PLoS ONE: Ændret Angivelse af transmembrane Muciner, MUC1 og MUC4, i blærekræft: Patologiske konsekvenser i Diagnosis

Abstrakt

Formål

Radikale ændringer i både udtryk og glycosyleringsmønster transmembrane muciner har blevet observeret i forskellige maligniteter. Vi og andre har vist, at MUC1 og MUC4, to transmembrane muciner, spiller en sentinel rolle i celle signalering begivenheder, der driver flere epitelial maligniteter. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi ekspressionsprofilen af ​​MUC1 og MUC4 i ikke neoplastiske blære urothelium, i forskellige ondartede svulster i blæren og i blærecarcinom cellelinier.

Materiale og fremgangsmåder Salg

immunhistokemi blev udført på vævssnit fra urinblæren biopsier, resektion prøver og væv microarrays (TMAS) med monoklonale antistoffer specifikke for MUC1 og MUC4. Vi undersøgte også deres ekspression i blærecarcinom cellelinier ved RT-PCR og immunblotting.

Resultater

MUC1 udtrykkes på den apikale overflade eller i paraply celler af den normale ikke-neoplastisk blære urothelium. Stærk ekspression af MUC1 blev også observeret i urothelial carcinoma (UC). MUC1-farvning steg fra normale urothelium (n = 27, 0,35 ± 0,12) til urotelial carcinom (UC, n = 323, H-score, 2,4 ± 0,22, p ≤ 0,0001). I modsætning til MUC1 blev MUC4 udtrykkes i alle lagene af ikke-neoplastiske blære urothelium (n = 14, 2,5 ± 0,28), både i cellemembranen og cytoplasma. I sammenligning med ikke-neoplastisk urothelium, blev tabet af MUC4 ekspression observeret under urotelial carcinom (n = 211, 0,56 ± 0,06). Imidlertid blev observeret re-ekspressionen af ​​MUC4 i en delmængde af metastatiske tilfælde af urothelial carcinom (betyder H-score 0,734 ± 0,9).

Konklusion

udtryk for MUC1 øges, mens den for MUC4 faldt i UC sammenlignet med den normale ikke-neoplastisk urothelium. Ekspression af både MUC1 og MUC4, er imidlertid signifikant højere i urothelial carcinoma metastatiske tilfælde sammenlignet med lokaliseret UC. Disse resultater antyder differentiel ekspression af MUC1 og MUC4 under udvikling og progression af blærecarcinom

Henvisning:. Kaur S, Momi N, Chakraborty S, GD Wagner, Horn AJ, Lele SM, et al. (2014) ændret ekspression af transmembrane Muciner, MUC1 og MUC4, i blærekræft: Patologiske konsekvenser i Diagnose. PLoS ONE 9 (3): e92742. doi: 10,1371 /journal.pone.0092742

Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, USA

Modtaget: Januar 13, 2014 Accepteret: 25 februar 2014; Udgivet 26. marts, 2014

Copyright: © 2014 Kaur et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (RO1 CA 138.791, U54 CA163120, UO1 CA111294, og P50 CA127297). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft (BCA) er den femte fælles malignitet i USA tegner sig for næsten 72.570 nye tilfælde og 15,210 kræft dødsfald i løbet af 2013 [1]. Den urothelial karcinom (UC) er den mest almindelige histologiske type BCA der tegner sig for 90% af de nyligt diagnosticerede tilfælde. UCS på diagnosetidspunktet spænder fra overfladiske lav kvalitet papillære læsioner (forbundet med bedre prognose) til højt invasive maligne carcinomer (særdeles aggressiv med en lav overlevelsesrate). Ca. 70-80% af nydiagnosticerede professionshøjskoler er “ikke-muskel invasiv” hvor sygdommen er begrænset til blæren mucosa eller lamina propria (stadie Ta /T1 i henhold til TNM klassifikation) [2]. Ca. 10% -30% af disse tumorer videre til “muskel-invasiv sygdom” ( “high grade” UC) (trin T2 /T3) [2]. Low-grade papillære kræftformer er generelt ikke-invasiv (kun 15% invadere blærevæggen) og dermed modtagelig for kirurgisk resektion. de tilfælde af høj kvalitet invasive carcinom, er dog forbundet med høj sandsynlighed for metastase og dødelighed [3], [4]. Cytologi og cystoskopi med væv biopsi er fortsat de mest nøjagtige metoder til rådighed til at opdage BCA indtil dato. Cytologi er yderst specifik for high-grade urothelial carcinoma, men ikke for lav kvalitet urothelial carcinoma.

I de senere år er der rapporteret afvigende ændringer i ekspression og glycosylering af muciner i inflammatoriske, præmaligne og maligne tilstande [5 ] – [10]. Muciner er glycoproteiner, der er karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​høje grad af O- og N-glycosylering sammen med meget gentagne korte strækninger af aminosyrerester (betegnet som “tandem repeats”) [9]. Disse er groft inddeles i to kategorier, nemlig membranbundne muciner og udskilles /gel danner muciner. Vigtigere er det, MUC1 og MUC4 repræsenterer godt karakteriserede trans-membran muciner spiller vigtige roller i cellulær fysiologi. I kraft af deres struktur og biokemisk sammensætning disse muciner deltager i smøring og hydrering af celleoverflader, beskyttelse mod mikroorganismer (bakterier og vira) og nedbrydende enzymer [11]. Variation i ekspression og glycosyleringsmønster MUC1 og MUC4 er blevet observeret i flere epitelmalignanser herunder pankreatisk, bryst-, tyktarms-, prostata- og lungekræft [7], [9], [12], [13]. De er blevet vist at spille en kritisk rolle i tumorvækst, intracellulære og ekstracellulære signalering, tumor-stromale interaktioner, metastase, og resistens over for kemoterapeutiske midler og i immun-overvågning [7], [11], [12], [14]. Tilgængeligheden af ​​meget specifikke reagenser (

f.eks.

Monoklonale antistoffer), nogle stand til at genkende ændrede glycoformer har gjort muciner attraktive mål for tidlig diagnosticering af epitelial maligniteter. Altered udtryk og lokalisering mønster af MUC1 er blevet observeret under progression af ondartede svulster i blæren [15] – [18], men til dato er der en ringe information om status for MUC4. I betragtning af deres beskyttende og smørende roller, er det vigtigt at vurdere deres funktioner i det sunde blære og ændringen i deres udtryk under udviklingen og progressionen af ​​urothelial karcinom.

I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi udtrykket mønstre af MUC1 og MUC4 i ikke-neoplastisk blære urothelium og ondartede svulster i blære væv på væv microarrays (TMA) og vævssnit fra urinblæren biopsier og resektion prøver. Endvidere blev sammenhængen mellem ekspressionen af ​​disse muciner og tumor klasse (niveau 1-4) undersøgt for at definere den diagnostiske og fysiologiske betydning af TM muciner under patogenese UC.

Materialer og metoder

tumorcellelinjer samt vævsprøver

Arkiverede formalin fast BCA vævsprøver blev opnået University of Nebraska Medical center vævsbank. Gennemgangen bord fandt denne undersøgelse, med sin de-identificerede database, for at være fritaget for institutionel Review Board gennemgang. Blære TMA blev indkøbt fra US Biomax for MUC1-farvning (cat # BL802), Accumax for MUC4 (cat # A215II) og blære TMA (2004) (en venlig gave fra Dr. Henry Frierson fra University of Virginia Charlottesville VA). IHC-farvning blev udført under anvendelse mAb HMFG2 (anti-MUC1 antistof, en slags gave fra Dr. Gendler, Mayo Clinic), og mAb8G7 (anti-MUC4 antistof, frembragt mod tandemgentagelse peptid, STGDTTPLPVTDTSSV i vores laboratorium og reaktivt med både nativt protein og peptid) [19]. Blærecarcinom cellelinier [T24 og HT1376, (afledt af blære overgangsperiode cellecarcinom), TCCSUP (afledt af en anaplatic overgangsperiode celle carcinom) SCaBER (afledt af blære pladecellecarcinom) blev opretholdt i American Type Culture Collection (ATCC) specificeret kultur medier suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (Gibco BRL, Grand Island, NY). Vækstmedier blev ændret hver anden dag, og cellerne blev trypsiniseret ved 70% konfluens.

Immunhistokemi (IHC)

Til analyse MUC1 og MUC4 ekspression i ondartede svulster i blæren, IHC blev udført som beskrevet tidligere i TMA og vævssnit af prøver fra urinblæren [7]. Biopsi og resektion prøver af urothelial karcinom blev gennemgået af patologer (Drs. S Lele, AH Horn, og GD Wagner på UNMC) for at bekræfte diagnoserne og også vælge repræsentative blokke for immunohistokemiske analyser. For væv IHC blev 4 um tykke snit skæres fra paraffinindlejrede vævsblokke ved hjælp af væv mikrotom og blev klæbet på de ladede objektglas. Blære TMA og vævssnit blev inkuberet natten over ved 56 ° C efterfulgt af afparaffinering hjælp gentagne vaske xylen (5 min hver) efterfulgt af rehydrering af væv med gradueret alkohol. Efter rehydrering blev vævene inkuberet med methanol opløsning af 3% H

2O

2 for quenching af endogen peroxidaseaktivitet. Varmeinduceret antigen hentning udførtes opvarmning af prøven i 0,01 M citrat (pH 6,0, 95 ° C) buffer i 15 min i mikrobølgeovnen. Efter antigen-genvinding blev sektionerne blokeret med hesteserum (ImmPRESS Universal antistof kit; Vector Laboratories) i 3 timer ved stuetemperatur. Objektglassene blev yderligere inkuberet med anti-MUC1 (HMFG2 ved 1:05 fortynding af beriget supernatant i PBS), MUC4 antistof 8G7 (1:2000 fortynding af en 1,8 mg /ml stamopløsning i PBS) [20] natten over ved 4 ° C. Efter fire vaske med PBS-T (PBS indeholdende 0,05% Tween 20) blev sektionerne inkuberet med anti-mus sekundært antistof (ImmPRESS Universal antistof kit; Vector Laboratories) i 30 min. og efterfølgende blev farven udviklet ved tilsætning af 3,3′-diaminobenzidin-opløsning (DAB-substrat kit; Vector Laboratories). Rødbrun bundfald angivne positive immuno-reaktivitet. De dias var counter-farvet med Gills hæmatoxylin (Vector Laboratories), dehydreret i gradueret ethanol efterfulgt af xylen og monteret med Vecta-mount montering medium (Vector Laboratories). Alle objektglas blev analyseret under anvendelse af et Nikon Eclipse E400 Microscope (Nikon Corporation, Tokyo, Japan).

hvert væv kerne blev evalueret af uropathologists på UNMC at vurdere tilstedeværelsen af ​​tumor og scoring af farvning. Kort fortalt, hver plet på vævsarray blev bedømt ud fra intensiteten af ​​farvning på en skala fra 0 til 3 (0-ingen farvning, 1-svag farvning, 2-mellemprodukt farvning, og 3-stærk farvning). Procentdelen af ​​positive celler med en given intensitet for hver prøve blev bestemt af patologer. H-score [range: 0 (ingen farvning i enhver celle) til 3 (alle celler farvning med den højeste (3) intensitet] blev beregnet som summen af ​​produktet af farvningsintensitet (område: 0-3) og andelen af celler farvning (interval: 0-1; 0-ingen celle farves og 1-100% celle farvet). pr H-score omdrejningspunkt reaktivitet svarer til H score på ≤0.1, mild reaktivitet (H score 0,1, men mindre end eller svarende til 1,0), moderat reaktivitet (H score 1,0 men ≤2.0) og intens reaktivitet (H score . 2.0) i tilfælde af vævsbiopsier grundet begrænset antal hver vævstype (godartet, carcinoma in situ og carcinom) stede på diaset blev scoret på intensiteten score alene. i metastatiske tilfælde, sektioner blev scoret for H-scorer ligner væv pletter.

statistiske Analyser

data blev analyseret ved hjælp MedCalc til Windows-version 9.6.4.0 software. med henblik på analysen, blev hver plet betragtet som en individuel prøve. Intensitet af mucin udtryk blev anset som kontinuerte variable, men den type patologi [UC, planocellulært karcinom (SCC), adenocarcinom eller papillær carcinom] , grad af cancer, blev anset for kategoriske variable. En p-værdi på 0,05 blev betragtet som signifikant

Isolering af Total RNA og revers transkriptase-polymerasekædereaktion

Cellular RNA fra de dyrkede celler blev ekstraheret ved RNeasy kit ifølge producentens anvisninger (. Qiagen, Hilden, Tyskland). Total RNA blev kvantificeret ved anvendelse af en ultraviolet spektrofotometer (Peqlab ND-1000, Peqlab, Erlangen, Tyskland) og kvaliteten og integriteten af ​​prøver blev vurderet på en 1,5% agarosegel. 2 ug totalt RNA fra hver BCA cellelinje blev revers transkriberet under anvendelse af første-streng cDNA-syntese kit (Perkin Elmer, Branchburg, NJ) ifølge producentens instruktioner. Den kvantitative real time PCR blev udført for MUC1, MUC4, og β-actin under anvendelse af følgende primerpar: MUC1 (fremadrettet primer 5′-GAACTACGGGCAGCTGGACATC’-3 ‘og revers primer 5′-GCTCTCTGGGCCAGTCCTCCTG-3’), MUC4 (fremadrettet primer 5 ‘-CGCGGTGG TGGAGGCGTTCTT-3′ og revers primer 5’-GAAGAATCCTGACAGCCTTCA-3 ‘), og β-actin forward primer (5′-TGGACATCCGCAAAGACCTG-3′) og revers primer (5’-CCGATCCACA CGGAGTACTT-3 ‘) (IDT Cor -. alville, IA, USA)

Western-blot analyse

Samlet protein blev udvundet fra BCA-cellelinjer, løst og analyseret ved immunoblotting henhold til standard-protokol. Kort fortalt blev cellerne vasket to gange med kold-PBS, skrabet i RIPA-buffer (100 mM Tris, 5 mM EDTA, 5% NP40, pH-8,0) indeholdende proteaseinhibitorer cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og fik lov til at lysere for mindst 30 minutter på is med intermitterende hvirvelbehandling. Celler blev underkastet yderligere lysis af én fryse-tø cyklus og centrifugeret ved 14.000 i 30 min ved 4 ° C. Supernatanter blev omhyggeligt fjernet, og proteinkoncentrationer blev bestemt ved Bio-Rad-DC-protein estimation kit. For mucin immunoblotting blev elektroforese udført på 2% SDS-agarosegel under anvendelse af lige store mængder af proteinprøver under reducerende betingelser. For β-actin blev SDS-PAGE (10%) kørt under lignende betingelser. Proteiner blev overført til PVDF-membraner og undersøgt med anti-MUC1 (1:05 ​​fortyndet mAbHMFG2 supernatant i PBS) og MUC4 (1:1,000 fortynding af mAb8G7) antistoffer. Efter inkubation med muse peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer (Amersham Biosciences Buckinghamshire, UK), blev signal detekteret med en elektrokemiluminescens reagens (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ).

Resultater Salg

I denne undersøgelse, vi udforskede udtrykket profil transmembrane muciner (MUC1 og MUC4) i urotelial karcinom vævssnit og tre væv TMAs. Endvidere blev ekspressionsniveauer af disse muciner vurderet i blærecarcinom cellelinier.

MUC1 Expression Analyser under ondartede svulster i Bladder

MUC1 ekspression i ikke neoplastiske blære urothelium.

Størstedelen af ​​ikke neoplastiske blærevæv pletter fra TMA (16/27 eller 59%) var negative for MUC1 ekspression (H score = 0). Mindre brændvidde farvning blev observeret i nogle tilfælde 4/27 (15%). I de resterende pletter blev mild positivitet observeret (7/27 gennemsnitlig H-score 0,58 ± 0,29 på en skala fra 0-3) (fig. 1A). Samlet set blev der gennemsnitlig H-score på alle de tilfælde sammen fundet at være 0,15 ± 0,1 (tabel 1). I størstedelen af ​​de tilfælde, var intens MUC1 farvning begrænset til paraply celler med svag farvning i resten celler i urinvejene (fig. 1A, pilespids). Men i nogle tilfælde blev en intens MUC1-farvning (4/27 eller 15%) observeret overfladiske lag i urinvejene (fig. 1B, vist med pilen). Generelt farvning var stærkt intens i de overfladiske paraply celler end i de andre lag /celler i urinvejene. Et lignende fund blev noteret for vævssnit indsamlet ved UNMC som viste moderat til intens farvning for MUC1 (N = 3, betyder intensitet 1,7 ± 0,58, betyder H-score 1,7 ± 0,58), der var begrænset til overfladiske lag eller paraply celler.

blæretumor vævssnit eller pletter blev probet med anti-MUC1 mAb (HMFG2) efter ikke-specifik blokering med hesteserum. Alle snit blev undersøgt under mikroskop og immunoreaktiviteten blev evalueret ved rødbrun farvning. Repræsentative mikrofotografier er vist for MUC1 farves ikke neoplastiske blære urothelium (A B), low-grade papillær carcinom (C), blærecarcinom in situ (D), og høj kvalitet invasiv cancer (E F). I normal blære urothelium blev MUC1 ekspression begrænset til paraply celler (vist med pilehoved i panel A og det forstørrede indsatte) i størstedelen af ​​prøverne. I nogle prøver, blev en kappe af MUC1 mucin observeret over urothelium (pil i 1B). I lav kvalitet papillær carcinom, blev intens farvning af MUC1 observeret på den luminale overflade i urinvejene og blev observeret lavere intensitet farvning i de andre lag af urothelium (C). I urotelial carcinoma in situ, MUC1 ekspression blev observeret i alle lag af urothelium imidlertid farvning var forholdsvis stærkere i celler tættere på den luminale grænse (D). Ved invasiv høj kvalitet urothelial karcinom blev MUC1 farvning observeret i celler invaderer enkeltvis (E) eller som små grupper inden for lamina propria (F).

MUC1 ekspression i ikke-invasiv papillære urotelial . karcinom og urotelial carcinoma in situ (CIS)

Papillær kræftformer er generelt ikke-invasiv (kun 15% invadere blærevæggen) og dermed modtagelig for kirurgisk resektion. For MUC1 blev papillære carcinoma tilfælde begrænset til vævssnit alene, da ingen væv plet i TMA svarede til invasiv eller ikke-invasiv papillær carcinom. Moderat til intens MUC1 farvning blev observeret i både lav og høj kvalitet papillær urothelial carcinoma fra vævssnit (middelværdi intensitet 2,9 ± 0,1 og betyder H-score 2,1 ± 0,83 på en skala fra 0-3, fig. 1C). Intens farvning af MUC1 blev observeret på den luminale overflade af uroepithelium i lav kvalitet papillær urothelial carcinoma. Farvningsintensitet og procentdel positivitet steg fra celler i basallagene til apikale lag af uroepithelium (fig. 1C, vist med pilen). Endvidere viste overflade lagceller mere intens farvning sammenlignet med cellerne under uroepitele lag, hvilket viser en ikke-ensartet celle til celle farvningsmønster (fig. 1C). I tilfælde af carcinoma in situ, intens MUC1-farvning (middel intensitet 2,9 ± 0,1 og betyder H-score 2,48 ± 0,74) blev observeret (N = 10) i vævssnit (fig. 1D).

MUC1 ekspression i primær og metastatisk urothelial karcinom.

i urothelial karcinom tilfælde, MUC1 farvning varierede fra ingen reaktivitet (N = 38 eller 12%), fokal reaktivitet (N = 12 eller 4%, betyder H-score 0,057 ± 0,01 ) til moderat (N = 147 eller 46%, betyder H-score 1,02 ± 0,05) og intens immunreaktivitet (N = 117 eller 37%, betyder H-score på 2,86 ± 0,02) (fig. 1 E og 1 F). I invasive tilfælde blev MUC1-farvning observeret i foci (enkelt eller reden af ​​celler) til stede i papillære kerne eller i lamina propria (fig. 1 E og 1 F), fordelingen af ​​MUC1 være både membranøs og cytoplasmatiske.

MUC1 ekspression blev observeret i 66% (8/12) af metastaser fra en primær UC til forskellige steder

dvs.

. bugvæggen, ryg, ben, hjerne og lymfeknuder (fig. 2E og F). I tilfælde af metastatiske vævssnit (n = 28), blev absolutte ekspression af MUC1 observeret i alle metastatiske tilfælde med gennemsnitlig H-score på 1,91 ± 0,15 og gennemsnitlig intensitet på 2,72 ± 0,45. I overensstemmelse med disse resultater, blev der ikke MUC1 ekspression observeret i normal lymfeknude område, mens metastatiske celler i lymfeknude har positiv reaktivitet (fig. 2E). Den observerede MUC1 udtryk kan kategoriseres i tre forskellige mønstre luminale membran farvning (i paraplyen cellelag) kun, luminale plus cytoplasmatisk farvning (i mellem- og basale lag) eller farvning af kun isolerede celler eller cellegrupper.

Repræsentative mikrofotografier vist for MUC1 farvning i pladecellecarcinom (A), keratin perler (B), adenocarcinom (C) mucinøs adenocarcinom (D), metastase til knogle (E), metastatisk urothelial carcinoma in lymfeknude (F). Stærk membranøs ekspression af MUC1 blev observeret pladecellecarcinom (A) og også i keratin perler i pladecellecarcinom (B). Både mucinøs adenocarcinom (C) og adenocarcinom viste svag farvning (D) for MUC1. Stærk ekspression af MUC1 blev observeret i metastatisk urothelial carcinoma in knogle (E) og lymfeknude (F). Højeffektvisning viste, at MUC1 er lokaliseret til både cytoplasma og membran i metastaser (indsat af E F).

Som det ses i tabel 2, blev der observeret signifikant forskel i H-score på MUC1-farvning fra grad 1 (0,51 ± 0,1) til klasse 2 tumorer (1,62 ± 0,155). Yderligere H-score for MUC1 farvning øget fra klasse 3 til klasse 4 tumorer.

MUC1 udtryk i pladecellecarcinom (SCC), adenocarcinom og mucinøs adenocarcinom i blæren.

Moderat intens farvning blev observeret i SCC (N = 33, 65% af tilfældene) med middelværdien H-score 2,33 ± 0,16 (fig. 2A), medens andre udviste kun mild positivitet for MUC1 (N = 18 eller 35%, betyder H -Score 0,66 ± 0,11, betyder intensitet 1,3 ± 0,11). Moderat farvning for MUC1 blev observeret i keratin perler, som er karakteristisk træk ved grad 1 pladecellecarcinom (fig. 2B, vist med pilen). Der var ingen signifikant forskel i farvningsintensitet mellem grad 2 (N = 6, betyder H-score 2 ± 0,3) og grad 3 SCC (N = 12, betyder H-score 3,0 ± 0,7). Af de 12 adenocarcinomer pletter, som blev undersøgt, 7 viste svag farvning af MUC1 (Fig. 2C), mens det i andre udtryk var helt fraværende. Flertal af væv pletter fra mucinøs adenocarcinom var mildt positive for MUC1 (gennemsnitlig H-score, 0,62 ± 0,14) (fig. 2D).

MUC4 Expression Analyser under Kræft i blære

MUC4 udtryk i den ikke-neoplastiske blære urothelium.

Ved analyse i normale væv (N = 14), høj ekspression af MUC4 blev observeret i urothelium af den ikke-neoplastiske blære (fig. 3A, betyder intensitet 2,54 ± 0,21 og betyde H-score 2,54 ± 0,21) (tabel 3). Ekspressionen af ​​MUC4 (i den normale blære urothelium) blev observeret både i membranen og cytoplasma epithelceller med stærkere ekspression på cellemembraner end cytoplasma. Men i modsætning til MUC1, farvningen for MUC4 var ensartet gennem alle lagene af urothelium (fig. 3A). Interessant nok blev en stærk ekspression af MUC4 observeret selv i sammentrækningsorgan aggregater af urothelial celler kendt som “von Brunn reder” (fig. 3B, vist med pilen).

blæretumor vævssnit og væv microarray blev probet med anti -MUC4 mAb (8G7) efter ikke-specifik blokering med hesteserum. Alle snit blev undersøgt under mikroskop og immunoreaktiviteten blev evalueret ved rødbrun farvning. Repræsentative mikrofotografier er vist for MUC4 farves normal ikke-neoplastisk urothelium (A), von Brunn reder (B), ikke-invasiv papillær urothelial carcinoma (C), urotelial carcinoma in situ (D), lav (E) og høj kvalitet urothelial carcinoma (F). Stærk positivitet af MUC4 blev observeret i forskellige lag blære urothelium (A). Forstørret billede viser, at fordelingen af ​​MUC4 er både membranøs og cytoplasmatisk. Celler i von Brunn s reden celler viste stærk membranøs farvning af MUC4 (B). Tab af MUC4 ekspression blev observeret under ikke-invasiv papillær carcinom (C), og carcinom in situ (D). Både lav og høj kvalitet urothelial karcinom viste tab af MUC4 udtryk (E F)

MUC4 udtryk i ikke-invasiv og invasiv papillær urothelial karcinom og urotelial Carcinoma in situ (CIS)..

Selvom begrænsede tilfælde (N = 6) af ikke-invasiv papillær carcinom var til stede i væv pletter, de fleste af dem var helt negativ (N = 4, intensitet-score 0), mens andre har delvis positivitet (N = 2, middelintensitet-score 2,5). Invasiv papillær carcinom (N = 2) viste fuldstændig tab af MUC4 ekspression (Intensitet-score = 0). Endvidere blev fuldstændig tab af MUC4 ekspression observeret i både ikke-invasiv (. Figur 3C) og invasive tilfælde af papillær carcinom (N = 10, middelværdi intensitet 0,8 ± 0,41; middelværdi H-score 0,31 ± 0,39). MUC4 ekspression blev signifikant nedreguleret i CIS fra TMA (N = 4, betyder H-score 0, tabel 3) såvel som i tilfælde af vævssnit (N = 10; middelintensitet 0,3 ± 0,1; p = 0,02 og betyder H-score 0,12 ± 0,06) sammenlignet med den ikke-neoplastiske urothelium (fig. 3D). Samlet, tab af MUC4 ekspression blev observeret i løbet af invasive og non-invasive papillær carcinom.

MUC4 udtryk i invasive urothelial karcinom og metastase.

I de fleste af tilfældene blev der observeret omdrejningspunkt udtryk for MUC4 i urothelial karcinom (N = 122 eller 58%, betyder H-score, betyde intensitet 0), mens andre tilfælde viste mild positivitet (N = 89 eller 42% tilfælde, betyder H-score 0,68 ± 0,14, betyder intensitet 0,91 ± 0,19). Samlet set blev tabet af MUC4 udtryk observeret i både lav og høj kvalitet invasive urothelial karcinom (fig. 3E og 3F). MUC4 ekspression var betydeligt nedreguleret i carcinomceller sammenlignet med den ikke-neoplastiske urothelium (gennemsnitlig H-score i ikke neoplastiske blære urothelium og UC er 2,54 ± 0,21 [P 0,0001], og 0,47 ± 0,05 hhv) (data fra TMA). Interessant i forhold til urotelial karcinom, der mangler ekspression af MUC4, højere procentdel af metastatiske tilfælde viste sig at være positiv for MUC4. Blandt alle (N = 28) metastatiske tilfælde, 57% tilfælde (N = 16) viste svag til mild MUC4 farvning (middelværdi H-score 1,27 ± 0,27) (fig. 4D-F), mens der blev observeret ingen til fokal udtryk i 43% af tilfældene (n = 12; middelintensitet = 0 og betyder H-score 0,025 ± 0,02). Både cytoplasmatisk og membran farvning af MUC4 blev observeret i forskellige metastatiske tilfælde (4D-F).

Repræsentative fotomikrografier vist for MUC4 farvning i pladecellecarcinom (A), adenocarcinom (B), mucinøs adenocarcinom (C) og metastatisk urothelial carcinoma lymfeknude (D . B). Immunoblotting undersøgelser under anvendelse anti-MUC1 antistof (HMFG2) og anti-MUC4 antistof (8G7) indikerede differentiel ekspression af MUC1 og MUC4 i TCCSUP, HT1376 og scaber cellelinjer (fig. 5C). Ingen ekspression af MUC1 og MUC4 blev observeret i T24 blære carcinom cellelinie. Endvidere blev der observeret forskellige glycoformer af MUC4 i pladecellecarcinom cellelinje sammenlignet med TCC cellelinier.

Kvantitativ RT-PCR-analyser af MUC1 (A) og MUC4 (B) viste, at alle blærecarcinom-cellelinje undtagen T24 udtrykker MUC1 og MUC4. Højeste udtryk for både MUC1 og MUC4 blev observeret i tumorcellelinje HT1376. Til ekspression analyser af mucin MUC1 og MUC4 på proteinniveau blev proteinlysater fra alle blærecarcinom cellelinier opløst på 2% agarosegel og probet med anti-MUC1 (HMFG2) og anti-MUC4 (8G7) antistoffer (felt C) . β-actin opløst på 10% SDS-PAGE blev anvendt som en loading kontrol (panel C). Ingen ekspression af enhver mucin MUC1 og MUC4 blev observeret i T24 mens andre cellelinjer udtrykte både muciner. (D) Tabular repræsentationer af MUC1 og MUC4 ekspression under blærecarcinom progression. Væsentlige ændringer i ekspression af både MUC1 og MUC4 blev observeret under progression af urothelial carcinoma. Progressiv stigning i MUC1 ekspression blev observeret gennem forskellige stadier og kvaliteter af blærekræft mens ekspressionen af ​​MUC4 faldt med sygdomsprogression. I en undergruppe af metastatiske tilfælde af urothelial karcinom, blev opdaget udtryk for MUC4.

Samlet set mucin MUC1 og MUC4 analyser i blærekræft TMA og vævssnit indikerede, at ekspressionen af ​​MUC1 øges, mens det af MUC4 faldt i UC sammenlignet med den normale ikke-neoplastisk urothelium. Ekspression af både MUC1 og MUC4, er imidlertid signifikant højere i urothelial carcinoma metastatiske tilfælde sammenlignet med lokaliseret UC (fig. 5D).

Discussion

afvigende ekspression, lokalisering og glycosylering af muciner er karakteristiske begivenheder af flere maligniteter (pankreas-, ovarie-, prostata- og gastriske, lunge, og bryst). Blandt forskellige familiemedlemmer, er MUC1 og MUC4 indgår i tumorvækst, intracellulære og ekstracellulære signalering, tumor-stromale interaktioner, metastase, og resistens over for kemoterapeutiske midler og i immunitet [10], [12]. Omfattende information om ekspression af disse muciner mangler i urothelial carcinoma. Den foreliggende undersøgelse undersøgte ekspressionen af ​​TM muciner MUC1 og MUC4 i blærevæv microarray, vævssektioner og blærecarcinom cellelinier. Mens der sås afvigende ændringer i ekspression og lokalisering mønster af MUC1 mellem benigne og maligne tilfælde blev signifikant nedregulering af MUC4 observeret under urothelial carcinoma forhold til normal og /eller benigne blærevæv.

MUC1 er et membranbundet

O

glycoprotein, der kommer til udtryk på det basale niveau i de fleste epitelceller [21]. Dereguleret ekspression af MUC1 er en fremtrædende egenskab af forskellige typer af kræft og inflammatoriske sygdomme.