevet rapporteret i en række forskellige kræftformer, herunder prostata karcinom [27], [ ,,,0],28]. I denne undersøgelse kun blodprøver genomisk DNA-prøver var tilgængelige for os, og derfor kunne fastsættes ingen associationer mellem somatiske mutationer /polymorfier.

Som konklusion, vi fandt ikke nogen mitokondrie haplogruppe eller CR polymorfier at være forbundet med prostatakræft i en østrigsk befolkning.

Materialer og metoder

Etik Statement

undersøgelsen blev gennemført i henhold til den østrigske genteknologi og overholdt Helsinki-deklarationen. Undersøgelsen og brug af arkiv prøver til studiet blev godkendt af den etiske komité i Innsbruck Medical University (studere UN 3174). Prøver arkiveret i 1995-2006 blev anvendt til undersøgelsen. blev opnået skriftligt informeret samtykke starter i 2001.

Patienter og kontrolpersoner

I alt 582 kaukasiske personer blev analyseret; alle blev rekrutteret fra Institut for Urologi af Innsbruck Medical University. Patienter og kontroller blev inkluderet i tidlig påvisning program tyrolsk for prostatakræft, som er baseret på regelmæssig PSA (prostata specifikt antigen) test [29], [30]. Sagen gruppe omfatter 304 mænd i alderen 51 til 84 år, diagnosticeret med prostatakræft ved histopatologisk evaluering i henhold til Verdenssundhedsorganisationens anbefalinger. Som en kontrol sygdomsgruppe, 278 mænd i alderen 46 til 80 år med godartede resultater af prostata biopsi blev rekrutteret som tidligere beskrevet [29] (Tabel 1). For sygdomsbekæmpelse gruppen en gennemsnitlig opfølgning på 4,3 år efter biopsi er tilgængelig lige fra nul til 12 år, hvor der ikke kræft blev diagnosticeret.

DNA isolation og mtDNA analyse

DNA blev isoleret fra frosne mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) ved hjælp af AllPrep DNA /RNA Mini Kit 50 (Qiagen, Hilden, Tyskland). En hierarkisk system til mtDNA haplogrouping der kombinerer multiplex-PCR-amplifikation, multiplex single-basen primerforlængelse, og kapillær-baserede elektroforetisk separation til analyse ti haplogroup-diagnostisk mitokondriske SNP’er (mtSNPs) blev anvendt til at bestemme haplogroup fordelingen af ​​de mest almindelige europæiske haplogruppe, H, U, J, T, K, i, V, W og X, som tidligere beskrevet [20]

der blev dog foretaget følgende ændringer til denne protokol:. for at fjerne primere og ikke-inkorporerede deoxynukleotider fra PCR-produkter, en ExoSAP-IT (USB, Cleveland, OH, USA) fordøje i et volumen på 4,5 pi indeholdende 0,5 pi ExoSAP og 2 pi PCR-produkt blev udført ved 37 ° C i 60 minutter efterfulgt af enzym inaktivering ved 80 ° C i 15 min. Multiplex primerforlængelsesprodukter reaktioner blev udført i et samlet volumen på 5 pi indeholdende 1 pi SNP Start Master Mix (GenomeLab ™ SNP Start Primer Extension Kit, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA), 1 pi PCR-produkt, og 1 pi primer mix. To SNP primere blev ændret til 8251r: (A)

15GAGGGGGTGCTATAGGGTAAATACGGG og 16391r: (A)

6TGATTTCACGGAGGATGGTGGTCAAGGGA. Som en intern standard, fluorescensmærkede primere (Biomers, Ulm, Tyskland) af længder 15 og 60 baser blev brugt (15 baser standard DY781: CACATGTCGGAGTCT, 60 baser standard DY781: TACAGTTCGTGCACACCGGCATCAGCTGTGTGCGAGAGTACTTACTATTGGTTGGCCAGA).

haplogruppe, der ikke kunne være henføres til en af ​​de ni store europæiske haplogruppe ved SNP kombinationen blev betegnet som “andre”.

CR-sekvenser blev analyseret mellem nukleotidpositionerne 16145 og 530, fra en 1066-bp fragment. Fragmentet blev forstærket med primere 16098f: ACATTACTGCCAGCCACCATG og 638r: GGTGATGTGAGCCCGTCTAAAC. PCR blev udført i et volumen på 30 pi indeholdende 10 × PCR-buffer B (Solis Biodyne, Tartu, Estland), 2,5 mM MgCl

2, 333,3 pM af fremadrettet og revers primer, 133,3 pM af hver deoxynukleotidtriphosphat (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og 0,083 U Hot Fire Polymerase (Solis Biodyne, Tartu, Estland). Termiske cyklingsbetingelser var 95 ° C i 15 minutter, 35 cykler ved 95 ° C i 30 sekunder, 58 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 2 minutter og endelig 37 ° C i 2 minutter.

PCR-produkter blev oprenset på samme måde som beskrevet for haplogroup analyse (ExoSAP-IT, USB, Cleveland, OH, USA). Fragmentet blev sekventeret under anvendelse af primere 16098f: ACATTACTGCCAGCCACCATG og 17f: CCCTATTAACCACTCACGGG. Sekventering blev udført under anvendelse GenomeLab ™ DTC – Quick Start Kit (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) i et volumen på 10 pi indeholdende 2 pi af Master Mix og 500 pM af den passende primer. Termisk cykling betingelser for sekventering blev udført med: 30 cykler af denaturering ved 96 ° C i 5 sekunder, annealing ved 50 ° C i 5 sekunder og ekstension ved 60 ° C i 4 minutter, efterfulgt af 25 ° C i 10 sekunder. Prøver blev ethanol-fældet og adskilt ved kapillær elektroforese på en Beckman Coulter CEQ ™ 2000 Genetic Analysis System.

Statistisk analyse

Hyppigheden af ​​alle mitokondrie haplogruppe og CR polymorfier i patienter med prostatacancer og kontroller blev testet for uafhængighed hjælp Pearson chi-square statistik og Fishers eksakte test efter behov. Endvidere på samme måde, frekvenser af mitokondrielle haplogruppe hos patienter med prostatacarcinom og biopsi Gleason score ≤ 6 og patienter med prostatacarcinom og biopsi Gleason ≥7 blev testet. En p-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Til analyse af CR polymorfier signifikante p-værdier blev korrigeret for multiple sammenligninger ved Bonferroni-analyse (påkrævet signifikansniveau = 0,05 /antal sammenligninger), hvilket fører til en nye nødvendige signifikansniveau på 0,00023 [antal sammenligninger = 219]. Alle analyser blev udført ved hjælp af SPSS 15.0 studerende version (SPSS GmbH Software, 80339 München, Tyskland).

Støtte Information

Tabel S1.

kontrolområdet polymorfier

doi:. 10,1371 /journal.pone.0006370.s001

(0,21 MB DOC)

Tak

Vi takker Michaela Öller om bistand i DNA isolation, Adel Sakic om hjælp til stikprøveudvælgelsen og DNA isolation, og Birgit Stenzel for udarbejdelse af kliniske datasæt. Vi takker også Neil D. Jones til kritisk læsning af manuskriptet.